對(duì)從染色的FFPET切片顯微切割的材料的RT-qPCR分析的制作方法
【專利說(shuō)明】對(duì)從染色的FFPET切片顯微切割的材料的RT-qPCR分析
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 本描述涉及用于經(jīng)福爾馬林固定的、經(jīng)石蠟包埋的組織切片的免疫組織化學(xué)染色 的方法，其包括以下步驟：a)提供固體支持物，b)將經(jīng)福爾馬林固定的、經(jīng)石蠟包埋的組織 切片封固（mount)到固體支持物上，c)自經(jīng)福爾馬林固定的、經(jīng)石蠟包埋的組織切片除去 石錯(cuò)，d)于50至70°C加熱固體支持物上封固的組織切片達(dá)12至24小時(shí)以修復(fù)（retrieve) 表位，并e)染色固體支持物上封固的組織切片，其中至少步驟e)在存在0.5至3. OM氯化 鈉的情況中實(shí)施。本描述進(jìn)一步涉及用于實(shí)施所述方法的試劑盒。
[0003] 福爾馬林固定和石蠟包埋（FFPE)是一種用于在臨床常規(guī)中供診斷組織學(xué)和長(zhǎng)期 貯存用的組織固定的公知規(guī)程。使用FFPE組織（FFPET)樣品的大型檔案進(jìn)行生物標(biāo)志物 發(fā)現(xiàn)研究及早期臨床研究。此外，可以使用FFPET樣品分離RNA，所述RNA可以在基因表達(dá) 分析中進(jìn)一步應(yīng)用。雖然來(lái)自FFPET樣品的RNA顯示高度降解，但是它對(duì)于RT-qPCR分析 仍然是足夠的，只要使用足夠量的材料進(jìn)行RNA分離?？梢允褂么祟惙治鰜?lái)產(chǎn)生第一生物 標(biāo)志物假設(shè)并僅進(jìn)行假設(shè)測(cè)試（Lohmann等，Methods. 2013Jan ;59 (1))。
[0004] 為了能夠自FFPE組織切片分離血管和腫瘤細(xì)胞巢并實(shí)施RT-qPCR分析，我 們組合下述技術(shù)：免疫組織化學(xué)染色后自FFPET的激光捕捉顯微切割（laser capture micro-dissection, LCM)與 cDNA 的預(yù)擴(kuò)增后的 RT-qPCR 分析。
[0005] 技術(shù)人員在組合自經(jīng)IHC染色的FFPET切片的LCM，接著進(jìn)行RT-qPCR分析時(shí)面 對(duì)的挑戰(zhàn)是LCM后非常有限量的材料、樣品組織固定后的RNA降解和另外免疫組織學(xué)染色 規(guī)程期間的RNA降解。經(jīng)典的染色規(guī)程包括表位修復(fù)（例如于98°C的HIER方案）和與不 能在無(wú) RNA酶條件下生成的緩沖液（抗體溶液、清洗緩沖液、染料）的溫育時(shí)間。若RNA意 圖在RT-qPCR分析中使用，則與LCM后非常有限量的材料組合的所描述RNA降解是此工作 流的主要問(wèn)題。RNA降解導(dǎo)致LCM后基因表達(dá)分析（例如感興趣生物標(biāo)志物和參照基因之 間的比率）中不可靠的結(jié)果。mRNA穩(wěn)定性是基因特異性的，并且因此它們?cè)谝圆煌潭冉?解，導(dǎo)致用于基因表達(dá)分析的相對(duì)定量的錯(cuò)誤結(jié)果。
[0006] 為了克服此RNA降解問(wèn)題，已經(jīng)建立了不同規(guī)程以使降解保持為最小值。例如，大 多數(shù)出版物使用新鮮冷凍（Fresh Frozen, FF)組織，其在用于RT-qPCR分析時(shí)具有較少降 解過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)。然而，主要的缺點(diǎn)是與FFPET相比FF組織是一種很大程度上有限來(lái)源的實(shí) 情（Buckanovich等·，Cancer Biol Ther. 2006Jun ;5 (6) :635-42 ;Gjerdrum等·，Diagn Mol Pathol 2004 (13)，p. 224 - 233)。經(jīng)常難以獲得足夠量的FF組織來(lái)實(shí)施產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著結(jié) 果的研究。此外，可用于回顧測(cè)試的臨床樣品材料通常是FFPET。
[0007] 因此，此領(lǐng)域中的主要焦點(diǎn)是開(kāi)發(fā)使RNA降解最小化的與LCM和RT-qPCR分析組 合使用FFPET的技術(shù)。開(kāi)發(fā)出用于FFPET切片的超快染色規(guī)程以使染色期間的RNA降解最 小化。然而，分析來(lái)自此類顯微切割的超快染色的FFPET切片的RNA顯示了在以非常短的 溫育期（2次5分鐘）抗體溫育后，與簡(jiǎn)單組織染劑（蘇木精）相比仍有約90% RNA被降解 (Gjerdrum等·，Diagn Mol Pathol 2004(13))。另外，超快染色方案不適用于所有抗體，因 為一些需要幾小時(shí)至過(guò)夜溫育（Brown等，RNA Journal 2009 (15)，p. 2364-2374)。此類長(zhǎng) 期溫育規(guī)程導(dǎo)致大量RNA降解，從而基因表達(dá)分析是簡(jiǎn)直不可能的。
[0008] 因此，本說(shuō)明書(shū)的目的是提供用于隨后為RNA分離使用的FFPET切片的改善的染 色技術(shù)，其中改善的染色技術(shù)導(dǎo)致對(duì)于RNA分析（諸如基因表達(dá)分析）足夠的自FFPET切 片分離的RNA的產(chǎn)量（yield)和質(zhì)量。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 發(fā)現(xiàn)了對(duì)固體支持物上封固的組織切片應(yīng)用的本文中描述的染色方法中0. 5至 3. OM氯化鈉的高鹽濃度阻止隨后自組織切片分離的RNA的降解。根據(jù)描述的方法適合于染 色規(guī)程，其中在染色后分離RNA且其中需要高質(zhì)量RNA，諸如用于基因表達(dá)分析。
[0011] 如此，本描述涉及對(duì)經(jīng)福爾馬林固定的、經(jīng)石蠟包埋的組織切片的免疫組織化學(xué) 染色的方法，其包括以下步驟：a)提供固體支持物，b)將經(jīng)福爾馬林固定的、經(jīng)石蠟包埋的 組織切片封固到固體支持物上，c)自經(jīng)福爾馬林固定的、經(jīng)石蠟包埋的組織切片除去石蠟， d)于50至70°C加熱固體支持物上封固的組織切片達(dá)12至24小時(shí)以修復(fù)表位，并e)染色 固體支持物上封固的組織切片，其中至少步驟e)在存在0. 5至3. OM氯化鈉的情況中實(shí)施。
[0012] 此外，本描述涉及用于實(shí)施如本文中描述的方法的試劑盒，其中試劑盒包含a)用 聚-賴氨酸包被的固體支持物，b)用于表位修復(fù)的溶液，和c)用于免疫組織化學(xué)染色的溶 液，其包含〇. 5至3. OM濃度的氯化鈉。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述
[0014] 圖1 :圖顯示了分離的RNA的光譜光度測(cè)定濃度分析（spectral photometric concentration analysis)的結(jié)果。描繪了來(lái)自從未染色的FFPET切片（未染色）分離的、 從在沒(méi)有氯化鈉的情況中（沒(méi)有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分離的和從在存在氯化鈉 的情況中（具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分離的提取物的RNA濃度的中值+/-標(biāo) 準(zhǔn)差。各從三個(gè)獨(dú)立重復(fù)獲得數(shù)據(jù)。
[0015] 圖2 :圖顯示了參照基因 HPRT (次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶）的RT-qPCR 分析的Cp值。描繪了來(lái)自RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的Cp值的中值+/_標(biāo)準(zhǔn)差。RNA是從未染色的 FFPET切片（未染色）分離的、從在沒(méi)有氯化鈉的情況中（沒(méi)有NaCl)用CD31染色的FFPET 切片分離的和從在存在氯化鈉的情況中（具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分離的。各 從三個(gè)獨(dú)立重復(fù)獲得數(shù)據(jù)。
[0016] 圖3 :圖顯示了參照基因 ALASl (delta-氨基乙酰丙酸合酶1)的RT-qPCR分析的 Cp值。描繪了來(lái)自RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的Cp值的中值+/_標(biāo)準(zhǔn)差。RNA是從未染色的FFPET切 片（未染色）分離的、從在沒(méi)有氯化鈉的情況中（沒(méi)有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分 離的和從在存在氯化鈉的情況中（具有NaCl)用CD31染色的FFPET切片分離的。各從三 個(gè)獨(dú)立重復(fù)獲得數(shù)據(jù)。
[0017] 圖4 :圖顯示了分別相對(duì)于參照基因 HPRT標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)志物1和標(biāo)志物2的表達(dá)。 分別描繪了來(lái)自顯微切割的腫瘤細(xì)胞和血管細(xì)胞的標(biāo)志物1和標(biāo)志物2的相對(duì)基因表達(dá)。 一式兩份實(shí)施實(shí)驗(yàn)。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 列出以下定義以例示并定義本文中使用的各項(xiàng)術(shù)語(yǔ)的意義和范圍。
[0020] 除非上下文另有明確指示，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"、"一種"和"所述/該"一般包括復(fù)數(shù)提及 物。
[0021] 如本文中使用的，與數(shù)值結(jié)合的術(shù)語(yǔ)"約"通過(guò)延伸高于和低于該值的邊界來(lái)規(guī)定 該值。一般地，術(shù)語(yǔ)"約"通過(guò)高或低5%的差異規(guī)定高于和低于敘述值的數(shù)值。例如，"約 100"的值意指"95至105"的范圍。
[0022] 術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"一般指從靶核酸生成多個(gè)核酸分子，其中引物與靶核酸分子上的特定 位點(diǎn)雜交以提供通過(guò)聚合酶延伸的啟動(dòng)位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中公知的任何方法（諸如但 不限于：標(biāo)準(zhǔn)PCR、長(zhǎng)PCR、熱啟動(dòng)PCR、qPCR、RT-PCR和等溫?cái)U(kuò)增）實(shí)施擴(kuò)增。
[0023] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"指完整的免疫球蛋白，諸如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM 或指抗體片段，諸如Fab、Fv或Fe或融合抗體、融合抗體片段或抗體的任何其它衍生物。術(shù) 語(yǔ)"經(jīng)標(biāo)記的抗體"指用酶、熒光染料、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素、親合素或放射性同位素標(biāo)記 的抗體。
[0024] 術(shù)語(yǔ)"表位"指化合物（諸如蛋白質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì)）的抗原性區(qū)域。抗原性 區(qū)域通常由5至8個(gè)氨基酸組成。表位被相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性識(shí)別。
[0025] 術(shù)語(yǔ)"固定的組織或細(xì)胞"在本文中如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣使用，并且指通 過(guò)化學(xué)固定方法保存而免于腐爛的生物組織或細(xì)胞。此類方法阻止此類生物組織或細(xì)胞內(nèi) 的自溶或腐敗。固定終止生物化學(xué)反應(yīng)，并且提高經(jīng)處理組織的機(jī)械穩(wěn)定性。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"免疫組織化學(xué)"指用于用能夠特異性結(jié)合組織學(xué)樣品中的抗原的抗體檢測(cè) 所述抗原的存在的技術(shù)。通常通過(guò)用經(jīng)酶標(biāo)記的抗體的生色反應(yīng)或通過(guò)熒光標(biāo)記的抗體進(jìn) 行對(duì)抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)。
[0027] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"宏觀切割"指通過(guò)使用諸如解剖刀或抹刀等工具從固體支 持物（諸如顯微鏡載玻片）上封固的組織切片刮出感興趣區(qū)域的過(guò)程。
[0028] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"膜載玻片"指在激光捕捉顯微切割（LCM)中使用的固體支 持物或顯微鏡載玻片。對(duì)于顯微切割，可以使用用膜覆蓋的玻璃載玻片或可以用各種膜