核酸適體及其衍生物的用途及對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種核酸適體及其衍生物的用途及對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法，其用途是在組織冰凍切片中檢測(cè)特異性生物標(biāo)志物。其方法是將組織冰凍切片用隨機(jī)序列封閉非特異性結(jié)合，再用信號(hào)標(biāo)記的核酸適體或者核酸適體衍生物進(jìn)行孵育，觀(guān)察組織冰凍切片的成像結(jié)果，根據(jù)信號(hào)在組織冰凍切片中的定位來(lái)判斷病灶位置。本發(fā)明為疾病的診斷提供了一種新的有效的分子工具，其方法快速、便捷、廉價(jià)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】核酸適體及其衍生物的用途及對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病理診斷方法，具體涉及一種核酸適體及其衍生物的用途及對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法。

【背景技術(shù)】
[0002]疾病發(fā)生后組織細(xì)胞常常出現(xiàn)一系列的病理形態(tài)改變，表達(dá)出一些特異性生物標(biāo)志物，通過(guò)鑒定組織病理形態(tài)學(xué)的改變可以對(duì)疾病進(jìn)行診斷。細(xì)胞特異性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)有助于疾病的進(jìn)一步確診、指導(dǎo)治療和預(yù)后的判斷。臨床病理形態(tài)學(xué)工作中最常用的為冰凍切片和石蠟切片。相較石蠟切片而言，冰凍切片制作步驟簡(jiǎn)單，更接近新鮮組織，最大限度的保存蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)甚至功能，無(wú)需抗原復(fù)性。但目前臨床上冰凍切片僅用于顯微鏡下快速病理形態(tài)學(xué)診斷。
[0003]指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolut1n of Ligands byExponential Enrichment, SELEX)是近年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的篩選技術(shù)，通過(guò)該技術(shù)可篩選到與靶標(biāo)特異結(jié)合的小分子DNA/RNA物質(zhì)稱(chēng)為核酸適體。由于其與抗體相比與靶標(biāo)結(jié)合的特異性和親和力相當(dāng)甚至更強(qiáng)，并有可體外篩選、易于合成與標(biāo)記、化學(xué)穩(wěn)定性好、無(wú)免疫原性與生物毒性、靶分子范圍廣、分子量小、組織滲透力強(qiáng)、易于固定及化學(xué)修飾等優(yōu)勢(shì)，核酸適體作為一種新型分子探針用于疾病的診斷和治療而備受關(guān)注。
[0004]以腫瘤性疾病為例，上皮細(xì)胞粘附分子(Epithelial cell adhes1n molecule,EpCAM)，在上皮來(lái)源的惡性腫瘤組織中表達(dá)增高，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，因此，EpCAM可作為生物標(biāo)記物在多種上皮來(lái)源惡性腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮作用。EpCAM的抗原表位包括胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(intracellular domain of epithelial cell adhes1nmolecule, EpICD)及胞夕卜結(jié)構(gòu)域(extracellular domain of epithelial cell adhes1nmolecule，EpEX)。目前臨床上僅能通過(guò)EpCAM抗體對(duì)組織石蠟切片的免疫染色來(lái)定位EpCAM的組織分布，從而達(dá)到診斷和靶向治療的目的。但抗體的生產(chǎn)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，運(yùn)輸及儲(chǔ)存不便，因此價(jià)格昂貴，并且需要分別針對(duì)其胞內(nèi)和胞外的不同抗原表位選擇ant1-EpI⑶和ant1-ΕρΕΧ兩種抗體。同時(shí)，臨床常用的抗體-石錯(cuò)切片的免疫染色步驟繁瑣。2011年，Wei Duan研宄組篩選了 EpCAM的RNA類(lèi)型核酸適體\但是RNA很容易被核酸酶降解，限制了它在臨床研宄的應(yīng)用。隨后，James Yang研宄組使用SELEX技術(shù)成功篩選了一組EpCAM DNA類(lèi)型的特異性核酸適體，其中一條最優(yōu)化者命名為SYL3C 2。
[0005]再以肥胖為例，肥胖是現(xiàn)代社會(huì)亟待解決的流行病之一，與多種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病，如2型糖尿病、心腦血管疾病以及癌癥等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。肥胖是由于白色脂肪組織在體內(nèi)過(guò)度聚集所致，近年來(lái)針對(duì)作用于脂肪組織的藥物開(kāi)發(fā)防止肥胖的策略備受關(guān)注。2012年劉慧霞教授團(tuán)隊(duì)篩選得到針對(duì)白色脂肪組織成熟脂肪細(xì)胞的特異性核酸適體 Adipo-83。
[0006]目前特異性生物標(biāo)志物的檢測(cè)主要依賴(lài)抗體對(duì)組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。目前還沒(méi)有關(guān)于核酸適體及其衍生物用于組織冰凍切片特異性生物標(biāo)志物的檢測(cè)從而達(dá)到組織成像目的的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)、有利于疾病快速診斷的核酸適體及其衍生物的用途及對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
核酸適體及其衍生物的用途，是在組織冰凍切片中用于檢測(cè)特異性生物標(biāo)志物。
[0009]核酸適體及其衍生物對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法，是將組織冰凍切片用隨機(jī)序列封閉非特異性結(jié)合，再用信號(hào)標(biāo)記的核酸適體或者核酸適體衍生物進(jìn)行孵育，觀(guān)察組織冰凍切片的成像結(jié)果，根據(jù)信號(hào)在組織冰凍切片中的定位來(lái)判斷病灶位置。
[0010]所述核酸適體衍生物是指將核酸適體進(jìn)行修飾或者改造后的核酸適體，例如攜帶增強(qiáng)拉曼信號(hào)的表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)粒子，或者攜帶一種或多種不同的信號(hào)分子(例如同位素或者熒光信號(hào))。
[0011]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明首次使用核酸適體及其衍生物來(lái)檢測(cè)組織冰凍切片中的特異性生物標(biāo)志物，從而達(dá)到快速診斷疾病的目的，發(fā)現(xiàn)了核酸適體的新用途及為疾病的診斷提供了一種新的有效的分子工具。其方法快速、便捷、廉價(jià)。
[0012]2、本發(fā)明利用核酸適體及其衍生物所攜帶的信號(hào)在組織冰凍切片中形成的圖像，根據(jù)信號(hào)在圖像中的有無(wú)及強(qiáng)弱判斷組織中核酸適體及其衍生物的表達(dá)水平，達(dá)到對(duì)腫瘤診斷、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的快速判斷。相對(duì)于石蠟切片，冰凍切片制作步驟簡(jiǎn)單、快捷，更接近活體組織，最大限度的保存細(xì)胞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)甚至功能，無(wú)需抗原復(fù)性。而且，制作簡(jiǎn)單廉價(jià)，快速便捷，耗時(shí)少。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是攜帶熒光信號(hào)的核酸適體針對(duì)組織冰凍切片免疫染色流程圖。
[0014]圖2是攜帶熒光信號(hào)的核酸適體針對(duì)組織石蠟切片免疫染色流程圖。
[0015]圖3是攜帶熒光信號(hào)的抗體針對(duì)組織石蠟切片免疫染色流程圖。
[0016]圖4是攜帶CY3的EpCAM核酸適體與結(jié)腸癌與直腸癌變組織冰凍切片的免疫染色成像，并與EpCAM抗體與石蠟切片孵育后成像結(jié)果的對(duì)比圖。
[0017]圖5是將圖4中結(jié)腸癌和直腸癌成像放大400倍，并借助細(xì)胞核染料DAPI定位細(xì)胞核的對(duì)比圖。
[0018]圖6是攜帶CY3的EpCAM核酸適體對(duì)結(jié)腸癌系列冰凍切片的系列免疫染色圖(A)和EpCAM核酸適體對(duì)結(jié)腸癌交界組織冰凍切片免疫染色的放大圖(B)。
[0019]圖7是攜帶CY3的EpCAM核酸適體對(duì)直腸癌系列冰凍切片的系列免疫染色圖。
[0020]圖8是攜帶CY3的EpCAM核酸適體對(duì)EpCAM表達(dá)陰性的惡性腫瘤及良性病變的免疫染色成像圖。
[0021]圖9是CY3熒光染料的拉曼圖譜。
[0022]圖10是EpCAM核酸適體與結(jié)腸癌變組織冰凍切片的拉曼成像圖。
[0023]圖11是EpCAM核酸適體與直腸癌變組織冰凍切片的拉曼成像圖。
[0024]圖12是核酸適體Adipo-8在大鼠不同組織來(lái)源的冰凍切片中的成像圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)所得。
[0026]實(shí)施例中，熒光標(biāo)記的EpCAM核酸適體是按以下序列合成:5’ -CAC TAC AGA GGTTGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG-(PEG)3-Cy3_3’。合成隨機(jī)序列(5，_rN(n=48)-3’ )用來(lái)阻斷非特異性組織染色。熒光標(biāo)記的成熟脂肪細(xì)胞核酸適體Adipo-8是按以下序列合成:5’-ATG AGA AGC GTC GGT GTG GTT AAA CAC GGA ACG AAG GTG CAG GAAGAT TTG TCG ATG CGG TGC CTG AGC GGG CTG GCA AGG CGC ATA-Cy3_3’。對(duì)應(yīng)的隨機(jī)序列(5’-rN (n=87)-3’)用來(lái)阻斷非特異性組織染色。以上試劑皆來(lái)源于生工生物工程(上海)股份有限公司。DAPI用來(lái)染色細(xì)胞核(碧云天生物技術(shù)研宄所)。Ant1-EpEX、ant1-EpI⑶及二抗均來(lái)自abeam (德國(guó))公司。SERS粒子由廈門(mén)大學(xué)化學(xué)系楊朝勇老師實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)(粒徑分布:52± 10nm，殼層厚度:〈2nm，吸收峰位置539.5± 1.5nm增強(qiáng)性能:檢測(cè)限可達(dá)ppd量級(jí))。
[0027]實(shí)施例1、EpCAM核酸適體在結(jié)腸癌及直腸癌變組織冰凍切片的成像應(yīng)用
本發(fā)明提供的核酸適體及其衍生物對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法，包括以下步驟:
1、腫瘤標(biāo)本的收集:
手術(shù)室進(jìn)行標(biāo)本取樣，分別在同一患者的癌組織腫塊處、癌組織腫塊與正常組織交界處及正常組織處取樣，分別標(biāo)記為:癌變組織、交界組織、正常組織，然后立即進(jìn)行冰凍切片的制作，用于CY3標(biāo)記的SYL3C染色以及蘇木精一伊紅染色法(hematoxylin-eosin，HE)切片的制作。所有標(biāo)本均來(lái)源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院；
2、組織冰凍切片的制作:
所取組織的規(guī)格為:長(zhǎng)X寬X厚=24X24X2mm左右，將組織標(biāo)本用組織支承器放平擺好，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上冰凍，將冷凍好的組織塊夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵、轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平，調(diào)整切片厚度為5微米，將切出的冰凍切片粘附在防脫玻片上，每例患者的癌變組織、交界組織、正常組織分別連續(xù)切片制作2張組織冰凍切片，分別用于進(jìn)行后續(xù)的HE染色和核酸適體對(duì)組織EpCAM檢測(cè)的熒光成像；
3、組織石蠟切片制作:
參見(jiàn)常規(guī)流程，具體步驟包括固定(時(shí)間為隔夜)，洗滌和脫水(6小時(shí))，透明(1小時(shí)20分鐘)，浸蠟和包埋(4小時(shí))，切塊，貼片與烤片；
4、核酸適體針對(duì)組織冰凍切片的孵育及HE染色:
(1)、用隨機(jī)序列封閉非特異性結(jié)合，將組織冰凍切片滴加濃度為1ymol/L的隨機(jī)序列200微升，4°C或者室溫環(huán)境下在水平搖床孵育10分鐘；
(2)、用帶熒光信號(hào)CY3的特異性EpCAM核酸適體SYL3C進(jìn)行孵育，每一塊組織冰凍切片滴加濃度為250nmol/L的EpCAM核酸適體SYL3C 150微升，4°C或者室溫環(huán)境下在水平搖床孵育15分鐘； (3)、用細(xì)胞核染色劑DAPI進(jìn)行孵育，每一塊組織冰凍切片滴加濃度為1μ g/ml的DAPI染色劑30微升，4°C或者室溫環(huán)境下在水平搖床孵育3分鐘；
(4)、將組織冰凍切片置于50ml離心管中，倒入40mlD-PBS進(jìn)行洗滌，4°C或者室溫環(huán)境下在水平搖床洗滌3次，每次5分鐘；
(5)、與此同時(shí)，為了驗(yàn)證核酸適體對(duì)組織切片成像的特異性，將制作組織冰凍切片時(shí)來(lái)源于同一樣本的另外一張相應(yīng)組織冰凍切片進(jìn)行HE染色作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照；
(6)、若進(jìn)行拉曼成像，則將SERS粒子均勻噴灑在上述切片表面；
(7)、若將核酸適體所攜帶的信號(hào)分子更換為放射性同位素，則可同理進(jìn)行放射性成像；
5、核酸適體針對(duì)組織石蠟切片的孵育:
(1)脫蠟:將石蠟切片浸入二甲苯中3次，每次lOmin;
(2)水化:已脫蠟的切片依次浸入無(wú)水乙醇、95%乙醇和70%乙醇中，每次浸沒(méi)lOmin；
(3)抗原復(fù)性:水化的切片用TEBuffer (pH8.0)洗滌后，于沸騰TE Buffer中放置15min ；
(4)所述用隨機(jī)DNA序列封閉非特異性結(jié)合:在切片的組織上滴加濃度為1ymol/L的隨機(jī)序列200微升，低溫(4攝氏度)環(huán)境下在水平搖床孵育30min ;
(5)所述用帶熒光信號(hào)的SYL3C進(jìn)行孵育:切片的相應(yīng)組織滴加濃度為250nmol/L的核酸適體150微升，室溫環(huán)境下在水平搖床孵育60min ;
(6)洗滌非特異性結(jié)合:將切片置于50ml離心管中，倒入40mlD-PBS進(jìn)行洗滌，低溫(4攝氏度)環(huán)境下在水平搖床洗滌3次，每次15分鐘。熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果；
同時(shí)取來(lái)源于同一個(gè)腫瘤組織的石蠟切片用商品化的抗體(包括針對(duì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域抗體EpICD,與針對(duì)胞外結(jié)構(gòu)域抗體EpEX)與石蠟切片孵育，方法參照經(jīng)典免疫熒光法。成像結(jié)果與SYL3C所得成像結(jié)果進(jìn)行對(duì)比；
6、結(jié)果觀(guān)察:
將EpCAM核酸適體孵育的組織冰凍切片及石蠟切片使用正置熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果，并與經(jīng)典的抗體免疫熒光方法染色的冰凍切片進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)免疫熒光染色判斷病變位置，同時(shí)比照光鏡下HE染色切片的病變定位，同理，將EpCAM核酸適體孵育的組織冰凍切片噴灑SERS粒子后使用拉曼顯微鏡觀(guān)察結(jié)果，根據(jù)拉曼信號(hào)判斷病變位置。
[0028]實(shí)施例2、核酸適體Adipo8在大鼠脂肪組織冰凍切片特異性成像的應(yīng)用
本發(fā)明提供的核酸適體及其衍生物對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法，包括以下步驟:
1、組織標(biāo)本的收集:
動(dòng)物標(biāo)本均取自同一大鼠。分別取附睪脂肪組織、肝臟、骨骼肌組織，然后立即進(jìn)行冰凍切片的制作，用于CY3熒光標(biāo)記的Adipo-8染色以及HE染色切片的制作；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；
2、冰凍切片的制作:同實(shí)施例1所述；
3、核酸適體針對(duì)組織冰凍切片的孵育及HE染色:
(1)、用隨機(jī)序列封閉非特異性結(jié)合，將組織冰凍切片上的組織滴加濃度為1ymol/L的隨機(jī)序列200微升，4°C或者室溫環(huán)境下在水平搖床孵育10分鐘；
(2)、用帶熒光信號(hào)的特異性核酸適體進(jìn)行孵育，每一塊組織冰凍切片的組織滴加濃度為250nmol/L的核酸適體Adipo_8 150微升，4°C或者室溫環(huán)境下在水平搖床孵育15分鐘；
(3)、將組織冰凍切片置于50ml離心管中，倒入40mlD-PBS進(jìn)行洗滌，4°C或者室溫環(huán)境下在水平搖床洗滌3次，每次5分鐘；
(4)、與此同時(shí)，為了驗(yàn)證核酸適體對(duì)組織切片成像的特異性，將制作組織冰凍切片時(shí)來(lái)源于同一組織的另外一張相應(yīng)組織冰凍切片進(jìn)行HE染色，作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，以用作后續(xù)觀(guān)察結(jié)果時(shí)進(jìn)行對(duì)比；
4、結(jié)果觀(guān)察:
將成熟脂肪細(xì)胞核酸適體Adipo-8孵育的組織冰凍切片使用正置熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果，根據(jù)免疫熒光染色定位成熟脂肪細(xì)胞；同時(shí)與光鏡下HE染色的組織冰凍切片作對(duì)比。
[0029]上述實(shí)施例中，腫瘤標(biāo)本的收集、組織冰凍切片和組織石蠟切片的制作、組織冰凍切片的孵育及HE染色、組織石蠟切片的孵育均為本領(lǐng)域的常規(guī)操作，操作中涉及的各項(xiàng)技術(shù)要求如切片的大小、各操作的時(shí)間和溫度、使用的材料、材料的用量等均可根據(jù)操作規(guī)范確定，它們均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
[0030]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例1:
1、結(jié)直腸癌組織冰凍切片用EpCAM核酸適體SYL3C進(jìn)行特異性免疫染色成像結(jié)果與SYL3C針對(duì)石蠟切片進(jìn)行特異性免疫染色及商品化EpCAM抗體免疫染色成像結(jié)果對(duì)比。
[0031]分別將來(lái)自于同一結(jié)腸癌、直腸癌患者的正常組織、癌變組織以及正常組織與癌變組織交界的交界組織制作成系列的組織冰凍切片及石蠟切片。
[0032]冰凍及石蠟切片制作及HE染色參照前述方法:
圖1是EpCAM核酸適體針對(duì)冰凍組織切片免疫染色流程圖，圖中顯示使用熒光信號(hào)CY3標(biāo)記的SYL3C在室溫下孵育組織冰凍切片15min后即可置于熒光顯微鏡下觀(guān)察成像結(jié)果。為了對(duì)比SYL3C與已經(jīng)商品化并應(yīng)用于臨床的EpCAM抗體，分別用SYL3C及EpCAM抗體(ant1-EpEX、ant1-EpI⑶)孵育石蠟切片，并對(duì)比成像效果。石蠟切片在孵育前首先要置于100°C下進(jìn)行抗原復(fù)性24h，然后使用SYL3C-CY3在室溫下孵育lh，即可置于熒光顯微鏡下觀(guān)察(參見(jiàn)圖2)。使用EpCAM抗體(ant1-EpEX或者anti_EpI⑶)孵育石蠟切片時(shí)，除需要抗原復(fù)性24h外，首先需要在37°C下分別使用ant1-EpEX或者anti_EpICD的一抗孵育lh對(duì)EpCAM進(jìn)行定位，再通過(guò)CY3標(biāo)記的相應(yīng)的二抗進(jìn)行30min的二次孵育顯色，方可在熒光顯微鏡下觀(guān)察(參見(jiàn)圖3)。雖然EpCAM核酸適體與冰凍切片及石蠟切片均能清晰成像，但在冰凍切片的成像步驟更為便捷省時(shí)；同時(shí)與抗體石蠟切片的經(jīng)典方法比較，核酸適體可一次性成像顯示EpCAM的胞內(nèi)及胞外部分，而使用抗體則需要分別使用針對(duì)EpEX或EpICD的一抗，還需相應(yīng)的二抗進(jìn)行顯色。
[0033]圖4為EpCAM核酸適體與結(jié)腸癌與直腸癌組織冰凍切片的免疫染色成像(放大200倍)，并與EpCAM抗體與石蠟切片孵育后成像結(jié)果進(jìn)行對(duì)比:a)病例1、2均通過(guò)HE染色病理確認(rèn)診斷；b)組織冰凍切片使用EpCAM核酸適體染色成像；c)組織石蠟切片使用EpCAM核酸適體染色成像；d)組織石錯(cuò)切片使用ant1-EpEX染色成像；e)組織石錯(cuò)切片使用ant1-EpICD染色成像；
以HE染色片作為形態(tài)辨認(rèn)(參見(jiàn)圖4a)。在組織冰凍切片及石蠟切片上的成像均顯示，核酸適體SYL3C能特異性識(shí)別癌巢，而在正常結(jié)腸信號(hào)弱(圖4b和c)。同樣的，ant1-EpEX和ant1-EpI⑶可特異性識(shí)別癌巢，在正常結(jié)腸顯示弱信號(hào)(參見(jiàn)圖4d和e)。
[0034]圖5系將圖4結(jié)腸癌和直腸癌成像放大400倍，圖5a為病例HE染色切片；圖5b借助細(xì)胞核染料DAPI定位細(xì)胞核，可看到核酸適體SYL3C同時(shí)結(jié)合胞內(nèi)和胞膜的EpCAM (參見(jiàn)圖5c)，而ant1-EpEx只結(jié)合胞膜上EpCAM (參見(jiàn)圖5d)，anti_EpI⑶只結(jié)合在胞膜內(nèi)的胞漿及胞核的EpCAM (參見(jiàn)圖5e)，說(shuō)明用核酸適體SYL3C可一次性識(shí)別EpCAM胞內(nèi)及胞外結(jié)構(gòu)域。而使用EpCAM抗體成像則需要分別使用ant1-EpI⑶和ant1-EpEx對(duì)胞膜內(nèi)、外的EpCAM各自定位，并需要使用二抗進(jìn)一步孵育顯色。
[0035]2、結(jié)直腸癌組織冰凍切片用EpCAM核酸適體SYL3C進(jìn)行特異性免疫染色。
[0036]圖6 (A)為EpCAM核酸適體對(duì)同一患者結(jié)腸癌系列組織冰凍切片的系列免疫染色(放大200倍)；(B)為EpCAM核酸適體對(duì)結(jié)腸癌交界組織冰凍切片免疫染色的放大圖(放大400倍)。來(lái)源于同一病人結(jié)腸的正常組織、癌變組織以及正常組織與癌變組織交界的交界組織被制作成系列組織冰凍切片，用EpCAM核酸適體SYL3C進(jìn)行孵育及熒光成像，發(fā)現(xiàn)EpCAM在結(jié)腸的正常組織中弱表達(dá)，在交界組織與癌變組織中依次表達(dá)增強(qiáng)(參見(jiàn)圖6A)。尤其在交界組織中主要表達(dá)在胞膜上及胞質(zhì)中，基本不表達(dá)于胞核(參見(jiàn)圖6A的第二行及圖6B白色箭頭標(biāo)注)。而在癌變組織中基本表達(dá)在胞核中(參見(jiàn)圖6A第三行第二列)。
[0037]同樣，來(lái)源于同一病人直腸的正常組織、癌變組織和正常組織與癌變組織交界的交界組織被制作成系列組織冰凍切片，用EpCAM核酸適體SYL3C進(jìn)行孵育及熒光成像。EpCAM aptamer熒光信號(hào)在正常組織中信號(hào)弱(參見(jiàn)圖7第一行第二列)。交界部位切片右側(cè)為直腸的正常組織，左側(cè)為癌變組織。我們可以看到左側(cè)癌巢有強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，而右側(cè)正常組織信號(hào)微弱(參見(jiàn)圖7的第二行)，形成了鮮明的對(duì)比。
[0038]3、EpCAM核酸適體與不表達(dá)EpCAM的組織無(wú)交叉反應(yīng)。
[0039]應(yīng)用核酸適體SYL3C對(duì)結(jié)腸炎及結(jié)腸息肉的組織冰凍切片進(jìn)行成像，兩者均無(wú)特異性熒光信號(hào)(參見(jiàn)圖8第一行以及第二行)。最后，收集若干例EpCAM表達(dá)陰性的腫瘤(垂體瘤\腦膜瘤\腎透明細(xì)胞癌)，將核酸適體SYL3C與它們的組織冰凍切片孵育后均顯示無(wú)熒光信號(hào)(參見(jiàn)圖8第三行、第四行、第五行)。所得成像僅見(jiàn)微弱的背景信號(hào)。
[0040]4、將熒光信號(hào)變更為拉曼信號(hào)輸出，同樣能進(jìn)行成像，從而對(duì)病灶進(jìn)行定位。
[0041]由于熒光分子CY3自帶特征性拉曼信號(hào)(參見(jiàn)圖9)，可以將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為拉曼信號(hào)進(jìn)行成像觀(guān)察。應(yīng)用熒光標(biāo)記的核酸適體SYL3C-CY3對(duì)結(jié)腸癌及直腸癌切片進(jìn)行孵育，后表面噴灑SERS粒子，然后置于拉曼顯微鏡下觀(guān)察，可以通過(guò)捕捉拉曼信號(hào)的輸出對(duì)組織進(jìn)行成像，從而通過(guò)拉曼信號(hào)對(duì)癌巢進(jìn)行定位(參見(jiàn)圖10以及圖11)。
[0042]結(jié)果表明:
1、核酸適體SYL3C與結(jié)直腸癌的冰凍和石蠟切片均有特異性結(jié)合，可以區(qū)別正常組織及癌變組織，且本發(fā)明方法具有以下優(yōu)勢(shì):1)石蠟切片制作費(fèi)時(shí)，步驟繁瑣，進(jìn)行孵育之前需要在100°C條件下進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的抗原復(fù)性，相對(duì)而言，組織冰凍切片更接近新鮮組織，且制作方法比石蠟切片更加簡(jiǎn)便、快捷；2)核酸適體SYL3C針對(duì)冰凍切片的孵育方法步驟更簡(jiǎn)單，耗時(shí)短。
[0043]2、試驗(yàn)以商品化的EpCAM抗體及免疫熒光方法作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，盡管核酸適體SYL3C對(duì)癌變組織的成像效果與商品化EpCAM抗體相當(dāng)，但是，核酸適體SYL3C可一次性EpCAM的胞外及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行成像，而抗體成像方法則需要針對(duì)EpEX和EpICD的兩種抗體分別成像，并且需要二抗顯色。加之核酸適體具有費(fèi)用低廉、且易于儲(chǔ)存、與組織切片反應(yīng)時(shí)間更短且方法簡(jiǎn)單等優(yōu)于抗體的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使得EpCAM特異性核酸適體有望代替抗體。
[0044]3、將所述核酸適體進(jìn)行修飾或者改造，得到相應(yīng)核酸適體衍生物，所述核酸適體衍生物可為:攜帶其他信號(hào)的顆粒，例如攜帶拉曼信號(hào)的SERS粒子，可將孵育后的組織冰凍切片進(jìn)行拉曼成像；或者同時(shí)攜帶多種不同信號(hào)分子，可同時(shí)通過(guò)不同方式進(jìn)行成像分析；以上均能達(dá)到快速、便捷、廉價(jià)的檢測(cè)組織中特定生物標(biāo)志物，并且準(zhǔn)確定位，從而達(dá)到快速診斷疾病的目的。
[0045]4、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，因?yàn)镋pCAM廣泛表達(dá)于上皮來(lái)源的惡性腫瘤，應(yīng)用核酸適體SYL3C孵育非上皮來(lái)源腫瘤后顯示無(wú)熒光信號(hào)，因此可以認(rèn)為SYL3C對(duì)于鑒別上皮來(lái)源及非上皮來(lái)源的惡性腫瘤有一定意義。
[0046]5,EpCAM還是抗腫瘤治療的靶點(diǎn)。2009年，一種抗EpCAM的三功能抗體，卡妥索單抗(Catumaxomab)被獲準(zhǔn)治療Epcam陽(yáng)性腫瘤患者的惡性腹水。近期，許多用于診斷和治療的基于EpCAM的抗體已誕生。但是，由于抗體的分子量大及不穩(wěn)定性，導(dǎo)致在最初的臨床試驗(yàn)中無(wú)法提供一個(gè)客觀(guān)的臨床響應(yīng)，并限制了它在癌癥檢測(cè)的靈敏度。鑒于SYL3C可高親和力特異性識(shí)別癌變組織中的EpCAM，因此未來(lái)有望利用SYL3C對(duì)上皮來(lái)源的腫瘤性疾病進(jìn)行的靶向治療。
[0047]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例2:
動(dòng)物標(biāo)本均取自同一只大鼠。分別取附睪脂肪組織、肝臟、骨骼肌組織，然后立即進(jìn)行組織冰凍切片的制作，用于熒光標(biāo)記的Adipo-8染色以及HE染色切片的制作；圖12是攜帶CY3的核酸適體Adipo-8在大鼠不同組織來(lái)源的組織冰凍切片中的成像圖，應(yīng)用熒光標(biāo)記的核酸適體Adipo-8對(duì)組織冰凍切片進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn):僅在脂肪組織冰凍切片中見(jiàn)到圍繞細(xì)胞膜排列的特異性熒光信號(hào)，而骨骼肌及肝臟組織中僅見(jiàn)微弱的非特異性熒光信號(hào)。
[0048]結(jié)果表明:
1、Adipo-8能特異性識(shí)別脂肪組織冰凍切片，而與其他來(lái)源的組織細(xì)胞無(wú)交叉反應(yīng)。
[0049]2、近年來(lái)針對(duì)作用于脂肪組織的藥物開(kāi)發(fā)防治肥胖及相關(guān)疾病的策略備受關(guān)注。但現(xiàn)有的針對(duì)脂肪組織的小分子藥物缺乏特異性，毒副作用大，目前對(duì)脂肪細(xì)胞表面生物標(biāo)記物及理化特征認(rèn)知亦有限。因此，Adipo-8這種新型的脂肪細(xì)胞表面探針的發(fā)現(xiàn)為肥胖及其相關(guān)疾病的診斷及治療提供了新的分子工具。
[0050]綜上實(shí)例所述:本發(fā)明為核酸適體及其衍生物對(duì)組織冰凍切片的成像，為相關(guān)疾病的快速診斷及治療提供了一種新的思路及方法。
[0051]參考文獻(xiàn):
1.Shigdar S，Lin J，Yu Y，Pastuovic M，Wei M，Duan W.RNA aptamer againsta cancer stem cell marker epithelial cell adhes1n molecule.Cancer science.May 2011;102(5):991-998.2.Song Y， Zhu Z， An Y， et al.Select1n of DNA aptamers against epithelialcell adhes1n molecule for cancer cell imaging and circulating tumor cellcapture.Analytical chemistry.Apr 16 2013; 85 (8): 4141-4149.3.Liu J，Liu H，Sefah K，et al.Select1n of aptamers specific for adiposetissue.PloS one.2012; 7 (5): e37789.
【權(quán)利要求】
1.一種核酸適體及其衍生物的用途，其特征是在組織冰凍切片中用于檢測(cè)特異性生物標(biāo)志物。
2.—種核酸適體及其衍生物對(duì)組織冰凍切片的快速成像方法，其特征是將組織冰凍切片用隨機(jī)序列封閉非特異性結(jié)合，再用信號(hào)標(biāo)記的核酸適體或者核酸適體衍生物進(jìn)行孵育，觀(guān)察組織冰凍切片的成像結(jié)果，根據(jù)信號(hào)在組織冰凍切片中的定位來(lái)判斷病灶位置。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104458375SQ201410739761
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】劉慧霞, 蒲穎, 譚蔚泓, 陸藝, 劉真序, 袁鵬, 劉俊 申請(qǐng)人:劉慧霞