一種作物脂肪氧化酶同工酶lox-3比活力的定量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種作物脂肪氧化酶同工酶LOX-3比活力的定量測定方法。首先將作物磨碎加入提取液中磨成漿料，在超聲助體，離心分離，得到酶液，將酶液放入比色皿中，分別測定反應前后在454nm處的吸光值，根據(jù)公式測定酶液蛋白濃度，最后按照酶比活力測定公式計算出酶比活力，本發(fā)明方法能快速、準確、定量地檢測出脂肪氧化酶Lox-3比活力，其過程簡單，成本低，其精確度明顯優(yōu)于已有的相關檢測技術。
【專利說明】-種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-3比活力的定量測定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生化檢測方法，具體涉及一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-3比活 力的定量測定方法。
【背景技術】
[0002] 脂肪氧化酶（LOX)是一種含非血紅素鐵的蛋白質，專一催化具有順、順-1，4-戊二 烯結構的多元不飽和脂肪酸加氧反應，氧化生成具有共軛雙鍵的過氧化氫物。脂肪氧化酶 具有三種同工酶Lox-1、Lox-2、Lox-3它們廣泛存在于高等植物體內，與植物的生長發(fā)育、 植物的衰老、脂質過氧化作用和光合作用、傷反應及其他脅迫反應等有關。Lox在成熟的大 豆種子中含量很高（占種子蛋白質含量的1%?2% )，可催化不飽和脂肪酸的加氧反應， 形成過氧化氫衍生物等揮發(fā)性物質，能直接與食品中的蛋白質和氨基酸結合，產生豆腥味 和苦澀味，降低食品的風味和營養(yǎng)價值，而且破壞了上述幾種人體必需脂肪酸，是大豆中 的抗營養(yǎng)因子。
[0003] 脂肪氧化酶的活力直接影響大豆、花生、水稻等作物種子貯藏期限和加工品質，活 力越小其對種子的影響就越小。科研工作者已經在研究選育培養(yǎng)出脂肪氧化酶Lox缺失的 農作物新品種，因此如何快速準確地定量檢測出脂肪氧化酶Lox活性，能為研究者提供更 加準確地檢測數(shù)據(jù)，從而提高工作效率，加快新品種的研究步伐，同時也為農作物貯藏、收 購提供準確實用的數(shù)據(jù)。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明提供了一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-3比活力的定量測定方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案如下：
[0006] -種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-3比活力的定量測定方法，其特征在于，包括以 下步驟：
[0007] (1)將作物胚胎磨碎，加入提取液，研磨成勻漿，將勻漿裝入超聲波萃取釜中，將 超聲波發(fā)射頻率設定在30-40KHZ，溫度調節(jié)控制在20-25°C，萃取時間5-8分鐘，然后轉至 具蓋離心管，再用提取液分3-4次洗滌，洗滌液轉至具蓋離心管，脫色搖床振蕩8-10min， 8000rpm離心8-10min，靜置3-5min，取上層清液，即酶液；
[0008] ⑵取提取的酶液于比色皿中，加入適量的反應液，在454nm處測定吸光值，反應 開始時記錄吸光值，取出反應體系，至離心管，4°C避光反應，測定24h后的吸光值并記錄， 以吸光值的變化表示L0X-3活力，用純水作為參比調零，以緩沖液代替酶液作為對照；
[0009] (3)測定酶液蛋白濃度：
[0010] 取適量酶液，先測定樣品280nm OD值和260nm OD值，再按照以下公式計算酶液蛋 白濃度：（酶液蛋白濃度的測定方法可以參照李建武等，生物化學實驗原理和方法，1994)
[0011] 酶液蛋白濃度（mg/mL) = 280nm OD 值 *1. 45-0. 74*260nm OD 值；
[0012] (4)計算酶比活力：
[0013] 按照酶比活力測定公式計算出酶比活力，
[0014] 酶比活力=(樣品0小時的OD值-樣品24小時的OD值）-(對照0小時的OD 值-對照24小時的OD值）/酶液蛋白濃度。
[0015] 所述的作物脂肪氧化酶同工酶L0X-3比活力的定量測定方法，其特征在于：所述 的作物為水稻或花生。
[0016] 所述的作物脂肪氧化酶同工酶L0X-3比活力的定量測定方法，其特征在于：所 述的提取液的配制方法為：取甘油10ml，Tween-201. 5ml，用PH6. 6的磷酸緩沖液定容至 IOOml，經磁力攪拌器攪拌均勻，得L0X3提取液；
[0017] 所述的 ρΗ6· 6 磷酸緩沖液的制備：Na2HPOJL 64g/L，NaH2P043L 21g/L，取 26. 865g Na2HPO4,19. 506g NaH2PO4,加水溶解，定容至 1000ml 即可。
[0018] 所述的作物脂肪氧化酶同工酶L0X-3比活力的定量測定方法，其特征在于：所 述的反應液的制備方法為：將PH6. 6的磷酸緩沖液、純水、亞油酸鈉和稀釋1. 5倍的飽和 β -胡蘿卜素-丙酮溶液，按5:1:1:1 (v/v)的比例混合，得L0X-3反應液，所述的亞油酸鈉 的配制方法：定量稱取70mg亞油酸,再加入等量Tween-20,再加入4ml無氧水,充分混勻， 在加入0. 5N的NaOH約0. 55ml至溶液變澄清，再定容至25ml，等量，分裝至-20°C冷藏，待 用；所述的釋1.5倍的飽和β-胡蘿卜素-丙酮溶液的配制：先配飽和的β-胡蘿卜素-丙 酮溶液，再用丙酮稀釋1. 5倍，即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0019] 本發(fā)明的原理：利用脂肪氧化酶L0X-3能偶聯(lián)氧化β-胡蘿卜素產生變色反應，該 反應在454nm處有一吸收峰，測定其吸光值的變化率可以反映其催化速率。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明方法能快速、準確、定量地檢測出脂肪氧化酶Lox-3比 活力，其過程簡單，成本低，其精確度明顯優(yōu)于已有的相關檢測技術；能為研究者提供更加 準確地檢測數(shù)據(jù)，能提高工作效率，加快L0X-3缺失的新品種選育步伐，同時也為農作物貯 藏、收購提供更加準確實用的數(shù)據(jù)。
【具體實施方式】
[0021] 1、配制反應液、提取液
[0022]
【權利要求】
1. 一種作物脂肪氧化酶同工酶L0X-3比活力的定量測定方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 將作物胚胎磨碎，加入提取液，研磨成勻漿，將勻漿裝入超聲波萃取釜中，將超 聲波發(fā)射頻率設定在30-40KHZ，溫度調節(jié)控制在20-25°C，萃取時間5-8分鐘，然后轉至具 蓋離心管，再用提取液分3-4次洗滌，洗滌液轉至具蓋離心管，脫色搖床振蕩8-10min，8000 rpm離心8-10min，靜置3-5 min,取上層清液，即酶液； (2) 取提取的酶液于比色皿中，加入適量的反應液，在454nm處測定吸光值，反應開始 時記錄吸光值，取出反應體系，至離心管，4°C避光反應，測定24h后的吸光值并記錄，以吸 光值的變化表示LOX-3活力，用純水作為參比調零，以緩沖液代替酶液作為對照； (3)測定酶液蛋白濃度： 取適量酶液，先測定樣品280nm OD值和260nm OD值，再按照以下公式計算酶液蛋白 濃度： 酶液蛋白濃度（1^/1^)=28〇11111〇0值*1.45-〇.74*26〇11111〇0值； (4)計算酶比活力： 按照酶比活力測定公式計算出酶比活力， 酶比活力=(樣品0小時的OD值-樣品24小時的OD值）-(對照0小時的OD值-對 照24小時的OD值）/酶液蛋白濃度。
2. 根據(jù)權利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-3比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的作物為水稻或花生。
3. 根據(jù)權利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-3比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的提取液的配制方法為：取甘油l〇ml，Tween-20 1. 5ml，用PH6. 6的磷酸緩沖 液定容至100ml，經磁力攪拌器攪拌均勻，得LOX3提取液； 所述的 PH6. 6 磷酸緩沖液的制備：Na2HP04 71. 64g/L，NaH2P04 31. 21g/L，取 26. 865g Na2HP04 ,19 . 506 g NaH2P04,加水溶解，定容至 1000ml 即可。
4. 根據(jù)權利要求1所述的作物脂肪氧化酶同工酶LOX-3比活力的定量測定方法，其特 征在于：所述的反應液的制備方法為：將PH6. 6的磷酸緩沖液、純水、亞油酸鈉和稀釋1. 5 倍的飽和13-胡蘿卜素-丙酮溶液，按5:1:1:1 (v/v)的比例混合，得LOX-3反應液，所述的 亞油酸鈉的配制方法：定量稱取7〇mg亞油酸，再加入等量Tween-20,再加入4ml無氧水，充 分混勻，在加入0. 5N的NaOH約0. 55ml至溶液變澄清，再定容至25ml，等量，分裝至-20°C 冷藏，待用；所述的釋1. 5倍的飽和13-胡蘿卜素-丙酮溶液的配制：先配飽和的13-胡蘿卜 素-丙酮溶液，再用丙酮稀釋1. 5倍，即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。
【文檔編號】G01N21/31GK104390919SQ201410668086
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權日:2014年11月20日
【發(fā)明者】張瑛, 滕斌, 吳敬德, 宣紅, 周俊峰 申請人:安徽省農業(yè)科學院水稻研究所