金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種 金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法, 涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法，其特征是利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2，F(xiàn)e2+催化H2O2產(chǎn)生羥自由基使金納米簇的熒光發(fā)生猝滅，從而表現(xiàn)出熒光發(fā)射光譜特征的變化，可以用于葡萄糖的檢測。在0.39~27.22μmol/L范圍內(nèi)金納米簇?zé)晒忖缰郸650與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系，檢測限為0.18μmol/L。本發(fā)明靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于食品、工業(yè)、環(huán)境及生命體系中葡萄糖的測定。
【專利說明】金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方 法，屬于分析化學(xué)及納米【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖是活細(xì)胞能量的主要來源，在生命過程中扮演著重要的角色。人體尿液或 者血液葡萄糖(血糖)濃度的異常變化是糖尿病或低血糖的診斷指標(biāo)。血糖濃度受神經(jīng)系統(tǒng) 和激素的調(diào)節(jié)而保持相對穩(wěn)定，當(dāng)這些調(diào)節(jié)失去原有的相對平衡時，則出現(xiàn)高血糖或低血 糖。血糖增高引起血糖增高的原因很多，除病理性原因外，也有屬生理變化者。因此，準(zhǔn)確、 快速測定血糖在臨床診斷方面意義重大。目前，測定葡萄糖的方法主要有葡萄糖氧化酶法、 己糖激酶法及干化學(xué)法。發(fā)展新的葡萄糖檢測手段仍然十分迫切。
[0003] 金納米簇（goldnanoclusters,AuNCs)是一種新型的突光納米材料，其具有尺 寸小、無毒、水溶性好、光穩(wěn)定性好、Stokes位移大、比表面積大、制備條件溫和、表面易于修 飾以及熒光性質(zhì)隨尺寸可調(diào)等突出優(yōu)點(diǎn)，是近年來的研究熱點(diǎn)，其已被廣泛應(yīng)用于催化、傳 感檢測、納米標(biāo)記、醫(yī)學(xué)成像和光電子學(xué)等領(lǐng)域。
[0004] 本發(fā)明以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米簇作為熒光探針，提供了一種簡便、 靈敏的葡萄糖檢測的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種以N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米簇為熒光探針的 葡萄糖的測定方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： (一）金納米簇?zé)晒獠牧系闹苽?以下過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。金納米 簇?zé)晒獠牧系闹苽浞椒ㄈ缦拢簩?. 6mL濃度為0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4mL濃度 為0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL濃度為0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中， 混勻，置于37°C恒溫水浴槽中反應(yīng)2. 5小時，反應(yīng)液由淺黃色變?yōu)闊o色。反應(yīng)結(jié)束后用截 留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進(jìn)行純化處理，純化后的金納米簇溶液放置于4°C冰 箱避光保存。
[0007](二）葡萄糖的測定 葡萄糖的測定分兩步進(jìn)行：（1)〇. 175毫升樣品溶液（HEPES，20mmol/LpH=7.4)加入 0. 025毫升濃度為0. 1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反應(yīng)30分鐘；（2)將0. 05毫升 濃度為〇. 9mmol/L的亞鐵離子（Fe2+)溶液(含40mmol/L硫酸）與0. 2毫升步驟(一）制備 的金納米團(tuán)簇溶液依次加入上述反應(yīng)液中，搖勻后置于25°C水浴鍋反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)結(jié) 束后，以355nm為激發(fā)波長，測定在650nm處的熒光強(qiáng)度值（F65CI)，通過F65(l標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行 葡萄糖的測定。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： (1)本發(fā)明基于葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H202,Fe2+催化H202產(chǎn)生羥自由基 (Fenton反應(yīng)）使金納米簇的熒光發(fā)生猝滅，從而表現(xiàn)出熒光發(fā)射光譜特征的變化，可以用 于葡萄糖的檢測。
[0009] (2)本發(fā)明使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米簇材料其制備過程快速、簡 便，不需要任何前修飾步驟。
[0010] (3)本發(fā)明所構(gòu)建的方法測定特異性好、靈敏度高，檢測限低至0. 18ymol/L。
[0011] (4)本發(fā)明所構(gòu)建的方法無需復(fù)雜的樣品前處理過程即可用于人血清葡萄糖的測 定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為金納米簇溶液在紫外燈下的外觀對照圖。圖中：（A)金納米簇溶液+ 0. 1 mg/mL葡萄糖氧化酶+ 100iimol/LFe2+;(B)金納米簇溶液+ 80iimol/L葡萄糖+ 0. 1 mg/mL葡萄糖氧化酶 + 100umol/LFe2+。
[0013] 圖2為金納米簇溶液的熒光發(fā)射光譜圖。圖中：（A)金納米簇溶液+ 0. 1mg/mL 葡萄糖氧化酶+ 100umol/LFe2+;(B)金納米簇溶液+ 80iimol/L葡萄糖+ 0. 1mg/mL 葡萄糖氧化酶+ 1〇〇Umol/LFe2+。
[0014] 圖3為葡萄糖氧化酶催化體系反應(yīng)時間對金納米簇溶液熒光強(qiáng)度的影響圖。（葡 萄糖的濃度為40iimol/L)。
[0015] 圖4為不同干擾物質(zhì)對金納米簇溶液熒光強(qiáng)度的影響圖。
[0016] 圖5為金納米簇溶液的熒光強(qiáng)度變化值（AF65(I)與葡萄糖濃度之間的線性關(guān)系 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明所述的HEPES指N-(2-羥乙基）哌嗪-N' -2-乙烷磺酸。本發(fā)明實(shí)例所用 的Fe2+溶液為任一現(xiàn)有技術(shù)公開的Fe2+溶液，其優(yōu)選為氯化亞鐵溶于40mM硫酸配制而成 的Fe2+溶液。
[0018] 實(shí)例 1 : 將0. 6mL濃度為0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液與0. 4mL濃度為0. 02g/L的氯金酸溶 液加入到4mL濃度為0. 08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37°C恒溫 水浴槽中反應(yīng)2.5h。反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進(jìn)行純化處理。 所得到的金納米簇溶液可見光下為無色，紫外燈照射下產(chǎn)生強(qiáng)烈的紅色熒光。4°C暗處保 存，能保持至少一個月的相對穩(wěn)定。
[0019] 實(shí)例 2: 〇. 175毫升濃度為80i!mol/L的葡萄糖溶液(含HEPES--N- (2-羥乙基）哌 嗪-N' -2-乙烷磺酸，濃度20mmol/L、pH=7. 4)加入0. 025毫升濃度為0. 1mg/mL的葡萄 糖氧化酶，置于25°C反應(yīng)30分鐘。將0.05毫升濃度為0.9mmol/L的Fe2+溶液(含40 mm〇l/L硫酸）與0. 2毫升實(shí)例1制備的金納米團(tuán)簇溶液依次加入上述反應(yīng)液中，搖勻后置 于25°C水浴鍋反應(yīng)10分鐘。在紫外燈下觀察，金納米簇溶液本身顯現(xiàn)紅色熒光（圖1中 的A)，而加入葡萄糖反應(yīng)之后金納米簇溶液紅色熒光發(fā)生猝滅（圖1中的B)。圖2為金納 米簇溶液（圖2中的A)和加入葡萄糖反應(yīng)之后金納米簇溶液（圖2中的B)的熒光發(fā)射光譜 圖。
[0020] 實(shí)例 3 : 〇. 175 毫升濃度為 40i!mol/L的葡萄糖溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入 0. 025 毫升濃度為〇. 1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反應(yīng)5~50分鐘。將0. 05毫升濃度為 0. 9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）與0. 2毫升實(shí)例1制備的金納米團(tuán)簇溶液依 次加入上述反應(yīng)液中，搖勻置于25°C水浴鍋反應(yīng)10分鐘。如圖3所示，葡萄糖氧化酶催 化反應(yīng)30分鐘后，金納米簇溶液熒光猝滅值△F65(l變化達(dá)到平穩(wěn)，故選擇葡萄糖氧化酶酶 催化反應(yīng)時間為30分鐘。
[0021] 實(shí)例 4: 〇. 175毫升濃度為40i!mol/L的葡萄糖溶液或濃度40i!mol/L的麥芽糖溶液或濃度 為400iimol/L的乳糖溶液或濃度為400iimol/L的果糖溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4) 加入0. 025毫升濃度為0. 1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反應(yīng)30分鐘。將0. 05毫升 濃度為〇. 9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）與0. 2毫升實(shí)例1制備的金納米團(tuán)簇 溶液依次加入上述反應(yīng)液中，搖勻后置于25°C水浴鍋反應(yīng)10分鐘，測定熒光強(qiáng)度值F65Q， 并計(jì)算出熒光猝滅值A(chǔ)F65(i。由圖4可知，僅有40ymol/L的葡萄糖可使金納米簇產(chǎn)生明 顯的熒光猝滅，說明本發(fā)明所建立的方法抗干擾能力強(qiáng)。
[0022] 實(shí)例 5 : 0.175毫升含不同濃度葡萄糖的溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入0.025毫升濃度 為0.1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反應(yīng)30分鐘。將0.05毫升濃度為0.9mmol/ L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸)與0. 2毫升實(shí)例1制備的金納米團(tuán)簇溶液依次加入上述 反應(yīng)液中，搖勻后置于25°C水浴鍋反應(yīng)10分鐘，測定熒光強(qiáng)度值F65(l。如圖5所示，隨著 葡萄糖濃度的不斷增大，熒光猝滅值八^ 5(|逐漸減小，在0.39~27.22iimol/L范圍內(nèi)AF65Q 與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系，檢測限為〇. 18ymol/L。
[0023] 實(shí)例 6 : 0.175 毫升濃度為 7.78iimol/L葡萄糖的溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入 0.025 毫升濃度為〇. 1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反應(yīng)30分鐘。將0. 05毫升濃度為0. 9 mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）與0. 2毫升實(shí)例1制備的金納米團(tuán)簇溶液依次加 入上述反應(yīng)液中，搖勻后置于25°C水浴鍋反應(yīng)10分鐘，測定熒光強(qiáng)度值F65(l。重復(fù)上述 步驟12次，得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)為1. 9%，表明本方法重現(xiàn)性良好。
[0024] 實(shí)例 7 : 取新鮮人血液，先用截留分子量為3000的超濾管進(jìn)行超濾，濾液用pH=7. 4的HEPES緩 沖液（20mmol/L)稀釋200倍，取0. 175mL稀釋液加入到0. 025毫升濃度為0. 1mg/mL的 葡萄糖氧化酶溶液中，置于25°C反應(yīng)30分鐘。將0.05毫升濃度為0.9mmol/L的Fe2+溶 液(含40mmol/L硫酸）與0. 2毫升實(shí)例1制備的金納米團(tuán)簇溶液依次加入上述反應(yīng)液中， 搖勻后置于25°C水浴鍋反應(yīng)10分鐘，測定熒光強(qiáng)度值F65(l。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，獲 得血樣中的葡萄糖含量。與標(biāo)準(zhǔn)方法測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明本發(fā)明所使用的方法與 標(biāo)準(zhǔn)方法無顯著性差異(表1)。
[0025]表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法，其特征是利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄 糖生成H202, Fe2+催化H202產(chǎn)生羥自由基使金納米簇的熒光發(fā)生猝滅，從而表現(xiàn)出熒光發(fā)射 光譜特征的變化，能用于葡萄糖的檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法，其特征是所使用的 N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米團(tuán)簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備： 將濃度為〇? 02、. 18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和濃度為0? f 0? 8 mol/L的氫氧 化鈉溶液加入到濃度為〇. 〇廣〇. 1 g/L的氯金酸溶液中，混勻，置于2(T70° C水浴恒溫反 應(yīng)(T3. 5小時，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進(jìn)行透析純化處理，得 到N-乙酰-L-半胱氨酸-金納米團(tuán)簇?zé)晒獠牧纤芤骸?br> 3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法，其特征是所使 用的N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米簇優(yōu)選采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的 方法制備：將濃度為0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和濃度為0. 5 mol/L的氫 氧化鈉溶液加入到濃度為0.02 g/L的氯金酸溶液中，混勻，置于37° C水浴恒溫反應(yīng)2.5 小時，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進(jìn)行透析純化處理，得到N-乙 酰-L-半胱氨酸-金納米簇?zé)晒獠牧纤芤骸?br> 4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法，其特征是利用 N-乙酰-L-半胱氨酸保護(hù)的金納米簇在650 nm處的發(fā)射光強(qiáng)度值（F65CI)以判斷葡萄糖含 量，所使用的激發(fā)波長為355 nm。
5. -種金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法，包括如下步驟：1)將含不同濃度葡萄 糖的溶液，所述葡萄糖溶液中含有濃度為20 mmol/L、pH=7. 4的HEPES，加入葡萄糖氧化酶 溶液中，然后置于25° C反應(yīng)5?50分鐘；2)將含有濃度為40 mmol/L硫酸的Fe2+溶液與金 納米團(tuán)簇溶液依次加入步驟1)的反應(yīng)液中，搖勻后置于25° C水浴鍋反應(yīng)1~15分鐘，測定 熒光強(qiáng)度值F65(l，隨著葡萄糖濃度的不斷增大，F(xiàn)65(l逐漸減小，在0. 39~27. 22 y mol/L范圍 內(nèi)熒光猝滅值A(chǔ) F65(l與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系，檢測限為0. 18 y mol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法，其特征是步驟1)所 使用的葡萄糖氧化酶的濃度為〇. 1 mg/mL，反應(yīng)時間為30分鐘；步驟2)所使用Fe2+溶液的 終濃度為100 U mol/L，反應(yīng)時間為10分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的金納米簇為熒光探針的葡萄糖測定方法，其特征是葡萄 糖溶液，葡萄糖氧化酶溶液，F(xiàn)e2+溶液，金納米簇溶液按體積比7 :1 :2 :8混合，反應(yīng)總體積 為 0? 45 mL。
8. -種金納米簇為熒光探針的血糖測定方法，包括如下步驟，1)取新鮮人血液，經(jīng)超 濾處理后用pH=7. 4的緩沖液稀釋，取0. 175 mL稀釋液加入到0. 025毫升濃度為0. 1 mg/mL 的葡萄糖氧化酶溶液中，置于25° C反應(yīng)30分鐘；2)將0. 05毫升濃度為0. 9 mmol/L的含 有40 mmol/L硫酸的Fe2+溶液與0. 2毫升金納米團(tuán)簇溶液依次加入上述步驟1)的反應(yīng)液 中，搖勻后置于25° C水浴鍋反應(yīng)10分鐘，測定熒光強(qiáng)度值F65(l，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量， 獲得血樣中的葡萄糖含量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5或8所述的金納米簇為熒光探針的血糖測定方法，其特征是所使用 的金納米簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸還原氯金酸的方法制備：將0. 6 mL濃度為0. 5 mol/ L的氫氧化鈉溶液與0. 4 mL濃度為0. 02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL濃度為0. 08 mol/ L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混勻，置于37° C恒溫水浴槽中反應(yīng)2. 5 h，反應(yīng)液由淺 黃色變?yōu)闊o色，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液進(jìn)行純化處理，純化后 的金納米簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的金納米簇為熒光探針的血糖測定方法，其特征是所述的新 鮮人血液用截留分子為3000的超濾管離心超濾，濾液用pH=7. 4的HEPES緩沖液稀釋200 倍后測定。
【文檔編號】G01N21/64GK104330393SQ201410614781
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】陳偉, 鄧豪華, 何棟, 許延瑜, 孫世杰 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)