用于tnt檢測的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于TNT（2,4,6-三硝基甲苯）檢測的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器的制備方法，將對TNT特異性敏感的多肽與氧化石墨烯納米片共價交聯(lián)，實現(xiàn)了多肽的TNT特異敏感性和氧化石墨烯獨特光學(xué)性質(zhì)的結(jié)合。該方法構(gòu)建的交聯(lián)多肽的氧化石墨烯生物傳感器可穩(wěn)定、簡便地將TNT分子結(jié)合到氧化石墨烯納米片表面，從而引起其光學(xué)性質(zhì)的改變，導(dǎo)致傳感器紫外吸收光譜發(fā)生變化，進(jìn)而完成對目標(biāo)分子TNT的檢測。本發(fā)明制備的交聯(lián)多肽的氧化石墨烯生物傳感器靈敏度高，檢測下限低，特異性強且穩(wěn)定性好。
【專利說明】用于TNT檢測的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種傳感器件的制備技術(shù)，尤其涉及一種用于TNT (2，4，6-三硝基甲苯)特異性檢測的交聯(lián)多肽的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]氧化石墨烯是近年來一種熱門的碳納米片材料。其上豐富的含氧官能團(tuán)使其具有良好的親水性、獨特的光學(xué)性質(zhì)以及易于進(jìn)行生化修飾性等性質(zhì)，在生物傳感領(lǐng)域、熒光檢測領(lǐng)域和光電領(lǐng)域具有很大應(yīng)用價值。目前針對爆炸物如TNT (2，4，6-三硝基甲苯)和DNT ( 2，4-二硝基甲苯)等的檢測對公共安全和環(huán)境保護(hù)具有重要意義。在各類爆炸物檢測方法中，生物傳感器以其模擬生物系統(tǒng)的高靈敏度和可微型化引起了高度關(guān)注和廣泛研究。在眾多生物傳感器的敏感元件中，多肽作為一種可人工合成的生物識別分子，具有化學(xué)多樣性和特定的生物敏感性，可與多種物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)雜多樣的結(jié)合物并維持長時間的穩(wěn)定性和敏感性，因此成為一種理想的生物傳感器敏感元件。利用氧化石墨烯和多肽的這些優(yōu)勢，構(gòu)建一種新型的基于特定序列交聯(lián)多肽氧化石墨烯的光學(xué)生物傳感器，可以高靈敏、高特異性地穩(wěn)定地檢測爆炸物(TNT)，并在安全檢測、環(huán)境污染監(jiān)測等方面具有重要應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種用于TNT特異性檢測的交聯(lián)多肽的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器的制備方法。
[0004]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種用于TNT檢測的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(O氧化石墨烯納米片分散液的配置:取氧化石墨烯粉末分散在去離子水中，獲得Img/mL的氧化石墨烯分散液,然后進(jìn)行冰水浴超聲30分鐘,再以3000 r.p.m.的速度離心30分鐘,取上清液,即為良好分散的氧化石墨烯分散液；
(2)將多肽固定在步驟I得到的氧化石墨烯分散液中的氧化石墨烯上，得到交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液，該步驟通過以下子步驟來實現(xiàn):
(2.1)在氧化石墨烯分散液中依次加入EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)粉末和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)粉末，所述氧化石墨烯、EDC粉末和NHS粉末質(zhì)量比為1: 1: 1，然后冰水浴超聲I小時，得到懸濁液；
(2.2)向步驟2.1中得到的懸濁液中加入NaOH溶液調(diào)節(jié)液體pH至8.0 ;
(2.3)人工合成TNT敏感的多肽，其氨基酸序列為WHWQRPLMPVSI，分散在濃度為0.1 M的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，得到濃度為250 mg/mL的多肽溶液；將該多肽溶液加入步驟2.2得到的pH為8.0的懸濁液中，懸濁液與多肽溶液的體積比為10:1，4 ° C避光靜置過夜；
(2.4)取出避光保存的液體并以13000 r.p.m.離心30分鐘，取沉淀，用去離子水重復(fù)沖洗3次,再重新分散在去尚子水中，即可獲得交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液，將該分散液加入光譜儀即組成本發(fā)明用于TNT檢測的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器，分散液平時置于4°C條件下備用。
[0005]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明將特異序列多肽固定在氧化石墨烯納米片上，與光譜儀結(jié)合構(gòu)建了交聯(lián)多肽的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器。該方法構(gòu)建的交聯(lián)多肽氧化石墨烯生物傳感器實現(xiàn)了將多肽簡便并穩(wěn)定地固定在氧化石墨烯納米片上，檢測時，目標(biāo)分子TNT與多肽的特異性結(jié)合弓I起傳感器光學(xué)特性的改變，導(dǎo)致傳感器紫外吸收光譜相應(yīng)變化，實現(xiàn)對TNT的特異性光學(xué)檢測。該生物傳感器檢測特異性高、檢測下限低、穩(wěn)定性好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1為本發(fā)明交聯(lián)多肽的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器制備圖；
圖2為本發(fā)明交聯(lián)多肽氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器紫外吸收光譜表征圖；
圖3為本發(fā)明交聯(lián)多肽氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器分別檢測不同濃度的TNT分子溶液的紫外吸收光譜圖；
圖4為本發(fā)明交聯(lián)多肽的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器分別與不同濃度TNT溶液發(fā)生反應(yīng)后紫外吸收峰吸收度與TNT濃度之間的統(tǒng)計關(guān)系圖；
圖5為本發(fā)明交聯(lián)多肽氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器分別檢測不同濃度的DNT分子溶液的紫外吸收光譜圖；
圖6為本發(fā)明交聯(lián)多肽氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器分別檢測不同濃度的乙酸異戊酯氣味分子溶液的紫外吸收光譜圖；
圖7為本發(fā)明交聯(lián)多肽的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器分別檢測不同濃度TNT、DNT和乙酸異戊酯溶液得到的紫外吸收峰吸收度與物質(zhì)濃度之間的統(tǒng)計對比圖。

【具體實施方式】
[0007]以下結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0008]本發(fā)明用于TNT檢測的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
1、氧化石墨烯納米片分散液的配置
取5 mg Hmnmers法制得的純凈氧化石墨烯粉末加入5 mL去離子水中,加入冰水浴(O° C)中在40W功率下超聲30分鐘，使得氧化石墨烯在水中呈棕色片狀分散，再將該液體以3000 r.p.m.離心三十分鐘去除多余懸浮物質(zhì)，濾去少量沉淀，得到的離心上清液即為澄清的棕色氧化石墨烯分散液(約為I mg/mL)。
[0009]2、多肽在氧化石墨烯片上的固定
首先，向澄清的氧化石墨烯分散液中依次加入5 mg EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)和5 mg NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)，然后將獲得的混合物在冰水浴中超聲I小時，使氧化石墨烯片上的羧基與NHS結(jié)合成穩(wěn)定酯鍵，得到的膠狀懸濁液用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH到8.0，為后續(xù)的多肽交聯(lián)做準(zhǔn)備。
[0010]人工合成TNT敏感的多肽，其氨基酸序列為WHWQRPLMPVSI，分散在濃度為0.1 M的PBS溶液中，得到濃度為250 mg/mL的多肽溶液；將該多肽溶液加入上述pH為8.0的懸濁液中，懸濁液與多肽溶液的體積比為10:1，4 ° C避光靜置過夜，使多肽與混合液中的酯類物質(zhì)充分反應(yīng)，多肽上的氨基將與氧化石墨烯納米片上的羧基形成肽鍵，完成多肽與氧化石墨烯納米片的交聯(lián)。取出避光保存的液體并以13000 r.p.m.的速度離心30分鐘，將交聯(lián)多肽的氧化石墨烯納米片離心出來。得到的沉淀用去離子水重復(fù)沖洗3次，再以I mg/mL的濃度重新分散在去離子水中，即得交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液，該分散液與光譜儀結(jié)合即得本發(fā)明氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器，分散液置于4°C條件下備用。制備過程示意如圖1所示。
[0011]交聯(lián)多肽的氧化石墨烯的光學(xué)特性表征如下:
首先對步驟I中的氧化石墨烯分散液進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，將掃描的光譜作為對照，取200 μ L氧化石墨烯分散液加入光譜儀測試腔(石英皿)中，光譜儀可以采用海洋光學(xué)的USB2000+產(chǎn)品，具體測試參數(shù)為積分時間100 ms，掃描波長200 nm?400 nm，得到氧化石墨烯的紫外吸收光譜，一次測量結(jié)束后，先緩慢吸出上述測量溶液，然后加入400 μ L的去離子水，靜置5分鐘后緩慢吸出去離子水，該步驟重復(fù)3次，用于清洗上次測量殘留的混合溶液，再用氮氣吹干測量腔備用。再以光譜儀作為儀器平臺對步驟2得到的交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，向光譜儀測試腔中加入200 μ L交聯(lián)多肽氧化石墨烯分散液，對其在相同測試參數(shù)下進(jìn)行紫外光譜掃描，得到交聯(lián)多肽的氧化石墨烯紫外吸收光譜，一次測量結(jié)束后，先緩慢吸出上述測量溶液，然后加入400 μ L的去離子水，靜置5分鐘后緩慢吸出去離子水，該步驟重復(fù)3次，用于清洗上次測量殘留的混合溶液，再用氮氣吹干測量腔備用。將交聯(lián)多肽的氧化石墨烯的紫外吸收光譜與氧化石墨烯的紫外吸收光譜進(jìn)行比較，交聯(lián)多肽的氧化石墨烯的吸收峰相對氧化石墨烯的吸收峰有向長波長的偏移，即前者的吸收峰對應(yīng)的波長比后者的大，如圖2所示，證明本發(fā)明交聯(lián)多肽的氧化石墨烯生物傳感器構(gòu)建成功。
[0012]本發(fā)明基于交聯(lián)多肽的氧化石墨烯生物傳感器可用于特異性檢測ΤΝΤ，該應(yīng)用具體如下:
1.配制待測TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液:采用溶劑為無水甲醇、濃度為Img/mL的待測TNT標(biāo)準(zhǔn)忙備溶液稀釋配制 6 種濃度梯度(10_8 mg/mL> 1-7 mg/mL> 1-6 mg/mL> 1-5 mg/mL> 1-4 mg/mL和10_3 mg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，稀釋底液為無水甲醇；
2.檢測TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，建立光照波長-紫外吸收度曲線，具體包括如下子步驟:
2.1進(jìn)行空白對照溶液紫外吸收光譜的測量，選取無水甲醇作為空白對照的目標(biāo)檢測物，為了排除甲醇對氧化石墨烯片在溶液中分散的影響，交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液與無水甲醇的體積比為10:1，將按圖1流程制得的交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液200 μ L與20 μ L的無水甲醇均勻混合，再將該混合液加入到光譜儀的測量腔中，設(shè)置光譜儀測量參數(shù):積分時間100毫秒，平均次數(shù)50次，平滑度為10，掃描波長為20(T400 nm,以光譜儀為儀器平臺對該空白對照溶液進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，測量結(jié)束后，先緩慢吸出上述測量溶液，然后加入400 μ L的去離子水，靜置5分鐘后緩慢吸出去離子水，該步驟重復(fù)3次，用于清洗上次測量殘留的混合溶液；
2.2進(jìn)行TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的測量:向測量腔中加入交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液200μ L與20 μ L的1(T8 mg/mL的TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的均勻混合液，重復(fù)上述測量步驟用于TNT樣品溶液的紫外吸收光譜檢測；為了排除甲醇對氧化石墨烯片在溶液中分散的影響，交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液與TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的體積比同樣為10:1，因此得到的是10_9 mg/mL的TNT樣品溶液對應(yīng)的紫外吸收光譜，該光譜被連續(xù)重復(fù)測量3次，一次測量結(jié)束后，先緩慢吸出上述測量溶液，然后加入400 μ L的去離子水，靜置5分鐘后緩慢吸出去離子水，該步驟重復(fù)3次，用于清洗上次測量殘留的混合溶液；
2.3重復(fù)上述空白測量和TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的測量，直至完成10_7 mg/mLUO^6 mg/mL、10_5 mg/mL、10_4 mg/mL和10_3 mg/mL TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的測量，最終得到交聯(lián)多肽的氧化石墨烯生物傳感器與 6 個不同濃度(ICT9 mg/mL> 1-8 mg/mL> 1-7 mg/mL> 1-6 mg/mL> 1-5 mg/mL和10_4 mg/mL)下的TNT樣品溶液相互作用的紫外吸收光譜，如圖3所示；將每個濃度TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液重復(fù)測量3?5次，并統(tǒng)計每個濃度TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的紫外吸收峰對應(yīng)的吸收度，得到TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液濃度與其紫外吸收峰對應(yīng)吸收度之間的關(guān)系曲線y=a_bx，其中，X為TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液實際濃度(10_9?10_4 mg/mL)，y為紫外吸收峰對應(yīng)吸收度，a和b為常數(shù)。圖4所示為6個濃度TNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液重復(fù)4次測量后得到的紫外吸收峰吸收度統(tǒng)計結(jié)果，其中，吸收度數(shù)值點對應(yīng)紫外吸收峰吸收度4次測量平均值，圖上的標(biāo)準(zhǔn)誤差對應(yīng)根據(jù)4次測量吸收峰吸收度得到的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，從圖4可以看出本發(fā)明交聯(lián)多肽的氧化石墨烯生物傳感器的檢測下線為10_9 mg/mL，并且結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好；
3.檢測DNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和乙酸異戊酯氣味分子標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，驗證本發(fā)明交聯(lián)多肽的氧化石墨烯生物傳感器的特異性，具體包括以下子步驟:
3.1配制待測DNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液:采用溶劑為無水甲醇、濃度為I mg/mL的待測DNT標(biāo)準(zhǔn)忙備溶液稀釋配制 6 種濃度梯度(ICT8 mg/mL、ICT7 mg/mL、ICT6 mg/mL、ICT5 mg/mL、ICT4mg/mL和10_3 mg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，稀釋底液為無水甲醇；配制待測乙酸異戊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液:稱取I mg乙酸異戊酯加入I mL甲醇溶液中，配置濃度為I mg/mL的待測乙酸異戍酯標(biāo)準(zhǔn)忙備溶液，再稀釋配制6種濃度梯度(10_8 mg/mL、10_7 mg/mL、10_6 mg/mL、10_5 mg/mL、10_4 mg/mL和10_3 mg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,稀釋底液為無水甲醇。
[0013]3.2按照步驟2所述方法分別重復(fù)4次測量各濃度DNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和乙酸異戊酯氣味分子標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，得到DNT標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和乙酸異戊酯氣味分子標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的紫外吸收光譜圖，分別如圖5和圖6所示。進(jìn)而得到樣品溶液濃度-紫外吸收峰吸收度增長值柱狀統(tǒng)計圖，如圖7所示，其中，紫外吸收峰吸收度增長值為各溶液吸收峰吸收度數(shù)值平均值與空白對照溶液吸收峰吸收度數(shù)值之差，圖上的標(biāo)準(zhǔn)誤差對應(yīng)由各溶液4次重復(fù)測量得到的吸收度計算出的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，只有測量TNT時吸收度出現(xiàn)了明顯增長，證明了本發(fā)明交聯(lián)多肽的氧化石墨烯生物傳感器可以對TNT進(jìn)行特異性測量。
【權(quán)利要求】
1.一種用于TNT檢測的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (O氧化石墨烯納米片分散液的配置:取氧化石墨烯粉末分散在去離子水中，獲得Img/mL的氧化石墨烯分散液,然后進(jìn)行冰水浴超聲30分鐘,再以3000 r.p.m.的速度離心30分鐘,取上清液,即為良好分散的氧化石墨烯分散液； (2)將多肽固定在步驟I得到的氧化石墨烯分散液中的氧化石墨烯上，得到交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液，該步驟通過以下子步驟來實現(xiàn): (2.1)在氧化石墨烯分散液中依次加入EDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)粉末和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)粉末，所述氧化石墨烯、EDC粉末和NHS粉末質(zhì)量比為1: 1: 1，然后冰水浴超聲I小時，得到懸濁液； (2.2)向步驟2.1中得到的懸濁液中加入NaOH溶液調(diào)節(jié)液體pH至8.0 ; (2.3)人工合成TNT敏感的多肽，其氨基酸序列為WHWQRPLMPVSI，分散在濃度為0.1 M的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，得到濃度為250 mg/mL的多肽溶液；將該多肽溶液加入步驟.2.2得到的pH為8.0的懸濁液中，懸濁液與多肽溶液的體積比為10:1，4 °C避光靜置過夜；(2.4)取出避光保存的液體并以13000 r.p.m.離心30分鐘，取沉淀，用去離子水重復(fù)沖洗3次,再重新分散在去尚子水中，即可獲得交聯(lián)多肽的氧化石墨烯分散液，將該分散液加入光譜儀即組成本發(fā)明用于TNT檢測的氧化石墨烯光學(xué)生物傳感器，分散液平時置于4°C條件下備用。
【文檔編號】G01N33/22GK104407117SQ201410637351
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】劉清君, 張倩, 張迪鳴, 盧妍利, 姚瑤, 李爽 申請人:浙江大學(xué)