用于分析血液樣品的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】公開了用于分析血液樣品的方法、系統(tǒng)、以及計算機程序產(chǎn)品。一個實施方式是對血液樣品中難以血影化細胞進行檢測并計數(shù)的方法。另一個實施方式是分析血液樣品中網(wǎng)織紅細胞的方法。還提供了使用血細胞計數(shù)參數(shù)的方法。
【專利說明】用于分析血液樣品的方法和系統(tǒng) 本申請是申請日為2010年3月25日、申請?zhí)枮?01080065796. 9 (國際申請?zhí)枮镻CT/ US2010/028683)、名稱為用于分析血液樣品的方法和系統(tǒng)的發(fā)明專利申請的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一般涉及通過使用顆粒分析儀來分析血液樣品的方法和系統(tǒng)，更多具體地 講，涉及確定網(wǎng)織紅細胞和難以血影化（hard-to-ghost)細胞的方法和系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 每年，有幾百萬的美國人會受到血液病的影響。血液病理學(xué)的例子包括：多種血液 學(xué)惡性腫瘤，比如白血病和淋巴瘤；血紅蛋白病，其包括許多種源于遺傳的貧血癥，比如地 中海貧血、庫利（Cooley)病、以及鐮刀形紅細胞性貧血（HbS?。?；以及多種凝血和出血病 癥。血液異常還可以是與其他疾病比如HIV/AIDS、惡性腫瘤、以及自身免疫紊亂有關(guān)的次級 后果。這些疾病中的大部分具有顯著的病態(tài)和死亡率，并且通常會引起受影響的病人中嚴(yán) 重的疼痛。這些紊亂的早期診斷很關(guān)鍵，以使得罹患該疾病的病人能夠接受適當(dāng)?shù)奶幚砗?疾病治療。
[0003] 血液是特殊的體液，其可向身體中的細胞輸送必需的物質(zhì)比如營養(yǎng)和氧氣，并且 從這些相同的細胞中運出廢物。血液中這種主要細胞是紅細胞，即紅血細胞或者紅細胞。在 外周血涂片中，紅細胞由蛋白質(zhì)血紅蛋白衍生了它們的微紅色，并且通常呈現(xiàn)具有染色暗 淡的中心區(qū)域的球形或者橢圓形。它們的兩面凹的形態(tài)增加了細胞的表面積，并且有助于 氧和二氧化碳從細胞中的擴散。典型的紅細胞的壽命為約120天。
[0004] 紅細胞由在骨髓中具核的前體細胞發(fā)展而來。未成熟的紅細胞，即，網(wǎng)織紅細胞， 具有細胞器，這些細胞器對于提高血紅蛋白含量和氣體攜載能力有貢獻。當(dāng)特殊的染色被 用于染色網(wǎng)織紅細胞的多聚核糖體或者核糖核酸（RNA)時，能夠在外周血涂片中識別出網(wǎng) 織紅細胞。在典型的狀況下，網(wǎng)織紅細胞在樣品中占紅血細胞的大約1-2%。然而，在身體 需要的特定周期期間，網(wǎng)織紅細胞計數(shù)可以上升。
[0005] 血液測試能夠被用于確定生理學(xué)和生物化學(xué)狀態(tài)比如疾病、礦物質(zhì)含量、藥物效 力、以及器官功能。在證實或者幫助證實疾病比如各種形式貧血癥或者急性內(nèi)出血的診斷 中，網(wǎng)織紅細胞的確定可能是至關(guān)重要的。
[0006] 自動網(wǎng)織紅細胞分析能夠通過使用顆粒分析儀比如流式細胞儀或者血液分析儀 而進行。顆粒分析儀的例子包括，購自貝克曼考爾特公司的UniCcf DxH800系統(tǒng)和購自 Sysmex公司的XT-2000。用于流式細胞計數(shù)或者血液學(xué)分析的血液樣品的制備通常涉及到 下述步驟：獲取全血樣品，進行用活體染料比如新亞甲基藍（NMB)孵育血液樣品的步驟和 用可去除血紅蛋白的低滲性酸稀釋血液樣品的步驟中的一個步驟或者兩個步驟。所述染 色可沉淀出紅細胞內(nèi)部的RNA。用低滲性酸染色可去除使血紅蛋白，留下細胞內(nèi)被染色的 RNA。除去血紅蛋白的該方法通常被稱作"血影（化）（ghosting)"。然后使該血液樣品或 其部分經(jīng)受在顆粒分析儀的流式池中的分析。典型地，鞘液體（sheath fluid)中的細胞一 個接一個地經(jīng)過流式池中的點，它們在該點處被一種以上光束探詢。對于每個經(jīng)過的細胞 產(chǎn)生幾個測量值。單個細胞的探詢（interrogation)被稱為細胞事件（cell event)。每個 細胞事件通常所記錄的測量值包括正向光散射、軸向光損失、以及熒光。一些顆粒分析儀還 收集直流阻抗（DC)測量值，其是細胞施加多少阻抗的測量。該DC測量值是通過施加使得 細胞膜不被滲透、并且沒有電流穿過細胞時的最大電流而得到的，也被稱為Coulter體積 或容積。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本申請針對的是顆粒分析儀數(shù)據(jù)的分析。在一種實施方式中，對血細胞樣品中的 難以血影化細胞進行計數(shù)的自動方法可能包括：將血細胞樣品與核酸染色劑和血影化試劑 相混合，以便從紅血細胞中除去血紅蛋白，借此產(chǎn)生經(jīng)血影化處理的血細胞樣品；使經(jīng)血影 化處理的血細胞樣品穿過細胞計數(shù)流動池 （cytometric flow cell);通過使用兩種不同的 光學(xué)測量法，分析細胞計數(shù)流動池中的經(jīng)血影化處理的血細胞樣品；通過檢測兩種不同的 光學(xué)測量值，區(qū)分難以血影化細胞；以及對難以血影化細胞進行計數(shù)。
[0008] 在另一個實施方式中，分析血液樣品的方法可能包括：通過包含軸向光損失測量 的檢測，測量流動池中的血液樣品，從而產(chǎn)生事件數(shù)據(jù)；以軸向光損失測量為基礎(chǔ)，利用事 件數(shù)據(jù)，識別難以血影化細胞種群；從所述事件數(shù)據(jù)中濾出（filter-out)難以血影化細胞 種群；以及分析事件數(shù)據(jù)，以便識別血細胞分布模式。在濾出難以血影化細胞之后，能夠進 行包含網(wǎng)織紅細胞分析的分析。
[0009] 在一些實施方式中，分析血液樣品的方法可能包括如下步驟：利用通過軸向光損 失測量法產(chǎn)生的事件數(shù)據(jù)，對難以血影化細胞的種群進行計數(shù)。在一種實施方式的實例中， 能夠以難以血影化細胞占全體紅血細胞種群的％進行報告。所述數(shù)值可以用作僅供研究使 用（RU0)的參數(shù)、或者可以被拓展成體外診斷的（IVD)參數(shù)。
[0010] 在另一種實施方式中，對血細胞樣品中的難以血影化細胞進行計數(shù)的自動方法可 能包括：將血細胞樣品與核酸染色熒光染料和血影化試劑相混合，其中所述核酸染色熒光 染料用于對含有核酸的血細胞進行染色，所述血影化試劑用于從血細胞樣品的紅血細胞中 除去血紅蛋白，借此產(chǎn)生經(jīng)血影化處理的血細胞樣品；使經(jīng)血影化處理的血細胞樣品穿過 細胞計數(shù)流動池；通過使用光散射測量法和熒光測量法，分析細胞計數(shù)流動池中的經(jīng)血影 化處理的血細胞樣品；通過檢測熒光測量值和光散射測量值，將難以血影化細胞與熒光染 色后的含有核酸的細胞和血影細胞區(qū)分開來；以及對難以血影化細胞進行計數(shù)。
[0011]以下參考附圖，對本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點、以及其各種實施方式的結(jié)構(gòu)與操作 進行詳細的描述。應(yīng)注意，本發(fā)明不局限于在此描述的特定實施方式。在此描述的這些實 施方式僅用于示例性目的。以在此包含的教導(dǎo)為基礎(chǔ)，附加的實施方式對于本領(lǐng)域技術(shù)人 員而目是顯而易見的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是使用流式細胞儀對血液樣品進行分析所得到的事件數(shù)據(jù)視圖，是兩維的。
[0013] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式分析血液樣品中未成熟網(wǎng)織紅細胞中的步驟。
[0014] 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式的圖2中所示預(yù)處理步驟的更多細節(jié)。
[0015] 圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式的圖2中所示測量步驟的更多細節(jié)。
[0016] 圖5(A)和5(B)是來自血液樣品分析的事件數(shù)據(jù)的二維視圖。圖5(B)是除去了 難以血影化細胞種群的圖5(A)所示事件數(shù)據(jù)的視圖。
[0017] 圖6顯示了與圖5㈧所示相同的事件種群，但是其使用軸向光損失（ALL)和 UMALS來代替常規(guī)的DC和UMALS。
[0018] 圖7(A-C)顯示了幾個顯示事件數(shù)據(jù)的二維視圖，它們具有識別難以血影化細胞 種群的變化能力。
[0019] 圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式的圖2中所示測量步驟的更多細節(jié)。
[0020] 圖9是根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式的一個用于評估未成熟網(wǎng)織紅細胞的系統(tǒng)。
[0021] 圖10(A)顯示了通過對來自健康個體的血液樣品進行分析所得到的事件數(shù)據(jù)的 三維視圖。在視圖中可以清楚地區(qū)分難以血影化細胞1010、成熟紅血細胞1020、以及網(wǎng)織 紅細胞1030。
[0022] 圖10(B)顯示了通過對來自診斷有鐮刀形紅細胞貧血病的病人的血液樣品進行 分析所得到的事件數(shù)據(jù)的三維視圖。在視圖中可以清楚地區(qū)分難以血影化細胞1010、成熟 紅血細胞1020、以及網(wǎng)織紅細胞1030。
[0023] 圖10(C)顯示了通過對來自診斷有地中海貧血的病人的血液樣品進行分析所得 到的事件數(shù)據(jù)的三維視圖。在視圖中可以清楚地區(qū)分難以血影化細胞1010、成熟紅血細胞 1020、以及網(wǎng)織紅細胞1030。
[0024] 圖11顯示了從健康個體中抽取的血液樣品中的"難以血影化"細胞的平均百分 比。
[0025] 圖12顯示了從罹患各種疾病的病人中抽取的血液樣品中的"難以血影化"細胞的 平均百分比。
[0026] 基于下文闡述的【具體實施方式】，結(jié)合附圖，本發(fā)明的特征和優(yōu)點將變得更加顯而 易見。在附圖中，比如附圖標(biāo)記通常表示相同的、功能類似的、和/或結(jié)構(gòu)類似的組成部分。 一般來講，其中組成部分首先出現(xiàn)的附圖的編號被表示為對應(yīng)的附圖標(biāo)記中最左邊的數(shù) 字。

【具體實施方式】
[0027] 本發(fā)明涉及顆粒分析數(shù)據(jù)處理。雖然在此參考用于特殊應(yīng)用的示例性實施方式對 本發(fā)明進行了描述，但應(yīng)理解本發(fā)明并不限于這些實施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)此處 的教導(dǎo)，將認識到在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)有附加的變型、應(yīng)用、以及實施方式，并且認識到 本發(fā)明在其他領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用。 概要
[0028] 如上文【背景技術(shù)】描述的那樣，確定血液樣品中紅血細胞的分布的自動化能力對于 數(shù)種應(yīng)用而言是重要的能力。在此公開的方法和系統(tǒng)可產(chǎn)生一種改善的測量血液樣品中細 胞群的自動化測量方法。在一種實施方式中，使用在此提供的方法，可區(qū)分難以血影化細 胞，并且進行計數(shù)。
[0029] 可以實施本發(fā)明的示例性環(huán)境包括顆粒分析儀，比如貝克曼考爾特公司的 UniCel8' DxH800系統(tǒng)。該UniCeP DxH800系統(tǒng)，例如使用考爾特公司的專利Volume (容 積）Conductivity (電導(dǎo)率）、以及LightScatter (光散射）（VCS)技術(shù)來評估在流動池內(nèi) 部被水動力集中的細胞。VCS采用下述三個獨立的彼此和協(xié)地工作的能源，用于細胞測量： 低頻直流電源，用于測量容積；高頻電源，用于測量電導(dǎo)率；激光源，用于測量散射。利用考 爾特（Coulter)的電阻抗原理，進行體積測量，用于物理地測量等滲稀釋劑中的全部細胞 替代物（displace)體積。該方法可精確地根據(jù)大小劃分所有的細胞類型，不管它們在光程 中如何定向。射頻（RF)范圍內(nèi)的交流電使細胞膜的雙極性脂質(zhì)層發(fā)生短路，允許能量穿透 細胞。這種強力的方法被用于收集有關(guān)細胞大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息，包括化學(xué)成分和細胞 核體積。激光和多角度光散射檢測器可提供有關(guān)細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、顆粒性、以及表面形態(tài)的信 息。另外，VCS裝置采用高精確度的體積DC測量法以便得到其它測量值，所述測量值由電 導(dǎo)率和散射值被調(diào)整用于細胞大小。然而，應(yīng)注意，在本公開中的教導(dǎo)并不局限于使用VCS 技術(shù)的裝置。
[0030] 圖1顯示了以事件數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的血液樣品的二維散布圖，所述事件數(shù)據(jù)是由使用 顆粒分析儀進行血液測量而產(chǎn)生的。在散布圖中出現(xiàn)的每一個數(shù)據(jù)點都是以選出的由一個 細胞事件獲得的測量值為基礎(chǔ)，其中細胞事件是單個細胞被流動池中的電流和激光光束探 詢（interrogation)。通常在血液樣品中發(fā)現(xiàn)的不同細胞類型的事件數(shù)據(jù)種群被顯示在散 布圖中。一般來講，充分的分離存在于作為整體的紅細胞種群（即，紅細胞102和網(wǎng)織紅細 胞104)、血小板108種群、以及白細胞106種群之間，已知的技術(shù)允許將紅細胞種群作為整 體進行門控（gating)，例如，基于被直線122和直線124限定的區(qū)域進行門控。門控指的是 從多參數(shù)數(shù)據(jù)中過濾選擇的測量值的過程，例如，如上所述，通過相對于已知的閾值，對每 個細胞事件所產(chǎn)生的測量值進行檢驗來分離紅細胞（紅血球和網(wǎng)織紅細胞）、血小板和白 細胞。例如，線124可能是閾值體積數(shù)值而線122可能是閾值光散射數(shù)值，其中使用高于線 124的體積測量值和小于線122的光散射數(shù)值（經(jīng)常以Log光散射值的形式使用）的細胞 事件要么對應(yīng)于紅細胞、要么對應(yīng)于網(wǎng)織紅細胞。在現(xiàn)有的系統(tǒng)中，網(wǎng)織紅細胞種群例如還 可以通過細胞系比如線130進行門控。在線130右邊的事件是網(wǎng)織紅細胞，反之，在線130 左邊的事件是成熟紅細胞。 分析網(wǎng)織紅細胞
[0031] 在一個方面，提供了用于分析血液樣品中網(wǎng)織紅細胞的方法。圖2是在根據(jù)本發(fā) 明的一種實施方式評估網(wǎng)織紅細胞中的步驟流程圖。在步驟202中，制備血液樣品，用于在 顆粒分析儀中進行分析。該制備可能包括血影化血液樣品并且/或者用合適的染料或染色 劑對樣品進行染色。圖3進一步詳細地顯示了根據(jù)一個實施方式的制備步驟202。在步驟 302中，血液樣品能夠與活體染料結(jié)合以便進一步描繪網(wǎng)織紅細胞。例如，能夠使用可沉淀 出網(wǎng)織紅細胞的胞內(nèi)核糖核酸（RNA)的非熒光性染料。合適的染色劑的例子包括，但不限 于，新亞甲基藍（被稱為Coulter Retie Pak?的試劑A)、噁嗪750、以及亮甲酚藍。已經(jīng)被 沉淀的RNA將會具有高密度，這將增強對于每個細胞中RNA含量的描繪。使用非熒光染料來 測量網(wǎng)織紅細胞具有附加的優(yōu)點，允許血液樣品必要時可通過利用熒光染料而被進一步分 析其他的組分。合適的突光染料的例子包括，但不限于，噻唑橙（thiazole orange)和聚甲 川（polymethine)。附加的準(zhǔn)備性步驟在本發(fā)明中可以呈各種實施方式。例如，在一些實施 方式中，熒光染料能夠與血液樣品結(jié)合，以便通過使用熒光測量法來測量樣品的附加性能。 [0032] 為了進一步實施血液樣品的成分的檢查，能夠?qū)⒀簶悠放c試劑相結(jié)合，該試劑 比如是含有硫氰酸鉀和硫酸的網(wǎng)織紅細胞血影化溶液（步驟304)?？梢缘玫阶鳛樯唐返脑?類型的血影化試劑，該商品是被稱為Coulter Retie Pak?的試劑B。也可以使用已為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知的其他血影化試劑。該血影化過程可釋放紅血細胞中的血紅蛋白，得到 血影細胞。在此使用的術(shù)語"血影細胞"指的是已除去了其大約70%的血紅蛋白含量的紅 血細胞。優(yōu)選該細胞中超過90%、更優(yōu)選超過95%的血紅蛋白已被除去。換句話說，血影 細胞僅保留了少于其30%的初始血紅蛋白。血紅蛋白含量的下降可增強網(wǎng)狀組織的限定， 從而允許進行網(wǎng)織紅細胞的細胞計數(shù)流式測定。更具體地講，紅血細胞中血紅蛋白含量的 下降使得當(dāng)通過包含光散射和DC的非熒光性方法進行測量時能夠進行網(wǎng)織紅細胞與成熟 RBC的區(qū)分。
[0033] 除了有利于血紅蛋白的釋放之外，血影化過程還可以球形化紅血細胞從而使所 述細胞具有更規(guī)則的形狀，并且因此允許進行更可預(yù)測的光散射測量。天然的網(wǎng)織紅細 胞具有不規(guī)則的形狀，當(dāng)經(jīng)受光束時，可產(chǎn)生不可預(yù)知的光散射信息。紅血細胞的球形 化可提供可再現(xiàn)的光散射信息，該信息可形成用于確定樣品中網(wǎng)織紅細胞的基礎(chǔ)。在一 些實施方式中，使血液樣品與球形化試劑相結(jié)合或許是有利的。使用的球形化試劑的量 有效地引起網(wǎng)狀紅細胞和紅血細胞定容地球形化，以便除去在網(wǎng)織紅細胞分析中的定向 性人為因素。在一些實施方式中，球形化試劑是兩性離子表面活性劑，其可定容地球形 化紅血細胞。適合本發(fā)明的球形化試劑的例子包括，但不限于：月桂酸酰胺丙基甜菜堿 (lauroamidopropylbetaine)、椰油酸醜胺丙基甜菜喊（cocoamidopropylbetaine)和椰油 酸酰胺硫代甜菜堿（cocoamidosulfobetaine)。
[0034] 此前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，血影化過程受溫度的影響。低于55° F的溫度會出現(xiàn)血影化過 程延遲，并且需要比較長的時間周期以便允許血影化過程發(fā)生。在一些實施方式中，在 至少55°的溫度下將血液樣品與血影化溶液混合大約30秒鐘。在一種實施方式中，在 106° F(41°C )下進行血液樣品的血影化。
[0035] 在一些實施方式中，血影化溶液的pH應(yīng)該不高于3. 0。在一種實施方式中，血影化 的溶液pH是大約1. 0至2. 0。另外，似乎是酸性的血影化溶液可增溶血紅蛋白并且促進其 從血細胞中的去除。已經(jīng)注意到，當(dāng)利用硫氰酸鉀時，硫酸是優(yōu)選的在組合物中使用的酸。 硫氰酸鉀的優(yōu)選濃度是大約1. 〇至6. 0克每升，并且硫酸的優(yōu)選濃度是大約0. 7至3. 0克 每升。
[0036] 應(yīng)該控制血影化溶液的滲透壓以便使血細胞可進行快速的、但受控制的溶脹。血 影化溶液的滲透壓應(yīng)該是至少大約75毫滲透壓克分子。該滲透壓可引起血細胞在與血影 化溶液混合三十（30)秒鐘內(nèi)溶脹并釋放血紅蛋白。如果滲透壓小于大約75毫滲透壓克分 子，那么血細胞將不能保留完整的細胞膜，并且將會溶解。更具體地講，較低的滲透壓會導(dǎo) 致紅細胞受損害，以致于網(wǎng)織紅細胞計數(shù)不可靠。如果滲透壓不足，則血細胞將會保留血紅 蛋白，這將會使網(wǎng)織紅細胞的區(qū)分變得模糊。在一些實施方式中，血影化溶液的滲透壓的范 圍是大約75至大約110毫滲透壓克分子。在其他實施方式中，血影化溶液的滲透壓在大約 82至大約105毫滲透壓克分子的范圍內(nèi)。
[0037] 返回到圖2,在步驟204中，使用顆粒分析儀來分析血液樣品。在一種實施方式 中，顆粒分析儀是血液分析儀。例如，將血液樣品、或其一部分導(dǎo)入顆粒分析儀中。在流體 動壓力下，血液樣品流動，細胞逐個地經(jīng)過流動細胞。在流動池內(nèi)，測量單個細胞的數(shù)個參 數(shù)。例如，采用VCS技術(shù)的顆粒分析儀能夠同時地對每個細胞進行細胞的體積大小、細胞的 電導(dǎo)率、以及光散射的測定。圖4是根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式中步驟204進一步詳細描 述的流程圖。
[0038] 在步驟402中，將步驟202中制備的血液樣品導(dǎo)入流動池中用于分析。在步驟 404中，在一種實施方式中，當(dāng)樣品流動時,細胞逐個地通過流動池中的探詢點，樣品被來自 三個獨立源的能量所探詢。在步驟406中，對于每個細胞事件，記錄光散射測量值。當(dāng)RNA 含量隨著網(wǎng)織紅細胞的成熟而降低時，據(jù)預(yù)期光散射測量值會下降。數(shù)種光散射測量法可 能是可利用的，例如，但不限于，包括正向光散射測量法。正向散射可測量經(jīng)過被探詢的細 胞、并且偏離光束軸的光。正向光散射的實例包括，但不限于，低中值角度（lower median angle)光散射（LMALS)、上中值角度（upper median angle)光散射（UMALS)、以及低角度 (low angle)光散射（LALS)。LMALS指的是在相對于光束軸9° -19°角度處的光散射值， UMALS指的是在相對于光束軸20° -43°角度處的光散射，LALS指的是在相對于光束軸大 約5. Γ角度處的光散射。另一種光散射測量值一側(cè)角光散射（SALS)，能夠測量在90°角 度處的光散射。在一些實施方式中，血液樣品的分析將包括軸向光損失（ALL)的測量。ALL 是在相對于光束軸大約0°至0.5°角度處的光損失的量。
[0039] 在步驟408中，收集作為網(wǎng)織紅細胞成熟的另一種測量值。例如，在本發(fā)明的一種 實施方式中，能夠測量細胞的尺寸。細胞的大小已知隨著網(wǎng)織紅細胞的成熟而減小，一般來 講，由于RNA含量下降。作為一個實例，細胞的尺寸、或細胞體積，能夠通過使用DC測量法 而被測量。DC波的峰值振幅是細胞體積的函數(shù)。在該步驟中能夠使用指示網(wǎng)織紅細胞成熟 的其他測量法，包括測量細胞體積的直接方式或者間接方式。例如，能夠使用用于指示細胞 中RNA含量的熒光測量法、或者測量細胞體積的其他方式。作為另一個實例，還可以將正向 散射用于指示細胞大小。
[0040] 返回到圖2,在步驟206中，從全部的細胞事件種群中識別出網(wǎng)織紅細胞種群。使 用不同軸的事件數(shù)據(jù)的散射圖可幫助識別血細胞分布模式。作為一個實例，在散布圖中能 夠目測事件數(shù)據(jù)，比如圖1，其中光散射是在X軸上，而體積（DC)是在Y軸上。如同較早地 指示的那樣，就圖1而言，能夠?qū)⒕W(wǎng)織紅細胞種群104與紅細胞102、血小板108、白細胞106 相分離地識別開來。網(wǎng)織紅細胞種群的精度尤其取決于如何明確地確定將網(wǎng)織紅細胞與紅 細胞分開的線130。例如，在一種實施方式中，雖然能夠以閾值光散射和憑經(jīng)驗由在前收集 的測量值衍生的體積測定值為基礎(chǔ)，將線130疊加在散布圖100上，但線130可能無法正確 地將紅細胞102與網(wǎng)織紅細胞（104)分離開來，特別是就在散布圖100中處于非常近似于 線130的細胞事件而言。
[0041] 再一次返回圖2,在步驟207中，能夠報道一種以上網(wǎng)織紅細胞測量值。在一種實 施方式中，網(wǎng)織紅細胞部分被報告為在映射函數(shù)上限定的預(yù)定編號的區(qū)域相對于全部紅血 細胞種群的比率。在另一個實施方式中，網(wǎng)織紅細胞能夠被報告為百分率或者絕對數(shù)。報 告涉及將一種以上測量值輸出到顯示器或者其他輸出裝置比如計算機文件上。 檢測難以血影化細胞
[0042] 在一個方面，本發(fā)明的方法允許報告的網(wǎng)織紅細胞檢測精度得到改善，具有更精 確的樣本數(shù)據(jù)，以此為基礎(chǔ)來計算網(wǎng)織紅細胞信息。在一些血液樣品中已經(jīng)觀察到，在初始 血影化過程之后，一些細胞依然是或者未被血影化；或者僅被部分地血影化，即"難以血影 化"細胞。為本發(fā)明的目的，術(shù)語"難以血影化細胞"指的是這樣的細胞：其仍然保留了至少 大約超過30%的初始血紅蛋白含量。換句話說，難以血影化細胞中已除去小于70%的初始 血紅蛋白。優(yōu)選該細胞具有超過50%、更優(yōu)選超過70%的初始血紅蛋白含量。血影化過程， 例如，通過將低滲性的酸性溶液與血液樣品相結(jié)合，是用來清除來自該細胞的血紅蛋白。未 經(jīng)血影化或者無效血影化（即，當(dāng)時細胞失去的血紅蛋白含量少于大約30% )，可能無法清 楚地將紅細胞與網(wǎng)織紅細胞區(qū)別開來。血影細胞與難以血影化細胞相比的差異的另一個視 圖能夠在圖6中看出，圖6顯示了位于軸向光損失對UMALS的散布圖上部的難以血影化細 胞種群610。當(dāng)難以血影化細胞存在于血液樣品中、并且使用光散射和軸向光損失來分析血 液樣品時，網(wǎng)織紅細胞與成熟紅細胞的區(qū)分可能會失敗，因為難以血影化細胞種群是稠密 的、并且通常位于網(wǎng)織紅細胞區(qū)域內(nèi)部。本發(fā)明的一些實施方式涉及到檢測全體血細胞種 群中的難以血影化細胞。
[0043] 圖5 (A)和5 (B)顯示了在有和沒有難以血影化細胞事件的情況下相同事件數(shù)據(jù)的 散布圖中存在的對比情況，該對比使用常規(guī)的光散射或者上中值角度光散射（UMALS)、以及 DC軸。在圖5(A)中，散布圖包含難以血影化細胞事件。邊界510顯示了難以血影化細胞事 件種群的位置。圖5(B)顯示了在難以血影化細胞事件被除去之后的相同事件種群，包含邊 界510限定的種群。在圖5(A)和5(B)中，低于邊界530的事件對應(yīng)于血小板，并且在邊界 520右邊的事件對應(yīng)于白細胞。如同能夠通過邊界510的定位所看到的那樣，難以血影化細 胞事件種群跨越成熟紅血細胞種群和網(wǎng)織紅細胞種群的分離，因此使得難以清楚地區(qū)分成 熟紅血細胞和網(wǎng)織紅細胞。相反，當(dāng)難以血影化細胞事件種群被除去時，如圖5(B)所示，在 成熟紅血細胞和網(wǎng)織紅細胞之間能夠限定出清楚的邊界511。圖5(A)和5(B)的視圖比較 顯示了當(dāng)難以血影化細胞存在時，難以將成熟紅細胞與網(wǎng)織紅細胞相識別并且分離。
[0044] 在本實施方式中，軸向光損失測量法使得能夠?qū)㈦y以血影化種群與樣品中其他種 群區(qū)別開來。本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，基于慣常使用的光散射測量法所不能識別 難以血影化種群的相同事件種群現(xiàn)在可以通過使用軸向光損失測量法來區(qū)分出種群。例 如，圖6顯示了與圖5(A)所示相同的事件種群，但是其使用軸向光損失（ALL)和UMALS來代 替常規(guī)的DC和UMALS。通過使用ALL，難以血影化細胞事件能夠被清楚地識別，如邊界610 內(nèi)部區(qū)域所顯示的那樣。
[0045] 圖7(A_C)顯示了在本發(fā)明的一種實施方式中，使用ALL來除去另一個血液樣品中 的難以血影化細胞事件。散布圖710顯示了通常使用的UMALS和DC。在散布圖710中，存 在難以血影化細胞（如邊界711內(nèi)部所示），但是不能清楚地與其他紅血細胞區(qū)別開來。然 而，當(dāng)相同的數(shù)據(jù)被顯示在散布圖720中時，檢測難以血影化細胞的能力被極大地改善。散 布圖720具有軸向光損失（ALL)和UMALS作為數(shù)軸?；贏LL，難以血影化種群721可被清 楚地與其他的事件種群相區(qū)別。
[0046] 在本發(fā)明的一種實施方式中，對應(yīng)于難以血影化種群的細胞事件能夠被濾出，并 且剩余的細胞事件能夠被顯示在使用UMALS軸和DC軸的散布圖比如730中。能夠要么自 動地基于例如憑經(jīng)驗確定的閾值A(chǔ)LL和UMALS數(shù)值、要么使用人工操作輔助手段而通過門 控難以血影化種群，來完成對應(yīng)于難以血影化種群的細胞事件的濾出。散布圖730和710 的視覺比較顯示了在邊界731左邊的成熟紅血細胞種群與邊界731右邊的網(wǎng)織紅細胞種群 之間更清楚的區(qū)別。
[0047] 如圖6(具體地說，在邊界610內(nèi)部的區(qū)域）和圖7(A_C)(具體地說，在邊界721 內(nèi)部的區(qū)域）所示，當(dāng)使用ALL時，能夠?qū)㈦y以血影化細胞作為與其他種群比如成熟紅血細 胞、網(wǎng)織紅細胞、血小板和白細胞不同的種群而識別出來。難以血影化細胞通常展示出與其 他血細胞類型（除白細胞之外）相比更高的ALL。由于白細胞相對于其他血細胞類型的高 光散射測量值，白細胞能夠被區(qū)分。難以血影化細胞種群的高ALL可能是歸因于相對較高 的血紅蛋白光吸收。在488nm的激光波長（在產(chǎn)生圖5 (A)、5 (B)、圖6和圖7 (A-C)所示結(jié) 果的顆粒分析儀中使用的波長）下，血紅蛋白顯示出非常高的導(dǎo)致高水平ALL的光吸收。一 般來講，當(dāng)光是在400-500nm之間的波長時，血紅蛋白顯示出提高的光吸收。
[0048] 被分析的血液樣品中難以血影化細胞的檢測能夠通過本發(fā)明圖8中所示的實施 方式來完成。在圖8中，進一步剖析圖2中的步驟202,以便包括用于檢測難以血影化細胞 的步驟。在步驟802中，能夠?qū)⒅苽涞难簶悠罚琒卩，已經(jīng)被血影化和染色的樣品引入流動 池中用于分析。在步驟804中，通過使用包含就上述圖2所說明的光束的測量法，樣品被逐 個細胞地探詢。在步驟806中，收集ALL測量值，同時收集一種以上步驟810中的光散射測 量值。光散射測量法的描述能夠參考上述對于圖2的描述。
[0049] 在一種實施方式中，一旦難以血影化細胞被檢測，這個事件數(shù)據(jù)就能夠被用于更 精確地分析網(wǎng)織紅細胞。例如，通過使用網(wǎng)織紅細胞事件的ALL數(shù)值，能夠濾出難以血影化 細胞種群，如同步驟812中所述。在本實施方式中，該事件數(shù)據(jù)將可被用于進一步分析來確 定網(wǎng)織紅細胞信息或者任何其他的紅細胞信息，如步驟814中所述。一般來講，難以血影化 細胞事件種群的去除將會提高大多數(shù)有關(guān)紅血細胞和/或網(wǎng)織紅細胞的報告參數(shù)的精確 度。網(wǎng)織紅細胞信息的計算和報告在上述對于圖2中進行了描述。 對難以血影化細胞進行計數(shù)
[0050] 本發(fā)明的一個方面涉及對血液樣品中的難以血影化細胞進行計數(shù)。本發(fā)明的發(fā)明 人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在血液樣品中難以血影化細胞種群與血液病理學(xué)之間存在相關(guān)性。具 體地講，研究發(fā)現(xiàn)，在被分析的從罹患不同疾病的病人中收集的血液樣品中，難以血影化細 胞數(shù)量會提高，所述疾病的實例包括，但不限于：疾病比如血紅蛋白?。ɡ?，鐮刀形紅細 胞貧血病和地中海貧血），血液學(xué)惡性腫瘤（例如，白血病和淋巴瘤），凝血和出血病癥，以 及HIV/AIDS，惡性腫瘤，以及自身免疫紊亂。另外，當(dāng)將與難以血影化細胞在散布圖中的位 置與正常樣本相比較時，可以得到關(guān)于這些疾病的其他信息。返回到圖8,在檢測后，能夠 對難以血影化細胞進行計數(shù)，如步驟813中所述。細胞的計數(shù)或數(shù)數(shù)是用于明確定義的細 胞群比如目前限定的難以血影化細胞的公認技術(shù)。在一種實施方式中，難以血影化細胞部 分被報告為難以血影化細胞相對于全部紅血細胞種群的比率。在另一個實施方式中，難以 血影化細胞能夠被報告為百分率或者絕對數(shù)。所述數(shù)值可以用作僅供研究使用（RU0)的參 數(shù)、或者可以被拓展成體外診斷的（IVD)參數(shù)。圖10 (A-C)顯示了來自健康個體的血液樣 品中難以血影化細胞種群1010(圖10(A))與來自罹患鐮刀形紅細胞貧血?。▓D10(B))和 地中海貧血（圖10(C))的病人的血液樣品中難以血影化細胞種群的尺寸差異。如圖10(A) 和圖11所示，在健康個體捐贈的血液樣品中難以血影化細胞占全體RBC種群的百分率可以 被忽略，即，小于大約0.01%。還可以確定，來自罹患許多特定病理學(xué)的病人的血液樣品含 有增加的難以血影化細胞種群（如圖12所示）。這些病理學(xué)包括腎衰竭、肝癌、HIV、鐮刀 形紅細胞貧血病、以及地中海貧血。與來自健康個體的難以血影化細胞群體的大小相比，在 具有特定診斷疾病狀態(tài)的病人的血液樣品中，難以血影化細胞占全體RBC種群的百分率提 高了至少10倍。在一些血液樣品中，罹患疾病或紊亂的病人的難以血影化細胞種群比健康 個體的難以血影化細胞種群大至少100倍。本發(fā)明的發(fā)明人對于該趨勢的發(fā)現(xiàn)可能在確定 難以血影化細胞的異常種群的存在方面是有用的，這可以進一步涉及到特定病理的存在。
[0051] 可以使用備用的方法來對難以血影化細胞進行計數(shù)。更具體地說，通過血影化血 液樣品，并且通過使用已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的光散射測量法逐個細胞地測量血細胞 樣品中的血紅蛋白，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠分析該血液樣品。具有大于30%的初始血紅蛋 白的那些細胞被認為是難以血影化細胞。換句話說，在散布圖中難以血影化細胞將會比血 影細胞具有更大的光散射。在該備用方法中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以使用熒光染料來區(qū) 分網(wǎng)織紅細胞和難以血影化細胞。
[0052] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，能夠?qū)嵺`本發(fā)明的環(huán)境比如流式細胞儀和血液分析 儀，能夠被編程以便報告難以血影化細胞種群的數(shù)值。該數(shù)值可能與個體的生物化學(xué)狀態(tài) 和/或生理狀態(tài)相關(guān)連。例如，能夠設(shè)定血液樣品中難以血影化細胞占全體紅血細胞的百 分率的閾值，對應(yīng)于健康個體中存在的難以血影化細胞數(shù)量。當(dāng)來源于病人的血液樣品中 難以血影化細胞的數(shù)量超過這樣的閾值時，能夠懷疑為疾病狀態(tài)，并且能夠報告該血液樣 品，據(jù)此進一步進行病人的診斷評估。評估該血細胞計數(shù)結(jié)果的醫(yī)生將會基于病人的癥狀、 一般的健康狀態(tài)、疾病或紊亂、性別、以及年齡來確定適當(dāng)?shù)倪M一步檢查。在一種實施方式 中，如果血液樣品中難以血影化細胞的百分率超過閾值至少10倍，就能夠報告該血液樣品 用于進一步評估。在另一個實施方式中，如果血液樣品中難以血影化細胞的百分率超過閾 值至少100倍，就能夠報告該血液樣品用于進一步評估。 確定血細胞信息的系統(tǒng)
[0053] 圖9顯示了用于分析血液樣品的根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式的系統(tǒng)。使用連線 940將顆粒分析儀910偶聯(lián)于計算機901。任選地使用連接950將計算機901偶聯(lián)于顯示 器920、和/或外部存儲器裝置921。計算機901能夠包括處理器902、內(nèi)存903、內(nèi)部存儲 器904、輸入模塊905、輸出模塊906、以及網(wǎng)織紅細胞模塊（reticulocyte module) 907。網(wǎng) 織紅細胞模塊907能夠包括檢測器模塊961、分析儀模塊963、區(qū)分器模塊965、以及報告模 塊（reporter module)967。
[0054] 顆粒分析儀910可能包括血液分析儀、流式細胞儀、或能夠借助于光束探詢血液 樣品的類似裝置。制備血液樣品，輸入顆粒分析儀910中用于分析。通過顆粒分析儀910產(chǎn) 生的事件數(shù)據(jù)通過連線940被傳遞給計算機901。連線940可能是一種內(nèi)部連接裝置--比 如外圍部件互連（peripheral component interconnect, PCI)總線、或網(wǎng)絡(luò)接線。通過在 顆粒分析儀910中的血液樣品分析產(chǎn)生的事件能夠?qū)崟r地或者呈分批方式地被傳遞至計 算機901。
[0055] 在計算機901內(nèi)部經(jīng)任何加工之后，事件數(shù)據(jù)然后在顯示器920上被傳遞給用戶、 或者被儲存在外部存儲器裝置921中。例如，通過計算機901內(nèi)部的加工產(chǎn)生的散布圖能 夠通過使用顯示器920而被傳遞給用戶。加工的事件數(shù)據(jù)還可以被儲存，用于后面的分析 和顯示。外部存儲裝置921可能包括硬盤、或者其他類型的便攜式存儲器。
[0056] 處理器902能夠執(zhí)行可使模塊905、906和907能進行加工的指令。內(nèi)存903提供 這些加工所要求的暫時儲存，并且內(nèi)部存儲器904能夠提供與這些加工有關(guān)的數(shù)據(jù)和結(jié)果 的暫時儲存或者中間儲存。內(nèi)部存儲器904還可以基于模塊的指令和/或程序代碼，以包 含可計算機讀取的程序代碼的形式來儲存控制邏輯，所述模塊包括網(wǎng)織紅細胞模塊907的 部件1旲塊。
[0057] 輸入模塊905可接受由顆粒分析儀910產(chǎn)生的事件數(shù)據(jù)。輸入模塊905能夠包括 將來自顆粒分析儀910的輸入事件數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成被網(wǎng)織紅細胞模塊907理解的格式所要求 的任何加工。輸出模塊906收集被網(wǎng)織紅細胞模塊907加工的事件數(shù)據(jù)，進行任何必要的 轉(zhuǎn)化，并且通過使用連線950而輸出到顯示器920或存儲器920。連線950可能是一種裝 置一內(nèi)部連接器比如PCI、或網(wǎng)絡(luò)接線。顯示器920可能是為觀察顆粒分析儀數(shù)據(jù)而定做 的顯示設(shè)備、一般的顯示器、或者任何能夠輸出顆粒分析結(jié)果的其他手段。
[0058] 檢測器模塊961能夠包括指令，用于將細胞事件的測量值或者參數(shù)確定為屬于側(cè) 向散射，包括UMALS、正向散射、軸向光損失、以及DC。應(yīng)注意，本發(fā)明的每一種實施方式都 可能不能取得所有的上述測量值?？梢源嬖谝恍┰陬w粒分析儀910上需要的構(gòu)造，以便能 夠收集所有上述測量值。
[0059] 分析儀模塊963包含用于識別網(wǎng)織紅細胞種群和/或難以血影化細胞種群、并且 從其他類型的血細胞中分離這些種群的指令。在另一個實施方式中，分析儀模塊963能夠 包含用于按如上所述過濾出對應(yīng)于難以血影化細胞的細胞事件的指令。在又一個實施方式 中，分析儀模塊963能夠包含對難以血影化細胞種群進行計數(shù)的指令。
[0060] 區(qū)分器模塊965能夠包含可引起計算機確定待分析樣品中未成熟網(wǎng)織紅細胞信 息的指令。例如，現(xiàn)在通過同時使用光散射測量值和第二種網(wǎng)織紅細胞成熟測量值比如體 積，可以研究使用模塊963識別出的網(wǎng)織紅細胞事件種群，以便區(qū)分成熟的網(wǎng)織紅細胞和 未成熟的網(wǎng)織紅細胞。
[0061] 報告模塊967包含使得計算機901能將散布圖顯示給顯示器920、并且還報告有用 的血液樣品中網(wǎng)織紅細胞定量值的指令。網(wǎng)織紅細胞部分或者網(wǎng)織紅細胞百分率是一些能 夠被報告模塊967所報告的定量值。報告模塊967還可以包含用于報告有關(guān)難以血影化細 胞種群的信息的指令。
[0062] 在本公開中，被公開的方法通過測量值比如網(wǎng)織紅細胞部分和難以血影化細胞能 夠提高血液樣品分析的精確度。所公開的方法相對于現(xiàn)有的方法產(chǎn)生了實質(zhì)的改進，并且 能夠在許多血液病理學(xué)檢測和治療方面導(dǎo)致顯著的改進。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將應(yīng)理解，在 此公開的技術(shù)能夠適用于除在此描述的紅細胞之外的其他細胞類型。
[0063] 上述對本發(fā)明的描述是為了說明和描述目的。并非窮盡本發(fā)明或者用于將本發(fā)明 限定為上述公開的形式，在上述教導(dǎo)下，可以有其他的變型和變化。選擇和描述的實施方式 是為了解釋本發(fā)明的原理及其實際應(yīng)用，從而使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地以各種實施 方式利用本發(fā)明，可預(yù)期采用不同的變型。應(yīng)當(dāng)理解，除在現(xiàn)有【技術(shù)領(lǐng)域】限制的范圍之外， 附后的權(quán)利要求包含本發(fā)明的【具體實施方式】的其它選擇。
【權(quán)利要求】
1. 一種對血細胞樣品中的難以血影化細胞進行計數(shù)的自動化方法，其包括： (a) 將血細胞樣品與核酸染色劑和血影化試劑相混合，其中所述核酸染色劑用于對核 酸進行染色，所述血影化試劑用于從血細胞樣品的紅血細胞中除去血紅蛋白，借此產(chǎn)生經(jīng) 血影化處理的血細胞樣品； (b) 使經(jīng)血影化處理的血細胞樣品經(jīng)過細胞計數(shù)流動池； (c) 通過使用兩種不同的光學(xué)測量，分析細胞計數(shù)流動池中的經(jīng)血影化處理的血細胞 樣品； (d) 通過使用所述兩種不同的光學(xué)測量進行分析，將經(jīng)血影化處理的血細胞樣品中的 難以血影化細胞與其他細胞區(qū)分開來；以及 (e) 對難以血影化細胞進行計數(shù)， 其中所述難以血影化細胞指的是這樣的細胞：和血影化試劑相混合后，仍然保留了全 部或部分的初始血紅蛋白含量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，血液樣品與核酸染色染料的混合和與血影 化試劑的混合是分別進行的。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色劑是熒光性的或者非熒光性的。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述光學(xué)測量包含軸向光損失、熒光、或者 光散射。
5. -種檢測血液樣品中難以血影化細胞的方法，其包括： (a) 將血液樣品與血影化試劑相混合，以便從紅血細胞中除去血紅蛋白，借此產(chǎn)生經(jīng)血 影化處理的血液樣品； (b) 在細胞計數(shù)流動池中，通過包括軸向光損失測量值在內(nèi)的檢測，來評估經(jīng)血影化處 理的血液樣品,借此產(chǎn)生事件數(shù)據(jù)；以及 (c) 采用事件數(shù)據(jù)的軸向光損失測量，來識別難以血影化細胞， 其中所述難以血影化細胞指的是這樣的細胞：和血影化試劑相混合后，仍然保留了全 部或部分的初始血紅蛋白含量。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，采用軸向光損失測量來識別難以血影化細 胞包括：將軸向光損失測量值與第一閾值比較、將光散射測量值與第二閾值比較，其中將軸 向光損失測量值大于第一閾值、光散射測量值低于第二閾值識別為難以血影化細胞。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，光散射測量包括，但不限于：上中值角度光 散射（UMALS)、低中值角度光散射（LMALS)、以及低角度光散射（LALS)。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，光散射測量是UMALS。
9. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包括收集直流阻抗測量。
10. -種對血液樣品中難以血影化細胞進行計數(shù)的方法，其包括： (a) 將血液樣品與血影化試劑相混合，以便從紅血細胞中除去血紅蛋白，借此產(chǎn)生經(jīng)血 影化處理的血液樣品； (b) 在細胞計數(shù)流動池中，通過包括軸向光損失測量值在內(nèi)的檢測，評估經(jīng)血影化處理 的血液樣品，借此產(chǎn)生事件數(shù)據(jù)； (c) 采用事件數(shù)據(jù)的軸向光損失測量，來識別難以血影化細胞； (d) 采用軸向光損失測量，對難以血影化細胞種群進行計數(shù)；以及 (e)報告血液樣品中的難以血影化細胞種群， 其中所述難以血影化細胞指的是這樣的細胞：和血影化試劑相混合后，仍然保留了全 部或部分的初始血紅蛋白含量。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，報告難以血影化細胞種群包括報告難以 血影化細胞種群占全體紅血細胞的比率。
12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，報告難以血影化細胞種群包括報告難以 血影化細胞占全體紅血細胞種群的百分率。
13. -種分析血液樣品的方法，其包括： (a) 將血液樣品與血影化試劑相混合，以便從紅血細胞中除去血紅蛋白，借此產(chǎn)生經(jīng)血 影化處理的血液樣品； (b) 在細胞計數(shù)流動池中，通過包括軸向光損失測量值在內(nèi)的檢測，測量經(jīng)血影化處理 的血液樣品，從而產(chǎn)生事件數(shù)據(jù)； (c) 基于所述軸向光損失測量值，使用事件數(shù)據(jù)來識別難以血影化細胞種群； (d) 從所述事件數(shù)據(jù)中過濾出難以血影化細胞種群；以及 (e) 分析不含難以血影化細胞種群的事件數(shù)據(jù)，從而識別血細胞分布模式， 其中所述難以血影化細胞指的是這樣的細胞：和血影化試劑相混合后，仍然保留了全 部或部分的初始血紅蛋白含量。
14. 一種用于分析血液樣品的系統(tǒng)，其包括： 至少一個處理器； 顆粒分析儀，其偶聯(lián)于至少一個處理器并包含細胞計數(shù)流動池； 檢測器模塊，其偶聯(lián)于至少一個處理器、并構(gòu)造為可以基于包括對流動池中經(jīng)血影化 處理的血液樣品的軸向光損失測量值在內(nèi)的檢測來產(chǎn)生事件數(shù)據(jù)；以及 分析儀模塊，其偶聯(lián)于至少一個處理器，并構(gòu)造為可以基于所述軸向光損失測量值、使 用事件數(shù)據(jù)來識別難以血影化細胞種群， 其中所述難以血影化細胞指的是這樣的細胞：和血影化試劑相混合后，仍然保留了全 部或部分的初始血紅蛋白含量。
15. 如權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述難以血影化細胞仍然保留了至少 30%的初始血紅蛋白含量，優(yōu)選具有至少50%的初始血紅蛋白含量，更優(yōu)選具有至少70% 的初始血紅蛋白含量。
16. 如權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述分析儀模塊進一步構(gòu)造為可以使用 軸向光損失測量來對難以血影化細胞進行計數(shù)。
17. 如權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述分析儀模塊進一步構(gòu)造為： 從所述事件數(shù)據(jù)中過濾出難以血影化細胞種群；以及 分析不含難以血影化細胞種群的事件數(shù)據(jù)，從而識別血細胞分布模式。
18. -種對血細胞樣品中的難以血影化細胞進行計數(shù)的自動化方法，其包括： (a) 將血細胞樣品與核酸染色熒光染料和血影化試劑相混合，其中所述核酸染色熒光 染料用于對含有核酸的血細胞進行染色，所述血影化試劑用于從血細胞樣品的紅血細胞中 除去血紅蛋白，借此產(chǎn)生經(jīng)血影化處理的血細胞樣品； (b) 使經(jīng)血影化處理的血細胞樣品經(jīng)過細胞計數(shù)流動池； (C)通過使用光散射測量和熒光測量，分析細胞計數(shù)流動池中的經(jīng)血影化處理的血細 胞樣品； (d) 通過使用熒光測量和光散射測量進行分析，將難以血影化細胞與含有核酸的熒光 染色細胞和血影細胞區(qū)分開來；以及 (e) 對難以血影化細胞進行計數(shù)， 其中所述難以血影化細胞指的是這樣的細胞：和血影化試劑相混合后，仍然保留了全 部或部分的初始血紅蛋白含量。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，血液樣品與核酸染色熒光染料的混合和 與血影化試劑的混合是分別進行的。
20. 如權(quán)利要求1、5、10、13和18任一項所述的方法，其特征在于，所述難以血影化細胞 仍然保留了至少30%的初始血紅蛋白含量，優(yōu)選具有至少50%的初始血紅蛋白含量，更優(yōu) 選具有至少70 %的初始血紅蛋白含量。
【文檔編號】G01N33/49GK104280537SQ201410499217
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2010年3月24日
【發(fā)明者】C·P·戈德弗魯伊, J·S·賴?yán)? P·J·維達爾 申請人:貝克曼考爾特公司