一種樟樹葉片快速冰凍切片方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于顯微組織切片技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物冷凍切片的制作，具體是一種樟樹葉片快速冰凍切片方法。
【背景技術(shù)】
[0002]場M i Cinnamomum camphor a)為中國亞熱帶常綠闊葉林中的重要樹種，主要分布于長江流域以南各省，是中國特有的珍貴用材和經(jīng)濟樹種，富含多糖多酚、萜類等次生代謝物質(zhì)，是香精香料、油脂化工和醫(yī)藥等的重要原料樹種。也是樟科樟屬常綠喬木植物中經(jīng)濟價值最大的樹種之一，具有較大的開發(fā)利用潛力。
[0003]隨著全球氣候的趨于變暖，樟樹作為優(yōu)良的園林綠化樹種越來越受到北方城市的青睞。樟樹抗寒性的研究對于北方地區(qū)成功引種應(yīng)用樟樹資源至關(guān)重要，目前有關(guān)樟樹的抗寒性研究多集中于相關(guān)生理生化指標(biāo)的測定方面。葉片解剖結(jié)構(gòu)鑒定作為評價植物適應(yīng)性強弱的重要手段，主要是通過不同植物組織切片方法在顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)的特征而實現(xiàn)。
[0004]徒手切片法、石蠟切片法、冷凍切片法是常用的植物組織切片方法。徒手切片法由于樣品不固定，切片時容易產(chǎn)生厚薄不勻現(xiàn)象，導(dǎo)致切片不完整；石蠟切片法由于切片前需要對植物材料進(jìn)行固定、脫水、透明和包埋等一系列步驟，材料容易變形，制作切片過程繁瑣。冷凍切片法是利用冷凍包埋劑包埋樣品后利用冷凍切片機進(jìn)行切片的方法，由于植物細(xì)胞含水量大，在低溫冰凍過程中容易形成冰晶，難以切出結(jié)構(gòu)完整的組織切片，而且細(xì)胞內(nèi)的冰晶會損傷細(xì)胞的膜系統(tǒng)，影響其在植物細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，解決樟樹植物組織冰凍切片中存在的容易形成冰晶問題，本發(fā)明采用植物材料直接包埋冷凍和適當(dāng)回溫相結(jié)合，提供了一種樟樹葉片快速冰凍切片方法。
[0006]本發(fā)明是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn):一種樟樹葉片快速冰凍切片方法，該方法所使用的冰凍切片機為萊卡CM3050S，它包括切片機降溫開關(guān)，切片機箱，機頭，旋轉(zhuǎn)杠桿，冰凍臺；按如下步驟制備:
步驟I)將切取的樟樹葉片立即投入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定液中，在4°C下，固定2-3 h，用100 mmol/L磷酸緩沖液，浸洗2_3次，制得樟樹葉片樣品，備用。
[0007]步驟2)啟動切片機降溫開關(guān)，切片機箱的溫度維持在_20°C，冰凍臺的溫度降低到-20°C。將經(jīng)過步驟I)處理得到的樟樹葉片樣品，用OCT冰凍切片包埋劑(opt1-mumcutting temperature compound)均勾涂抹，使樟樹葉片樣品深埋其中，完成包埋，并迅速冷卻固定在樣品臺上，制得樟樹葉片預(yù)切樣品。
[0008]步驟3)將經(jīng)過步驟2)制得的樟樹葉片預(yù)切樣品連同樣品臺移至切片機的機頭，擰緊機頭的螺絲，搖動機身外的旋轉(zhuǎn)杠桿進(jìn)行修塊，修塊完成后，將樟樹葉片樣品臺連同包埋塊拿出切片機箱，室溫下放置20-30S，使包埋塊變軟，制得樟樹葉片樣品包埋塊。
[0009]步驟4)將經(jīng)過上述步驟3)處理后的樟樹葉片樣品包埋塊，迅速放入切片機箱進(jìn)行切片，切片厚度為10-20 μm，切片過程控制在15-20S完成，制得樟樹葉片樣品切片。
[0010]步驟5)將經(jīng)過上述步驟4)切好的樟樹葉片樣品切片，用解剖針輕輕地碰觸切片周圍的包埋劑，使切片附著在解剖針上，通過解剖針將切片轉(zhuǎn)移到機箱外的載玻片上進(jìn)行展片。
[0011]步驟6)經(jīng)過步驟5)處理完全展開的切片，直接在切片上進(jìn)行染色或組織化學(xué)分析，顯微鏡下觀察拍照。
[0012]所述的步驟I)切取的樟樹葉片為新鮮葉片，可以不投入固定液中，直接進(jìn)行下述步驟。
[0013]本發(fā)明具有的有益效果:
(1)植物細(xì)胞含水量大，低溫冰凍由于材料硬度大使得切片容易破碎，本發(fā)明采用直接包埋后適當(dāng)回溫，然后切片，得到了結(jié)構(gòu)完整的切片；
(2)植物組織低溫冰凍造成冰晶對細(xì)胞膜的損傷，而本發(fā)明的直接包埋對細(xì)胞膜的保持較好；
(3)本發(fā)明方法沒有加入冷凍保護(hù)劑，避免了冷凍保護(hù)劑對植物細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。
【附圖說明】
[0014]圖1是棒樹葉片橫切面圖；
圖2是樟樹葉片主脈橫切面圖；
圖3是冰凍切片機萊卡CM3050S ；
圖中:1_切片機降溫開關(guān)；2_切片機箱；3-機頭；4_旋轉(zhuǎn)杠桿；5_冰凍臺。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例
[0016]如圖1，圖2和圖3所示，一種樟樹葉片快速冰凍切片方法，該方法所使用的冰凍切片機為萊卡CM3050S，它包括切片機降溫開關(guān)1，切片機箱2，機頭3，旋轉(zhuǎn)杠桿4，冰凍臺5 ;按如下步驟制備:
步驟I)將切取的樟樹葉片立即投入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定液中，在4°C下，固定2-3 h，用100 mmol/L磷酸緩沖液，浸洗2_3次，制得樟樹葉片樣品，備用。
[0017]步驟2)啟動切片機降溫開關(guān)1，切片機箱2的溫度維持在_20°C，冰凍臺5的溫度降低到_20°C。將經(jīng)過步驟I)處理得到的樟樹葉片樣品，用OCT冰凍切片包埋劑均勻涂抹，使樟樹葉片樣品深埋其中，完成包埋，并迅速冷卻固定在樣品臺上，制得樟樹葉片預(yù)切樣品。
[0018]步驟3)將經(jīng)過步驟2)制得的樟樹葉片預(yù)切樣品連同樣品臺移至切片機的機頭，擰緊機頭的螺絲，搖動機身外的旋轉(zhuǎn)杠桿4進(jìn)行修塊，修塊完成后，將樟樹葉片樣品臺連同包埋塊拿出切片機箱2，室溫下放置20-30S，使包埋塊變軟，制得樟樹葉片樣品包埋塊。
[0019]步驟4)將經(jīng)過上述步驟3)處理后的樟樹葉片樣品包埋塊，迅速放入切片機箱2進(jìn)行切片，切片厚度為10-20 μm，切片過程控制在15-20S完成，制得樟樹葉片樣品切片。
[0020]步驟5)將經(jīng)過上述步驟4)切好的樟樹葉片樣品切片，用解剖針輕輕地碰觸切片周圍的包埋劑，使切片附著在解剖針上，通過解剖針將切片轉(zhuǎn)移到機箱外的載玻片上進(jìn)行展片。
[0021]步驟6)經(jīng)過步驟5)處理完全展開的切片，直接在切片上進(jìn)行染色或組織化學(xué)分析，顯微鏡下觀察拍照。
【主權(quán)項】
1.一種樟樹葉片快速冰凍切片方法，該方法所使用的冰凍切片機為萊卡CM3050S，它包括切片機降溫開關(guān)(1)，切片機箱(2)，機頭(3)，旋轉(zhuǎn)杠桿(4)，冰凍臺(5);其特征在于:按如下步驟制備: 步驟I)將切取的樟樹葉片立即投入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定液中，在4°C下，固定2-3 h，用100 mmol/L磷酸緩沖液，浸洗2-3次，制得樟樹葉片樣品，備用； 步驟2)啟動切片機降溫開關(guān)(1)，切片機箱(2)的溫度維持在_20°C，冰凍臺(5)的溫度降低到-20°C，將經(jīng)過步驟I)處理得到的樟樹葉片樣品，用OCT冰凍切片包埋劑均勻涂抹，使樟樹葉片樣品深埋其中，完成包埋，并迅速冷卻固定在樣品臺上，制得樟樹葉片預(yù)切樣品； 步驟3)將經(jīng)過步驟2)制得的樟樹葉片預(yù)切樣品連同樣品臺移至切片機的機頭，擰緊機頭的螺絲，搖動機身外的旋轉(zhuǎn)杠桿(4)進(jìn)行修塊，修塊完成后，將樟樹葉片樣品臺連同包埋塊拿出切片機箱，室溫下放置20-30S，使包埋塊變軟，制得樟樹葉片樣品包埋塊； 步驟4)將經(jīng)過上述步驟3)處理后的樟樹葉片樣品包埋塊，迅速放入切片機箱(2)進(jìn)行切片，切片厚度為10-20 μ m，切片過程控制在15-20s完成，制得樟樹葉片樣品切片； 步驟5)將經(jīng)過上述步驟4)切好的樟樹葉片樣品切片，用解剖針輕輕地碰觸切片周圍的包埋劑，使切片附著在解剖針上，通過解剖針將切片轉(zhuǎn)移到機箱外的載玻片上進(jìn)行展片; 步驟6)經(jīng)過步驟5)處理完全展開的切片，直接在切片上進(jìn)行染色或組織化學(xué)分析，顯微鏡下觀察拍照。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種樟樹葉片快速冰凍切片方法，將切取的新鮮樟樹葉片4℃下固定2-3h，箱溫和冰凍臺溫度維持在-20℃下，用OCT冰凍切片包埋劑均勻涂抹材料樣品，使其深埋其中，迅速冷卻并固著在樣品臺上，搖動機身外的旋轉(zhuǎn)杠桿修塊至自己需要觀察的部位，然后將樣品臺連同包埋塊拿出切片機箱，室溫下放置20-30s，使包埋塊變軟之后，迅速放入切片機箱15-20s內(nèi)完成切片，切片厚度為10-20μm；用解剖針輕輕碰觸切片周圍的包埋劑，使切片附著在解剖針上，通過解剖針將其轉(zhuǎn)移到機箱外的載玻片上進(jìn)行展片；完全展開的切片，一般不需要特殊處理就可以直接在切片上進(jìn)行染色或組織化學(xué)分析，顯微鏡下觀察拍照。
【IPC分類】G01N1/06
【公開號】CN105092291
【申請?zhí)枴緾N201510569101
【發(fā)明人】黃紹輝, 劉艷
【申請人】徐州工程學(xué)院
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月9日