一種檢測(cè)腺病毒IgM抗體的免疫熒光試劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腺病毒抗原，由保藏編號(hào)為CGMCC No.9596的腺病毒毒株培養(yǎng)獲得。本發(fā)明還涉及一種腺病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有上述腺病毒抗原。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的腺病毒抗原制備的診斷試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、價(jià)格優(yōu)惠等優(yōu)點(diǎn)，很好的滿足了腺病毒感染臨床診斷的需要。GMCC No.95962014.09.09
【專利說(shuō)明】-種檢測(cè)腺病毒IgM抗體的免疫巧光試劑及其應(yīng)用 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種腺病毒抗原、含有該抗原的試劑盒及其 制備方法，W及所述試劑盒在檢測(cè)腺病毒IgM中的應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 腺病毒（adenovirus)是病毒性肺炎的主要病原之一，較大年齡組兒童或青年人 感染腺病毒僅引起上呼吸道疾病，在嬰幼兒中可引起嚴(yán)重的急性腺病毒性肺炎。1958年 化ang等首先報(bào)道1例7A型腺病毒性肺炎，W后各國(guó)相繼報(bào)道。我國(guó)于1958年亦開始對(duì)腺 病毒感染進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)引起嬰幼兒腺病毒性肺炎流行的病原體主要是腺病毒3、7型，輕 癥及大齡兒童預(yù)后較好，重癥感染和腺病毒性肺炎則預(yù)后不良，病死率高。
[0003] 腺病毒為DNA病毒，屬腺病毒科。因能致淋己結(jié)（腺）、咽及結(jié)膜炎癥，又稱腺一 咽一結(jié)膜病毒（簡(jiǎn)稱APC病毒），是一種沒(méi)有包膜的直徑為70?90nm的顆粒，由252個(gè)殼 粒呈廿面體排列構(gòu)成，大小相當(dāng)于一根頭發(fā)絲直徑的800分之一。
[0004] 腺病毒一般通過(guò)呼吸道傳染。在集體兒童機(jī)構(gòu)中往往同時(shí)發(fā)生腺病毒上呼吸道感 染及肺炎。人群血清學(xué)研究說(shuō)明，生后最初數(shù)月常存留從母體傳遞的腺病毒特異抗體，此后 一直到2歲抗體缺乏，2歲W后才逐漸增加。腺病毒對(duì)呼吸道、胃腸道、尿道和膀脫、眼、肝臟 等均可感染，可W導(dǎo)致多種疾病，甚至可W導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生腫瘤。人腺病毒約1/3的已知血清 型通常與人類疾病相關(guān)，主要有；呼吸道感染、流行性結(jié)膜炎（俗稱；紅眼?。?、病毒性胃腸 炎、急性出血性膀脫炎等，其中腺病毒引起的呼吸道疾病和紅眼病最為常見(jiàn)。但一種血清型 可引起不同的臨床疾患；相反，不同血清型也可引起同一種疾患。
[0005] 腺病毒感染的潛伏期為2-14天，IgM抗體在發(fā)病1周左右出現(xiàn)，可持續(xù)存在2?3 個(gè)月。除根據(jù)流行病學(xué)及臨床表現(xiàn)外，確診需要依靠實(shí)驗(yàn)診斷，主要包括病毒分離及鑒定、 血清學(xué)試驗(yàn)。
[0006] 中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)CN 201310162470. 3公開了一種腺病毒IgMJgG抗體的膠體金 法檢測(cè)試紙條，W及膠體金法檢測(cè)試劑盒，與單獨(dú)檢測(cè)腺病毒IgG或IgM抗體的化ISA試劑 具有相似的檢測(cè)結(jié)果。然而，膠體金方法檢測(cè)IgM抗體存在靈敏度較低的缺陷，準(zhǔn)確性相對(duì) 較低，因此通常只作為輔助診斷試劑。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種腺病毒抗原，W及含有該抗原的 試劑盒及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的腺病毒抗原是由保藏編號(hào)為CGMCC No. 9596的腺病毒毒株獲得，所述腺 病毒毒株已于2014年09月09日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中也， 地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0009] 本發(fā)明還提供上述腺病毒抗原在檢測(cè)腺病毒中的應(yīng)用。
[0010] 在本發(fā)明中，所述檢測(cè)腺病毒IgM抗體的方法包括間接免疫英光法和酶聯(lián)免疫 法。
[0011] 本發(fā)明還提供包含本發(fā)明腺病毒抗原的組合物和試劑盒。所述組合物或試劑盒可 制備成檢測(cè)腺病毒感染的試劑或試劑盒形式，在臨床上用于方便、快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)腺病 毒感染。任何生物學(xué)樣品，只要它們含有腺病毒IgM抗體，就可用本發(fā)明的組合物或試劑盒 來(lái)檢測(cè)。
[0012] 術(shù)語(yǔ)"試劑盒"是指利用本發(fā)明抗原完成腺病毒感染檢測(cè)而組配制成的成套試劑。 該試劑盒用于診斷腺病毒感染。
[0013] 特別地，本發(fā)明提供一種腺病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有上述腺病 毒抗原。
[0014] 根據(jù)上述試劑盒的一種有效實(shí)施方式，用0.02 %的依文思藍(lán)將英光素標(biāo)記抗人 IgM單克隆抗體按體積比1:32稀釋。
[0015] 優(yōu)選地，所述試劑盒還含有W體積比1 ;1〇稀釋的腺病毒IgM陰性血清和陽(yáng)性血 清。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的腺病毒抗原制備的診斷試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈 敏度高、價(jià)格優(yōu)惠等優(yōu)點(diǎn)，很好的滿足了腺病毒感染臨床診斷的需要。
[0017] 本發(fā)明涉及的腺病毒55型YNT-Ad-55毒株，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 9596,于2014 年09月09日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中也，地址北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。 【【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[001引圖1為間接免疫英光法（IFA)原理示意圖。
[0019] 圖2為實(shí)施例1的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 【【具體實(shí)施方式】】
[0020] W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，如無(wú) 特殊說(shuō)明，"％ "均為體積百分比，"比"均為體積比。
[0021] 實(shí)施例1腺病毒抗原的制備
[0022] 1.1腺病毒毒種的制備
[0023] 本申請(qǐng)所使用的腺病毒55型為2011年在山西太原市一位呼吸道患者的咽拭子用 A549細(xì)胞分離得到的，通過(guò)核酸方法擴(kuò)增、測(cè)序，基因序列為GenBank accession number KF911353,如沈Q ID No. 1。
[0024] 具體地，從軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所引進(jìn)的A549細(xì)胞（人肺腺癌細(xì) 胞），用含有IOwt %胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，選用生長(zhǎng)良好的單層細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，力口 入0.25%的膜蛋白酶消化細(xì)胞，等細(xì)胞有圓點(diǎn)出現(xiàn)后，倒掉消化液，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，吹打 細(xì)胞，使細(xì)胞完全分散后，苔扮藍(lán)計(jì)數(shù)，按照細(xì)胞6 X 1〇5?8 X 1〇5個(gè)/瓶分別接種到細(xì)胞瓶 內(nèi)。37 CCA溫箱培養(yǎng)2化。
[00巧](1)病毒分離；咽拭子經(jīng)無(wú)菌處理后接種A549細(xì)胞（含IOOOU青霉素/mL和IOOOU 鏈霉素AiL或0. 2 y m的微孔濾膜過(guò)濾），25血的細(xì)胞瓶接種0. 2血，37C吸附1小時(shí)，吸出 接種液，加入含有2 %胎牛血清的DMEM細(xì)胞維持液7mL，37C C化溫箱培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞 病變情況。
[002引 似結(jié)果判定：
[0027] a)細(xì)胞病變判定；接種A549細(xì)胞后約24-4她，細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、破碎融合、大量脫 落為細(xì)胞病變（CP巧。病變細(xì)胞約占25%為' + ',50%為'++',75%為'+++'，90% W上為 <++++'。
[0028] b)接種后3?5d如出現(xiàn)細(xì)胞病變，則收集培養(yǎng)上清夜，并再連續(xù)傳H代后，待CPE 為'+++?++++'時(shí)，收取培養(yǎng)上清液，-7〇°C或冷凍干燥，保存毒種。
[0029] C)接種6d后，如無(wú)CPE，可收集培養(yǎng)上清夜，再連續(xù)盲傳3代，如仍無(wú)CPE，即作未 分離出病毒處理。
[0030] (3)病毒核酸鑒定
[003。 將分離到的病毒培養(yǎng)液用QIAamp DNAMini Kit進(jìn)行DNA提取，并用W下引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增：
[0032] F ;5, -GCTACTCATGGCTCGGGATCCATGGCCACCCCATCGATGC--3，
[0033] R ;5 '-ATACTCGAG TTACGTGGTAGCGTTACCGGCCGAGAACGG-3，
[0034] W上引物由（華美生物技術(shù)有限公司）合成。
[003引擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如附圖2所示。切割含目的DNA條帶的膠 塊，用DNA快速純化試劑盒（購(gòu)自六合通-北京TAKARA公司，產(chǎn)品名稱；TAKARA Mini邸ST Plasmid purification)回收目的DNA，操作按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行，并將目的片段送送賽百勝公 司測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果為 GenBank accession number KF911353。
[0036] 將經(jīng)過(guò)測(cè)序確定的病毒毒種（保藏編號(hào)為CGMCC No. 9596)用含有2%胎牛血清 的DMEM稀釋成1〇-3,然后接種已單層良好的A549細(xì)胞，每瓶細(xì)胞接種0. 2mU然后放37C 吸附1小時(shí)，加細(xì)胞維持液6mU放37C培養(yǎng)，等80%的細(xì)胞病變后，把細(xì)胞放-2(TC凍融H 次。分裝，每支1111以放-701：備用。
[0037] 1. 2腺病毒TCID50 (半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的滴定
[0038] 從-7(TC冰箱取1支腺病毒毒種，解凍后SOOOXg離也10分鐘，取上清液滴定病 O
[0039] 取9支無(wú)菌試管，分別標(biāo)上-1至-9,該些數(shù)字代表稀釋度的指數(shù)。每管中加入 0. 9mL細(xì)胞維持液。取0. ImL混勻的病毒息液，加入到第1管（-1管）中，蓋上蓋后振蕩混 勻。換用一支新的槍頭，從-1管中取0. ImL移入-2管中，振蕩混勻，如此繼續(xù)稀釋至-9管。
[0040] 將已稀釋好的病毒接種到已經(jīng)單層的A549細(xì)胞96培養(yǎng)板上，每個(gè)稀釋度種4孔， 每孔接種0. 2mU從高稀釋度到低稀釋度順序接種到96孔A549細(xì)胞上。放37C Ch培養(yǎng)箱 培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，最終確定腺病毒TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）為IOA
[0041] 實(shí)施例2腺病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒（間接免疫英光法）的制備
[0042] 2. 1腺病毒抗原片的制備
[0043] (1)腺病毒抗原片制備感染細(xì)胞程度的選擇
[0044] 從-7(TC取出腺病毒毒種，用含有2 %胎牛血清的DMEM (細(xì)胞維持液）將病毒稀釋 成1〇-8。選用A549生長(zhǎng)良好的單層細(xì)胞，倒掉細(xì)胞生長(zhǎng)液，每瓶細(xì)胞接種1〇- 8的病毒0. 2mL， 37°C C〇2培養(yǎng)箱吸附1小時(shí)，加細(xì)胞維持液6血，放37°C C02培養(yǎng)箱。
[0045] 分別等細(xì)胞病變15%、25%、35%時(shí)，用0. 25%的膜酶消化細(xì)胞。用一定量的細(xì)胞 生長(zhǎng)液吹打細(xì)胞，制備成細(xì)胞息液。
[0046] 將上述3個(gè)不同程度的細(xì)胞病變（15%、25%、35%)細(xì)胞息液滴到10孔的鍛膜玻 片上，每孔滴40 y L。把滴好的10孔的鍛膜玻片放在濕盒內(nèi)，37C C〇2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)， 使滴在玻片上的細(xì)胞進(jìn)行舒展。玻片用0. 005M的PBS洗一次，讓玻片在生物安全柜自然干 燥，然后把玻片放入丙麗液內(nèi)，-2(TC固定過(guò)夜。取出后風(fēng)干即為制備好的腺病毒抗原片。
[0047] 用復(fù)篩過(guò)的不同強(qiáng)度的ADV-IgM抗體陽(yáng)性血清和ADV-IgM陰性血清同時(shí)檢測(cè)細(xì) 胞病變15%、25%、35%時(shí)制備的抗原片，然后加入英光素標(biāo)記抗人IgM單克隆抗體進(jìn)行反 應(yīng)。
[0048] 選用在英光顯微鏡下觀察陽(yáng)性和陰性比例適中的作為研究好生產(chǎn)抗原片的條件。
[0049] (2)腺病毒抗原片制備最佳細(xì)胞量的選擇
[0050] 取上一實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取的最佳細(xì)胞病變程度25%，用IO5UO6UOVml細(xì)胞含量滴細(xì) 胞在鍛膜玻片的孔內(nèi)。
[0051] 用復(fù)篩過(guò)的ADV-IgM抗體陽(yáng)性和ADV-IgM抗體陰性同時(shí)檢測(cè)抗原片；選取最佳細(xì) 胞濃度制備腺病毒抗原片，作為研究及生產(chǎn)用制片的最佳細(xì)胞用量為lOVmL。
[0052] (3)滴片后培養(yǎng)時(shí)間的選擇
[0053] 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，細(xì)胞滴到鍛膜玻片上后選用6、8、12小時(shí)培養(yǎng)，讓細(xì)胞更好 的蘇展和貼壁。用復(fù)篩過(guò)的ADV-IgM抗體陽(yáng)性血清和ADV-IgM抗體陰性血清檢測(cè)抗原片； 最終選取在英光染色過(guò)程中，細(xì)胞脫落較少的培養(yǎng)時(shí)間巧小時(shí)）作為ADV-IgM抗體免疫英 光檢測(cè)試劑的研究和生產(chǎn)用。
[0054] (4)抗原片制備固定劑的選擇
[0055] 在選取上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳細(xì)胞病變程度25%和最佳細(xì)胞的用量（IOVmL)的基 礎(chǔ)上滴片，分別用己醇固定和丙麗固定過(guò)夜制備抗原片；用復(fù)篩過(guò)的ADV-IgM抗體陽(yáng)性和 ADV-IgM抗體陰性同時(shí)檢測(cè)兩種抗原片；選取在英光染色過(guò)程中，細(xì)胞脫落較少的丙麗作 為ADV-IgM抗體免疫英光檢測(cè)試劑研究和生產(chǎn)用固定劑。
[0056] (5)抗原片固定時(shí)間的選擇
[0057] 取W上實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取的最佳細(xì)胞用量、細(xì)胞病變百分比滴片，然后用丙麗-2(TC固 定過(guò)夜或-2(TC固定30分鐘制備抗原片；用復(fù)篩過(guò)的不同強(qiáng)度ADV-IgM抗體陽(yáng)性血清和 ADV-IgM抗體陰性血清同時(shí)檢測(cè)抗原片；最終選取抗原片的最佳固定時(shí)間為-2(TC固定過(guò) 夜。
[005引 做抗原片儲(chǔ)存期限的確定
[0059] 根據(jù)W上最佳條件制備的抗原片，真空包裝置2°C-8°C保存。分別于6個(gè)月、12 個(gè)月、18個(gè)月，用企業(yè)參考品N01、N03、N05、P01、P03、P05檢測(cè)抗原片，最終確定抗原片 2 C -8 C可W保存18個(gè)月。
[0060] 2. 2最佳反應(yīng)條件的選擇
[0061] W陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品（收集北華大學(xué)附屬醫(yī)院、解放軍第309醫(yī)院等醫(yī)院經(jīng)臨床 驗(yàn)證的ADV-IgM抗體陽(yáng)性、陰性血清，用北京貝爾生物工程有限公司生產(chǎn)的"腺病毒IgM抗 體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）"進(jìn)行復(fù)檢篩選，得到的ADV-IgM抗體陽(yáng)性、陰性血清建立為 陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品）為測(cè)試樣品。采用交叉配比法確定最佳的樣本稀釋倍數(shù)和加樣量，從 表1可W看出，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1 ;40和1 ;80時(shí)，陽(yáng)性質(zhì)控品會(huì)出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，當(dāng)稀釋倍數(shù) 為I ;20時(shí)，陽(yáng)性質(zhì)控品POl的靈敏度很低，為了保證試劑盒的靈敏度和特異性，并在節(jié)約樣 本量的基礎(chǔ)上，我們最終選擇最佳樣本稀釋倍數(shù)為1 ; 10稀釋，加樣量為20 y L。具體結(jié)果 如表1 ;
[0062] 表1最佳樣本稀釋倍數(shù)和加樣量的選擇
[0063]
【權(quán)利要求】
1. 一種腺病毒抗原，所述腺病毒抗原由保藏編號(hào)為CGMCC No. 9596的腺病毒55型 YNT-Ad-55毒株培養(yǎng)獲得，所述毒株已于2014年09月09日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所。
2. 權(quán)利要求1所述的腺病毒抗原在檢測(cè)腺病毒IgM抗體中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述檢測(cè)腺病毒IgM抗體的方法包括間接 免疫熒光法。
4. 一種腺病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有根據(jù)權(quán)利要求1所述 的腺病毒抗原。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還含有抗人IgM單克隆抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于用0. 02 %的依文思藍(lán)將熒光素標(biāo)記抗人 IgM單克隆抗體按體積比1:32稀釋。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還含有腺病毒IgM陰性血清 和陽(yáng)性血清。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還含有以體積比1 :10稀釋 的腺病毒IgM陰性血清和陽(yáng)性血清。
9. 權(quán)利要求4所述的試劑盒在檢測(cè)腺病毒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104357407SQ201410664367
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】張曉剛, 吳純, 趙建宏, 陳廷友, 吳麗霞, 華艷 申請(qǐng)人:北京英諾特生物技術(shù)有限公司