一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條及其制備方法，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水墊和底板，特點(diǎn)是在底板上按順序依次粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水墊，該結(jié)合墊上包被有所述的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體—膠體金標(biāo)記物，該硝酸纖維膜上分別包被有甲魚系統(tǒng)性敗血癥球病毒抗原構(gòu)成的檢測(cè)線和兔抗雞卵黃抗體構(gòu)成的質(zhì)控線，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確性高。
CGMCC No.5378
20111021
【專利說明】一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，尤其是涉及一種基于卵黃抗體、膠體金免疫層析 技術(shù)的用以快速檢測(cè)動(dòng)物各種組織、血液及糞便中甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒的檢測(cè)試紙及其 制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲魚是最負(fù)盛名的滋補(bǔ)強(qiáng)體珍品之一，全身皆可入藥，是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有 較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著人民生活水平日益提高以及對(duì)甲魚的食用、藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)的深入，甲 魚的需求量不斷增大，人工養(yǎng)殖甲魚業(yè)應(yīng)用而生。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，疾病頻頻暴發(fā)， 愈演愈烈，其中主要以甲魚系統(tǒng)性敗血癥為主。
[0003] 甲魚系統(tǒng)性敗血癥是發(fā)生于甲魚生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)的一種暴發(fā)性疾病，6- 9月份為其 發(fā)病高峰期，其來勢(shì)兇猛，7-10天內(nèi)發(fā)病池塘累積死亡率可達(dá)90-100%。病鱉主要為體重 150_200g的幼鱉，成鱉也有患病感染。該病的原發(fā)性病原為甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒 (Soft-shelledturtlesystemicsepticemiasphericalvirus,STSSSV)(保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo. 5378)，患病甲魚主要癥狀 為出血性敗血，心、肝、腸胃等組織中存在大量球狀病毒顆粒。經(jīng)調(diào)查，甲魚系統(tǒng)性敗血癥一 旦爆發(fā)，常規(guī)藥物治療無效，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，在苗種購買、引進(jìn)和發(fā)病 初期進(jìn)行檢測(cè)，確定病情，以便及時(shí)采取措施控制傳染和情況惡化，對(duì)減少養(yǎng)殖場(chǎng)損失具有 重要意義。
[0004] 目前，病原體的檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)、電鏡觀察、PCR、ELISA、色譜分析等，這 些方法多耗時(shí)耗力，需要專用場(chǎng)地和儀器設(shè)備，需要專業(yè)人員操作。研究人員已成功建立了 ELISA檢測(cè)甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒（STSSSV)的技術(shù)，但是整個(gè)檢測(cè)過程至少需要數(shù)小時(shí)， 且對(duì)操作者要求較高，需要酶標(biāo)儀這樣的專業(yè)設(shè)備。
[0005]膠體金免疫層析（gold-immunochromatographyassayGICA)是 20 世紀(jì) 80 年代 開始發(fā)展起來的新的免疫分析方式，是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，基于抗 原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，它具有簡(jiǎn)便，快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，費(fèi)用低的優(yōu) 點(diǎn)。依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)，在國內(nèi)外無論人醫(yī)應(yīng)用方面，還是獸醫(yī)應(yīng)用方便，都已經(jīng)研 制出了多種膠體金免疫層析快速檢測(cè)各種病原和有毒有害物質(zhì)的試紙條。但是，目前國內(nèi) 外還沒有公開任何關(guān)于甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條及其制備方法的相關(guān)研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于膠體金免疫層析技術(shù)的特異性強(qiáng)、靈 敏度高、檢測(cè)速度快、成本低并且操作簡(jiǎn)便的甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條及其制備 方法，滿足了現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè) 試紙條，所述的試紙條由條形底板和在條形底板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素 膜及吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物， 所述的硝酸纖維素膜上分別設(shè)置有由甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒抗原包被的檢測(cè)線和由兔抗 雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線。
[0008] 所述的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物的制備方法如下：將抗 甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為15-30nm的膠體金溶液按6-8yg: lmL混合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛血清白蛋 白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn)定的膠 體金顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗甲魚系統(tǒng)性敗 血癥病毒卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗 體一膠體金標(biāo)記物。
[0009] 一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟： (1) 樣品墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐溫-20 的0. 01MpH7. 4的PBS緩沖液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真空封裝， 4 °C保存?zhèn)溆茫?(2) 特定包被的結(jié)合墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐溫-20 的0. 01MpH7. 4的PBS緩沖液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻璃纖維 紙上均勻噴涂10-20iiL的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物，真空 冷凍干燥l_2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫?(3) 特定包被的硝酸纖維素膜的制備 將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成檢測(cè)線；將 兔抗雞卵黃抗體用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線，即得到特定包被的硝酸纖 維膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫黄渲袡z測(cè)線與質(zhì)控線相互平行，所述 的檢測(cè)線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近吸水墊端； (4)試紙條的制備 將步驟（1)得到的樣品墊、步驟（2)得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟（3)得到的特定包 被的硝酸纖維膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6mm寬的細(xì)條，即得甲魚系統(tǒng) 性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條，真空封裝，4°C保存。
[0010] 所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原的制備方法如下：取攻毒感染死亡的小 甲魚，冰上解剖取其內(nèi)臟，稱量，按1 :5-1 :20加入預(yù)先冰浴過的含有ImM苯甲基磺酰氟 (PMSF)的TNE緩沖溶液中勻漿，將勻漿液于4°C，8000g離心20min，沉淀用含ImMPMSF的 TNE緩沖液重新懸浮勻漿后再次于4°C，8000g離心20min，合并兩次離心所得上清液，將上 清液于4°C，6000g離心lOmin后，取上清液于4°C，38000g離心1. 5h，用預(yù)冷的TM緩沖液洗 去沉淀上層疏松部分，取下層結(jié)實(shí)白色沉淀部分用含ImMPMSF的預(yù)冷的TM緩沖液重懸后 于4°C，3500g離心5min后，取上清液再次于4°C，38000g離心1. 5h，用TM緩沖液洗去上層 疏松部分，下層結(jié)實(shí)的白色沉淀部分再次用含ImMPMSF的預(yù)冷的TM緩沖液重懸后于4°C， 3500g離心5min后，取上清液再次于4°C，38000g離心1. 5h，用TM緩沖液洗去上層疏松部 分，最終得到的下層結(jié)實(shí)的白色沉淀即為甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原。
[0011] 所述的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物的制備方法如下： (1)抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體的制備 取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對(duì)象，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒抗原和弗氏完全佐 劑等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫， 每只母雞免疫劑量為500-800iig/mL，15-20天后，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒抗原和弗氏不 完全佐劑進(jìn)行等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞肌肉注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只母雞免疫劑量 為400-600yg/mL，加強(qiáng)免疫重復(fù)進(jìn)行三次，每次間隔時(shí)間為7-10天，然后收集雞蛋測(cè)定效 價(jià)，當(dāng)卵黃抗體效價(jià)>1 =20000時(shí)收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體； (2)膠體金標(biāo)記抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體 將抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為15-30nm的膠體金溶液按 6-8yg:lmL混合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛血 清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn) 定的膠體金顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗甲魚系 統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒 卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物，將所述的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記 物用含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0. 02wt%疊氮化鈉的pH7. 4的0. 01M PBS緩沖液重懸至所述的膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
[0012] 用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體的具體方法如下：取步驟（1)分離得到的卵 黃，按體積比1 :9加入PH5. 0的0. 05M的乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置過 夜，8000g離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，10000g離心 20min，取沉淀用10-20倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C 攪拌過夜，l〇〇〇〇g離心20min，沉淀用少量pH7. 4的0. 01M的PBS緩沖液重懸后，在PBS緩 沖液中透析過夜，即得到抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體。
[0013] 步驟（2)中膠體金溶液制備方法如下：將100mL0.Olwt%的氯金酸溶液，加熱煮沸 后，邊攪拌邊加入l_2mLlwt%檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變酒紅 色，至顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補(bǔ)足失水至100mL，無菌密封，4°C避光保存。
[0014] 所述的檢測(cè)線距離所述的結(jié)合墊6-8mm;所述的質(zhì)控線距離所述的吸水墊6-8mm， 所述的檢測(cè)線和所述的質(zhì)控線的寬度分別為1-1. 5mm，兩條線相距為5mm。
[0015] 所述的TNE緩沖液配制方法如下：Tris6. 0578g、NaCl12g、乙二胺四乙酸二鈉 1. 8612g，補(bǔ)足雙蒸饋水至1L，調(diào)節(jié)pH至8. 5,高壓滅菌； 所述的TM緩沖液配制方法如下：Tris6. 0578g、MgCl2 ? 6H20 2. 0338g，補(bǔ)足雙蒸餾水 至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的PBST緩沖液配制方法如下：NaCl8g、KC1 0? 2g、Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P04 0. 2g，500iiL吐溫-20,補(bǔ)足雙蒸饋水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的PBS緩沖液配制方法如下：NaCl8g、KC1 0? 2g、Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P04 0. 2g，補(bǔ)足雙蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸1. 095g，補(bǔ)足雙蒸餾水至 1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
[0016] 所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原的包被量為2-4iiL/cm;所述的兔抗雞卵 黃抗體的包被量為1-2yL/cm，所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原中含有濃度為ImM的苯甲基磺酰氟和5wt%的海藻糖作為蛋白酶抑制劑和抗原保護(hù)劑。
[0017]本發(fā)明選用甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒作為檢測(cè)線，抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病 毒特異性卵黃抗體作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用競(jìng)爭(zhēng)法來檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有甲魚系 統(tǒng)性敗血癥球狀病毒。通過待檢樣品中的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒與包被于硝酸纖維膜 上的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗 體一膠體金標(biāo)記物。若待檢樣品中甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的量高于試紙條的檢測(cè)限， 抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物與樣品中甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀 病毒全部結(jié)合，從而不與固定在硝酸纖維膜上的病毒結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶而顯陽性；若 待檢樣品中不含甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒或其量低于試紙條的檢測(cè)限，抗甲魚系統(tǒng)性敗 血癥球狀病毒卵黃抗體-膠體金標(biāo)記物不能與樣品中甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒全部結(jié) 合，這樣金標(biāo)抗體在層析過程中會(huì)被固定在硝酸纖維膜上的病毒結(jié)合而出現(xiàn)紅色條帶而顯 陰性。因此，若待測(cè)樣品試紙條的檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)紅色條帶，則判斷為陰性樣品； 若待測(cè)樣品試紙條檢測(cè)線不出現(xiàn)紅色條帶，同時(shí)質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶則判斷為陽性樣 品；若質(zhì)控線上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條無效。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 1、 檢測(cè)快速：整個(gè)檢測(cè)過程只需5-10分鐘，能夠滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要； 2、 檢測(cè)準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)：本反應(yīng)與其他病毒沒有交叉反應(yīng)，檢測(cè)準(zhǔn)確性能達(dá)到95% 以上，與操作復(fù)雜的ELISA結(jié)果相同； 3、 攜帶方便，操作簡(jiǎn)便：本發(fā)明改變了對(duì)甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的檢測(cè)必須由專 業(yè)人 4、 本發(fā)明的檢測(cè)試紙條制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，不需要任何特殊儀器、設(shè)備； 5、 本發(fā)明的檢測(cè)試紙條儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在4°C可有效保存半年以上； 6、 本發(fā)明的檢測(cè)試紙條不僅可以用于檢測(cè)動(dòng)物的各組織，也可以用于檢測(cè)血液和糞 便。
[0019] 甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒（Soft-shelledturtlesystemicsepticemia 8口1^1^〇31￥11'118,51555￥)，毒株為？1015株，保藏號(hào)為06110：吣.5378，于2011年10月21 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為硝酸纖維素 膜，4為吸收墊,5為檢測(cè)線,6為質(zhì)控線,7為條形底板； 圖2為本發(fā)明試紙條的制備工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0022] 具體實(shí)施例1 一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條，如圖1所示，該試紙條由條形底板7和在條形 底板7上依次搭接的樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3及吸水墊4 ;結(jié)合墊2上包被有抗 甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜3上分別設(shè)置有由甲魚系 統(tǒng)性敗血癥病毒抗原包被的檢測(cè)線5和由兔抗雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線6。
[0023] 上述抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物的制備方法如下：將抗 甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑15-30nm的膠體金溶液按6-8iig:lmL 混合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt%的牛血清白蛋白的 PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min去除未充分穩(wěn)定的膠體金 顆粒及其凝聚物，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未結(jié)合的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥 病毒卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一 膠體金標(biāo)記物。
[0024] 具體實(shí)施例2 快速檢測(cè)甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒膠體金試紙條的制備方法，如圖2所示，其具體 操作步驟如下： (1) 甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒的純化 取攻毒感染死亡的小甲魚，冰上解剖取其內(nèi)臟，稱量后按體積比（1 :5)_(1 :20)加入 預(yù)先冰浴過的含有ImM苯甲基磺酰氟（PMSF)的TNE緩沖溶液中勻漿，將勻漿液于4°C， 8000g離心20min，沉淀用含ImMPMSF的TNE緩沖液重新懸浮勻漿后再次于4°C，8000g離 心20min，合并兩次離心所得上清液，將上清液于4°C，6000g離心lOmin后，取上清液于 4°C，38000g離心1. 5h，用預(yù)冷TM緩沖液洗去沉淀上層疏松部分，取下層結(jié)實(shí)白色沉淀部 分用含ImMPMSF的預(yù)冷的TM緩沖液重懸后于4°C，3500g離心5min后，取上清液再次于 4°C，38000g離心1. 5h，用TM緩沖液洗去上層疏松部分，下層結(jié)實(shí)的白色沉淀再次用含ImM PMSF的預(yù)冷的TM緩沖液重懸后于4°C，3500g離心5min后，取上清液再次于4°C，38000g 離心1. 5h，用TM緩沖液洗去上層疏松部分，最終得到的下層結(jié)實(shí)的白色沉淀即為甲魚系統(tǒng) 性敗血癥球狀病毒抗原。該甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒（Soft-shelledturtlesystemic s印ticemiasphericalvirus，STSSSV)，毒株為P1015株，保藏號(hào)為CGMCCNo. 5378,于 2011 年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心； (2) 抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體的制備 取健康的初廣蛋的母雞作為免疫對(duì)象，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原和弗氏完 全佐劑等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進(jìn)行基礎(chǔ)免 疫，每只母雞免疫劑量為500-800yg/mL，15-20天后，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原 和弗氏不完全佐劑進(jìn)行等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞肌肉注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只母雞 免疫劑量為400-600yg/mL，加強(qiáng)免疫重復(fù)進(jìn)行三次，每次間隔時(shí)間為7-10天，進(jìn)行三次 免疫后收集雞蛋測(cè)定效價(jià)，當(dāng)卵黃抗體效價(jià)>1 :20000時(shí)收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸 銨沉淀法純化卵黃抗體。卵黃抗體的純化的具體方法如下：稱取適量卵黃，按1 :9加入乙 酸-乙酸鈉緩沖液（0.05M，pH5.0)，攪拌均勻后4°C靜置過夜，8000g離心20min，取上清 液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，10000g離心20min，沉淀用初始卵黃質(zhì) 量10-20倍的蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40 %，4°C攪拌過夜，10000g離心 20min，取沉淀用少量PBS溶液（0. 01M，pH7. 4)重懸，在PBS溶液中透析過夜，即得到抗甲魚 系統(tǒng)性球狀病毒卵黃抗體； (3) 膠體金標(biāo)記抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體的方法 用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金溶液。用新制的去離子水配制l〇〇mL0. 01 %的 氯金酸，加熱煮沸后，邊攪拌邊加入2mL1 %檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色 變黑變酒紅色，至顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補(bǔ)足失水至100mL，無菌密封，4°C 避光保存； 將抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為15-30nm的膠體金溶 液按6-8yg:lmL混合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min使其結(jié)合，加含10wt% 的牛血清蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心（2000-3500rpm，10-20min)去除未 充分穩(wěn)定的膠體金顆粒及其凝聚物，再高速離心（12000-15000rpm，l-l. 5h)去除未結(jié)合的 卵黃抗體，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一膠體 金標(biāo)記物；將所述的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物用含lwt%牛 血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0. 02wt%疊氮化鈉的pH7. 4的0. 01MPBS緩沖液 重懸至膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度； (4) 結(jié)合墊的包被 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 溫-20的0. 01MpH7. 4的PBS緩沖液中30min后，37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻璃 纖維紙上均勻噴涂10-20iiL抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物，真 空冷凍干燥l_2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫?(5) 樣品墊的處理 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 溫-20的0. 01MpH7. 4的PBS緩沖液中30min后取出，37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真空 封裝，4 °C保存?zhèn)溆茫?(6) 硝酸纖維膜的包被 將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成檢測(cè)線，包 被量為2-4yL/cm;將兔抗雞卵黃抗體用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線，包 被量為1-2UL/cm，即得到特定包被的硝酸纖維素膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C 保存?zhèn)溆?；其中檢測(cè)線與質(zhì)控線相互平行，所述的檢測(cè)線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近 吸水墊端；甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原中含有濃度為ImM的苯甲基磺酰氟（蛋白酶抑 制劑）和5wt%的海藻糖（抗原保護(hù)劑）； (7) 試紙條組裝 將樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、硝酸纖維膜（3)、吸水墊（4)按圖1所示的順序依次粘附在 條形底板（7)上，條形底板作為支撐載體，由下及上是由玻璃纖維紙組成的樣品吸收區(qū)，然 后是吸附了膠體金所標(biāo)記的卵黃抗體的玻璃纖維層，其次是硝酸纖維膜，在硝酸纖維膜與 條形底板之間為一高分子材料制成的背襯膜，來阻止粘合劑中的有機(jī)溶劑對(duì)硝酸纖維膜上 所包被抗體的破壞。最上一層是吸水層，由濾紙組成，外面用膠帶封住，成為手持部分。各 層之間均有1.5mm左右的重疊交叉。將試紙條切成4-6mm寬的小條，真空封裝，4°C保存。
[0025] 其中步驟（1)中采用的TNE緩沖液配制方法是：Tris6. 0578g、NaCl12g、乙二胺 四乙酸二鈉1. 8612g補(bǔ)足雙蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH至8. 5,高壓滅菌；TM緩沖液配制方法是：Tris6. 0578g、MgCl2 ? 6H20 2. 0338g補(bǔ)足雙蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌。
[0026] 步驟（2) (3) (4)、（5)中采用的PBS緩沖液配制方法是：NaCl8g、KCl0.2g、 Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P04 0? 2g補(bǔ)足雙蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌。
[0027] 步驟（3)中采用的PBST緩沖液配制方法如下：NaCl8g、KCl0? 2g、Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P04 0? 2g，500iiL吐溫-20,補(bǔ)足雙蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌。
[0028] 步驟（2)中的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸1. 095g，補(bǔ)足 雙蒸饋水至1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
[0029] 具體實(shí)施例3 膠體金試紙條對(duì)臨床樣品的檢測(cè)，具體步驟如下： 1、對(duì)組織樣品的檢測(cè) 取患病甲魚的組織樣品，將TNE緩沖液滴加于組織樣上，破碎組織，靜置5分鐘后，將檢 測(cè)試紙條插入待檢樣品中，10分鐘后觀察結(jié)果：只在試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅線者為陽 性，即樣品中帶有甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒；若試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)紅線者 為陰性。
[0030]2、對(duì)腹水樣品的檢測(cè) 取患病甲魚的腹水，將檢測(cè)試紙條插入待檢甲魚腹水樣品中，10分鐘后觀察結(jié)果。判斷 標(biāo)準(zhǔn)同1。
[0031] 3、對(duì)肝囊內(nèi)容物上清的檢測(cè) 取患病甲魚的肝囊內(nèi)容物，靜置取上清，將檢測(cè)試紙條插入待檢甲魚肝囊內(nèi)容物上清 樣品中，10分鐘后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)同1。
[0032]4、對(duì)血液樣品的檢測(cè) 對(duì)健康甲魚進(jìn)行攻毒感染試驗(yàn)，攻毒后48h，72h取其血清，將檢測(cè)試紙條插入待測(cè)甲 魚血清中，10分鐘后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)同1。
[0033] 5、對(duì)糞便樣品的檢測(cè) 收集患病甲魚糞便，用TNE緩沖液溶解糞便樣品后取上清，將檢測(cè)試紙條插入待檢樣 品中，10分鐘后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)同1。
[0034]6、對(duì)患病甲魚養(yǎng)殖池水的檢測(cè) 取患病甲魚養(yǎng)殖池池水，將檢測(cè)試紙條插入待檢樣品中，10分鐘后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn) 同1。
[0035] 7、對(duì)陰性樣品的檢測(cè) 將檢測(cè)試紙條插入不含甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒的雙蒸餾水中和健康甲魚血清中，10分 鐘后觀察結(jié)果，有兩條帶者為陰性。
[0036] 8、所有臨床樣品檢測(cè)結(jié)果用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)進(jìn)行比較。
[0037] 檢測(cè)結(jié)果見表1，我們可以看到患病甲魚的組織樣品，腹水樣品，肝囊內(nèi)容物上清 樣品，血清樣品以及糞便樣品均只有質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅線，即檢測(cè)結(jié)果均為陽性。對(duì)于不含 甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒的雙蒸餾水和健康甲魚血樣的檢測(cè)，結(jié)果試紙條的檢測(cè)線和質(zhì)控線 均出現(xiàn)了條帶，為陰性結(jié)果。所有檢測(cè)結(jié)果均與ELISA結(jié)果相同，兩者具有高度一致性。感 染48h后的甲魚血清顯示陽性結(jié)果，表明我們可以通過膠體金試紙條在甲魚患病初期進(jìn)行 檢測(cè)確定病因，從而對(duì)癥下藥，及時(shí)防治，防止病情擴(kuò)大，減少養(yǎng)殖戶損失，同時(shí)也可以作為 在苗種引進(jìn)時(shí)的一種初步篩選工具。而用膠體金試紙條檢測(cè)患病甲魚糞便可確定病因，更 是方便實(shí)用，養(yǎng)殖戶只需收集甲魚的糞便即可。
[0038] 表1甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒試紙條檢測(cè)臨床樣品結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條，其特征在于：所述的試紙條由條形底板和 在條形底板上依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水墊；所述的結(jié)合墊上包被有 抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物，所述的硝酸纖維素膜上分別設(shè)置有由 甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒抗原包被的檢測(cè)線和由兔抗雞卵黃抗體（IgY)包被的質(zhì)控線。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條，其特征在于所述的 抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物的制備方法如下：將抗甲魚系統(tǒng)性敗血 癥卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為15_30nm的膠體金溶液按6-8 y g : lmL混合后，在pH5. 4的 條件下攪拌振蕩30-60min，加含10wt%的牛血清白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低 速離心2000-3500rpm，10_20min，再高速離心12000-15000rpm，1-1. 5h，取離心管底部暗紅 色沉淀即得到抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征 在于包括以下步驟： (1) 樣品墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐溫-20 的0. 01M pH7. 4的PBS緩沖液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到樣品墊，真空封裝， 4 °C保存?zhèn)溆茫? (2) 特定包被的結(jié)合墊的制備 將玻璃纖維紙浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐溫-20 的0. 01M pH7. 4的PBS緩沖液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻璃纖維 紙上均勻噴涂10-20 y L的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物，真空 冷凍干燥l_2h，即得到結(jié)合墊，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆茫? (3) 特定包被的硝酸纖維素膜的制備 將甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成檢測(cè)線；將 兔抗雞卵黃抗體用點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維膜上形成質(zhì)控線，即得到特定包被的硝酸纖 維膜，真空冷凍干燥1-1. 5h，真空封裝，4°C保存?zhèn)溆?；其中檢測(cè)線與質(zhì)控線相互平行，所述 的檢測(cè)線靠近結(jié)合墊端，所述的質(zhì)控線靠近吸水墊端； (4) 試紙條的制備 將步驟（1)得到的樣品墊、步驟（2)得到的特定包被的結(jié)合墊、步驟（3)得到的特定包 被的硝酸纖維膜和吸水墊按序搭接并粘貼于底板上，裁成4-6mm寬的細(xì)條，即得甲魚系統(tǒng) 性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條，真空封裝，4°C保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征 在于所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原的制備方法如下：取攻毒感染死亡的小甲魚， 冰上解剖取其內(nèi)臟，稱量，按1 :5_1 :20加入預(yù)先冰浴過的含有ImM苯甲基磺酰氟（PMSF) 的TNE緩沖溶液中勻楽，將勻漿液于4°C，8000g離心20min，沉淀用含ImM PMSF的TNE緩 沖液重新懸浮勻漿后再次于4°C，8000g離心20min，合并兩次離心所得上清液，將上清液于 4°C，6000g離心lOmin后，取上清液于4°C，38000g離心1. 5h，用預(yù)冷的TM緩沖液洗去沉淀 上層疏松部分，取下層結(jié)實(shí)白色沉淀部分用含ImM PMSF的預(yù)冷的TM緩沖液重懸后于4°C， 3500g離心5min后，取上清液再次于4°C，38000g離心1. 5h，用TM緩沖液洗去上層疏松部 分，下層結(jié)實(shí)的白色沉淀再次用含ImM PMSF的預(yù)冷的TM緩沖液重懸后于4°C，3500g離心 5min后，取上清液再次于4°C，38000g離心1. 5h，用TM緩沖液洗去上層疏松部分，最終得到 的下層結(jié)實(shí)的白色沉淀即為甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征 在于所述的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物的制備方法如下： (1)抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體的制備 取健康的初產(chǎn)蛋的母雞作為免疫對(duì)象，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒抗原和弗氏完全佐 劑等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞的雙翅、雙腿、背部和胸肌部位肌肉注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫， 每只母雞免疫劑量為500-800ii g/mL，15-20天后，將甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒抗原和弗氏不 完全佐劑進(jìn)行等體積混合，充分乳化后對(duì)母雞肌肉注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只母雞免疫劑量 為400-600 y g/mL，加強(qiáng)免疫重復(fù)進(jìn)行三次，每次間隔時(shí)間為7-10天，然后收集雞蛋測(cè)定效 價(jià)，當(dāng)卵黃抗體效價(jià)>1 :20000時(shí)收集雞蛋，分離卵黃，用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體； (2)膠體金標(biāo)記抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥卵黃抗體 將抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒卵黃抗體與膠體金顆粒直徑為15-30nm的膠體金溶液 按6-8ii g :lmL混合，在pH5. 4的條件下通過攪拌振蕩30-60min，加含10wt%的牛血清 白蛋白的PBST緩沖液作為穩(wěn)定劑，采用低速離心2000-3500rpm，10-20min，再高速離心 12000-15000rpm，l-1.5h，取離心管底部暗紅色沉淀即得到抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒 卵黃抗體一膠體金標(biāo)記物，將所述的抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體一膠體金標(biāo)記 物是用含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、lwt%海藻糖，0. 02wt%疊氮化鈉的pH 7. 4的 0. 01M PBS緩沖液重懸至所述的膠體金溶液體積的1/10-1/20作為其工作濃度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，其特 征在于用飽和硫酸銨沉淀法純化卵黃抗體的具體方法如下：稱取適量步驟（1)分離得到的 卵黃，按體積比1 :9加入pH5.0的0.05M的乙酸-乙酸鈉緩沖液，攪拌均勻后4°C靜置過 夜，8000g離心20min，取上清液加入飽和硫酸銨至飽和度為40%，4°C攪拌6h，10000g離心 20min，沉淀用10-20倍卵黃質(zhì)量的雙蒸餾水重懸，加入飽和硫酸鈉至飽和度為40%，4°C攪 拌過夜，l〇〇〇〇g離心20min，沉淀用少量pH7. 4的0. 01M的PBS緩沖液重懸后，在PBS緩沖 液中透析過夜即得到抗甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒卵黃抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征 在于步驟（2)中膠體金溶液制備方法如下：將100mL 0. Olwt%的氯金酸溶液，加熱煮沸后， 邊攪拌邊加入l_2mL lwt%檸檬酸三鈉迅速搖勻，繼續(xù)加熱，溶液由淡黃色變黑變酒紅色， 至顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5-10min，冷卻后補(bǔ)足失水至100mL，無菌密封，4°C避光保存。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征 在于：所述的檢測(cè)線距離所述的結(jié)合墊6-8mm ;所述的質(zhì)控線距離所述的吸水墊6-8mm，所 述的檢測(cè)線和所述的質(zhì)控線的寬度分別為1-1. 5mm，兩條線相距為5mm。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，其特 征在于：所述的TNE緩沖液配制方法如下：Tris 6. 0578g、NaCl 12g、乙二胺四乙酸二鈉 1. 8612g，補(bǔ)足雙蒸饋水至1L，調(diào)節(jié)pH至8. 5,高壓滅菌； 所述的TM緩沖液配制方法如下：Tris 6. 0578g、MgCl2 ? 6H20 2. 0338g，補(bǔ)足雙蒸餾水 至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的 PBST 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KC1 0? 2g、Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P04 0. 2g，500 li L吐溫-20,補(bǔ)足雙蒸饋水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的 PBS 緩沖液配制方法如下：NaCl 8g、KC1 0? 2g、Na2HP04 ? 12H20 2. 9g、KH2P040. 2g，補(bǔ)足雙蒸餾水至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌； 所述的乙酸-乙酸鈉緩沖液配方如下：乙酸鈉2. 604g、冰乙酸1. 095g，補(bǔ)足雙蒸餾水至 1L，調(diào)pH至5. 0,高壓滅菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種甲魚系統(tǒng)性敗血癥病毒檢測(cè)試紙條的制備方法，其特 征在于：所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原的包被量為2-4 ii L/cm ;所述的兔抗雞卵 黃抗體的包被量為1-2 yL/cm，所述的甲魚系統(tǒng)性敗血癥球狀病毒抗原中含有濃度為ImM 的苯甲基磺酰氟和5wt%的海藻糖。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104459119SQ201410642350
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】章禮平, 李登峰, 劉聯(lián)國, 方靜, 徐然, 陳梅娟 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)