基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒，其中，該試劑盒由具有富集抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠、多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質(zhì)控品以及PBST緩沖液所組成；質(zhì)控品包括陽(yáng)性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；陽(yáng)性質(zhì)控品為人肺炎鏈球菌感染者的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體分別為陽(yáng)性的血清；陰性質(zhì)控品是抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG均為陰性的人血清。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、快速以及高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體的同步檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，以及該檢測(cè)試劑盒的制備及使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002]人肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, Sp)是兒童呼吸道感染的重要病原體。主要經(jīng)飛沫傳播而進(jìn)入呼吸道，從而寄生于人體的鼻咽部，或侵入人體不易清除的部位引起一系列的疾病，如大葉性肺炎，腦膜炎，支氣管炎，中耳炎等。它是全球所有年齡組高發(fā)病率和病死率的主要病原菌。其中，在發(fā)展中國(guó)家，嬰幼兒、老年人及免疫缺陷人群中尤為嚴(yán)重。肺炎鏈球菌于1881年首次由巴斯德(Louis Pasteur)及G.M.Sternberg分別在法國(guó)及美國(guó)從患者痰液中分離出。其為革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，有毒株菌體外有化學(xué)成分為多糖的莢膜。其莢膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型的依據(jù)。根據(jù)莢膜多糖抗原性的不同將肺炎球菌分為91個(gè)血清型。肺炎鏈球菌菌體抗原主要為C多糖，其存在于肺炎鏈球菌細(xì)胞壁中，具有種特異性，為各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反應(yīng)蛋白沉淀。在鈣離子存在時(shí)，C多糖可與正常人血清中稱為C-反應(yīng)蛋白(C reactive protein, CRP)的β球蛋白結(jié)合,發(fā)生沉淀。目前針對(duì)人肺炎鏈球菌抗原的檢測(cè)亦主要是針對(duì)此抗原，而該抗原非肺炎鏈球菌獨(dú)有，如緩和鏈球菌亦含有該抗原。在肺炎鏈球菌表面還有一種與毒力相關(guān)的重要抗原，為肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA),其存在于肺炎鏈球菌所有血清型中，是肺炎鏈球菌的特異性抗原。但是PspA分子結(jié)構(gòu)高度變異，具有抗原多樣性，其富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域上游被稱為CDR域，具有多樣性。根據(jù)CDR域的不同將 PspA 分為 3 個(gè)家族 6 亞類:Cladel, Clade2, Clade3, Clade4, Clade5, Clade6。其中Cladel, Clade2 屬于 Faml 家族；Clade3, Clade4, Clade5 屬于 Fam2 家族，Clade6 屬于 Fam3家族。具有Faml或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎鏈球菌占到了臨床分離的人肺炎鏈球菌種類的99%以上。我國(guó)目前還未見(jiàn)具有fam3家族PspA蛋白的肺炎鏈球菌的臨床分離報(bào)道。研究表明同一家族亞類間PspA蛋白間存在廣泛的抗原抗體交叉反應(yīng)，而異家族亞類間則無(wú)此交叉反應(yīng)。
[0003]臨床病人由于不同的呼吸道病原體(如副流感病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病癥狀可以十分相似，這導(dǎo)致了流行診斷比較困難，確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可以得到明確的診斷，便于實(shí)施針對(duì)性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0004]在人肺炎鏈球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷上，被檢者血清中抗肺炎鏈球菌抗體指標(biāo)則是診斷結(jié)果的重要依據(jù)之一。
[0005]免疫球蛋白M(Immunoglobulin M, IgM)和免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG)是人體內(nèi)最重要的兩種抗體。當(dāng)人肺炎鏈球菌進(jìn)入機(jī)體后，最早出現(xiàn)的免疫球蛋白是IgM抗體，之后出現(xiàn)IgG,通過(guò)檢測(cè)體內(nèi)特異性IgM、IgG抗體的存在,可診斷人體對(duì)人肺炎鏈球菌的免疫反應(yīng)狀態(tài)。若檢測(cè)出特異性IgM抗體，表明有近期感染的發(fā)生，但I(xiàn)gM抗體半衰期較短，IgM的檢測(cè)陰性并不能證明機(jī)體未受感染，還需要檢測(cè)半衰期較長(zhǎng)，含量最高的IgG抗體，以明確診斷。
[0006]目前，血清中特異性IgM及IgG抗體的檢測(cè)方法主要有冷凝集實(shí)驗(yàn)、明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法及金標(biāo)免疫層析法。冷凝集實(shí)驗(yàn)的特異度和敏感度均為最低，因此其臨床診斷價(jià)值不大；金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法及金標(biāo)免疫層析法雖操作簡(jiǎn)便快捷，但敏感度略低，對(duì)抗體水平較低的患者有漏診的可能；明膠凝集實(shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備與操作過(guò)程較為繁瑣，且需要專業(yè)操作人員。酶聯(lián)免疫吸附法具有特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，已用于檢查各種抗體或抗原，但此方法存在以下問(wèn)題:(I)每一批試驗(yàn)從加樣、溫浴、洗版等步驟較多，操作繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)(總共需要2-4小時(shí))；(2)檢測(cè)中需分別加入顯色成分A液與B液，且還要在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成讀數(shù)，一定程度上增加了勞動(dòng)強(qiáng)度和操作失誤的可能性；(3)該法無(wú)法做到對(duì)IgM及IgG兩種抗體的同時(shí)檢測(cè)。雖然單獨(dú)檢測(cè)IgM和IgG抗體后，再綜合分析檢測(cè)結(jié)果對(duì)疾病的診斷并無(wú)影響，但操作過(guò)程繁瑣，檢測(cè)不夠方便快捷，檢測(cè)成本較共檢亦會(huì)增加。
[0007]因此，建立具備高靈敏度、能對(duì)抗人肺炎鏈球菌的特異性IgM、IgG抗體進(jìn)行快速同步共檢的檢測(cè)方法顯得十分必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)【背景技術(shù)】中存在的這些技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的能簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的同步共檢抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體的檢測(cè)方法和試劑盒，以及該試劑盒的制備及使用方法。
[0009]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0010]一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟:
[0011 ] I)重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備；
[0012]2)將步驟I)制備得到的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白與納米磁珠通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制得抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠；
[0013]3)將鼠抗人IgM單克隆抗體與發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的納米量子點(diǎn)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgM納米探針；將鼠抗人IgG單克隆抗體與發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的納米量子點(diǎn)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgG納米探針；將量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgM納米探針與量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgG納米探針等量混合即制得多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0014]4)取人血清樣本，用PBSA緩沖液適當(dāng)稀釋后，分別向血清稀釋液中加入步驟2)制備得到的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠以及步驟3)制備得到的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針,充分混合，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗漆2遍后，使用熒光酶標(biāo)儀，在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為520nm及600nm下分別讀取熒光值；所述PBSA緩沖液中各組分含量分別為:8g/LNaCL，0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA(牛血清白蛋白);所述PBSA緩沖液的pH = 7.4 ;所述PBST緩沖液中各組分含量分別為:8g/LNaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA(牛血清白蛋白)，0.3g/L NaN3,0.5ml/L Tween-20 ;所述 PBST 緩沖液的 pH = 7.4 ；
[0015]5)根據(jù)步驟4)的方法檢測(cè)至少30份經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本,分別讀取發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為520nm及600nm下的熒光值；所述抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本簡(jiǎn)稱人肺炎鏈球菌抗體陰性對(duì)照樣品；所述人肺炎鏈球菌抗體陰性對(duì)照樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為CUT-OFFl值；所述人肺炎鏈球菌抗體陰性對(duì)照樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為⑶T-0FF2值；若步驟4)中人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的檢測(cè)熒光值大于CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽(yáng)性；若步驟4)中人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的檢測(cè)熒光值小于CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性；若步驟4)中人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的檢測(cè)熒光值大于CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性；若步驟4)中人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的檢測(cè)熒光值小于CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性。
[0016]一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒，其特征在于:所述基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒由具有富集抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠、多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質(zhì)控品以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包括陽(yáng)性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽(yáng)性質(zhì)控品由兩份人肺炎鏈球菌感染者的抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性的血清及兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性的血清組成；所述陰性質(zhì)控品是四份抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清。
[0017]一種用于制備基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的方法，其特征在于:所述制備方法包括以下步驟:
[0018]I)抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠的制備:
[0019]1.1)重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備、純化:
[0020]1.1.1)對(duì)人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分別獲取人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對(duì)應(yīng)的基因序列；
[0021]1.1.2)在步驟1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分別引入酶切位點(diǎn)并分別化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為PspAl、PspA2 ;其序列參見(jiàn)序列表；
[0022]1.1.3)將步驟L 1.2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物學(xué)方法分別克隆入表達(dá)載體pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白均以可溶性表達(dá)形式存在于基因工程菌體中；
[0023]1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組PspAl-His、PspA2_His融合蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，用PBS緩沖液分別透析過(guò)夜；收集透析液，經(jīng)bradford試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定后，用PBS緩沖液分別調(diào)整濃度均為2mg/mL ;所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4, L 44g/LNa2HP04，所述 PBS 緩沖液的 pH=7.4 ；
[0024]1.1.5)將步驟1.1.4)得到的兩種重組蛋白溶液按體積比1:1混合即制得重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白；
[0025]1.2)納米磁珠的包被:
[0026]1.2.1)取5mg磁珠，用Iml MES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為1150nm的羧基磁珠；所述MES緩沖液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES緩沖液的pH = 6.0 ;所述納米磁分離器的磁性強(qiáng)度是0.4T；
[0027]1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8_12mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化Ihr,置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0028]1.2.3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200 μ L步驟1.2.2)所得到的活化后的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為100-400 μ g/ml的由步驟1.1.5)所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各lml，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2_6h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液,室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/LNaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,所述 PBS 緩沖液的 pH = 7.4 ；
[0029]1.2.4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.5ml/L Tween-20，所述洗滌緩沖液的pH =
7.4；
[0030]1.2.5)向各個(gè)離心管中分別加入Iml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆茫恢链酥频每谷朔窝祖溓蚓贵w捕獲納米磁珠；所述保存緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/LNaNs, 5g/L 牛血清白蛋白(BSA)，所述保存緩沖液的pH = 7.4 ;
[0031]2)多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針的制備:
[0032]其具體制備方法包括:
[0033]2.1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、600nmol N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為5ml，混合溶液，37°C反應(yīng)30min后,透析去除過(guò)量的作為活化劑的sulfo-NHS及EDC,得到活化后的量子點(diǎn)；所述羧基水溶性量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)是520nm ;所述磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩沖液的pH = 7.4 ;
[0034]2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入8-16nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為1%，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)Ih ；
[0035]2.3)用0.2 μ m PES濾器過(guò)濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和反應(yīng)中的副產(chǎn)物；
[0036]2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液中，置于4°C保存?zhèn)溆?，至此制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgM納米探針；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH = 7.4 ;所述磷酸鹽保存液中各成分含量如下:
2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH = 7.4 ;
[0037]2.5)按與步驟2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm的羧基水溶性量子點(diǎn)制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgG納米探針；將上述兩種量子點(diǎn)標(biāo)記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0038]3) PBST緩沖液的配制:
[0039]其具體配制方法包括:
[0040]取8g NaCL, 0.2g KC1,0.24 KH2PO4,1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3, 0.5mlTween-20溶解于900ml蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)整pH至7.4，再定容至100ml ；
[0041]4)質(zhì)控品的制備:
[0042]4.1)陽(yáng)性質(zhì)控品:
[0043]4.1.1)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽(yáng)性的血清構(gòu)成；
[0044]4.1.2)抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽(yáng)性質(zhì)控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性的血清構(gòu)成；
[0045]4.2)陰性質(zhì)控品:由0.5ml抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構(gòu)成。
[0046]作為優(yōu)選，本發(fā)明在步驟1.2.2)中，依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化Ihr,置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0047]所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為200 μ g/ml的由步驟1.1.5)所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各Iml,室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液；
[0048]所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入12nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應(yīng)2h。
[0049]作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的量子點(diǎn)是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)。
[0050]作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團(tuán)為羧基、粒徑為1150nm的羧基磁珠。
[0051]一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的使用方法，其特征在于:所述使用方法包括以下步驟:
[0052]I)取待檢血清樣本5 μ I用995 μ I PBSA緩沖液稀釋后將稀釋液轉(zhuǎn)入1.5ml普通離心管中；所述PBSA緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,
1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA ;所述 PBSA 緩沖液的 pH = 7.4 ；
[0053]2)向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠10-100 μ I及基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)5-25min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清；
[0054]3)添加基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩沖液Iml洗滌兩遍，采用納米磁分離器磁分離后吸出洗滌液，最后用0.2ml PBS緩沖液重懸磁珠，制得納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點(diǎn)“三明治”復(fù)合物；所述PBS 緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4 ；所述PBS緩沖液的pH = 7.4 ;
[0055]4)將步驟3)得到的納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點(diǎn)復(fù)合物載于酶標(biāo)板中，使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)同為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為520nm及600nm的參數(shù)下分別對(duì)其熒光值進(jìn)行分別讀數(shù)；
[0056]5)按上述同樣的方法檢測(cè)至少30份經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本,分別讀取發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為520nm及600nm下的熒光值；所述經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為⑶T-OFFl值；所述經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為⑶T-0FF2值；同時(shí)檢測(cè)試劑盒中提供的四份陰性質(zhì)控品樣品及四份陽(yáng)性質(zhì)控品樣品，分別讀取發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為520nm及600nm下的突光值；四份陰性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的突光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的熒光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的熒光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽(yáng)性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為及600nm下的熒光值記為PCX2 ;若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的檢測(cè)熒光值大于⑶T-OFFl值且PCX1/NCX1 ^ 2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽(yáng)性；若步驟4)中待檢樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的檢測(cè)熒光值小于CUT-OFFl值且PCX1/NCX1 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性；若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的檢測(cè)熒光值大于CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性；若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的檢測(cè)熒光值小于⑶T-0FF2值且PCX2/NCX2彡2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性；若PCX1/NCX1 < 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
[0057]作為優(yōu)選，本發(fā)明所提出的步驟2)中，向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)15min后取下,將離心管插入納米磁分離器磁分離3min,用移液器吸出上清。
[0058]本發(fā)明所需的羧基水溶性納米量子點(diǎn)、1150nm羧基磁珠，鼠抗人IgM單克隆抗體、鼠抗人IgG單克隆抗體等可到相關(guān)專業(yè)的研究單位、公司購(gòu)買或定制；所需的儀器、設(shè)備、藥品均有市售。
[0059]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0060]1、本發(fā)明利用了納米磁珠對(duì)樣品的可富集性、分離的速度快、效率高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合量子點(diǎn)光化學(xué)穩(wěn)定性高、熒光強(qiáng)度高等特性，使得檢測(cè)體系具備多重信號(hào)協(xié)同放大的效果，從而具有超高的檢測(cè)靈敏度與準(zhǔn)確度。
[0061]2、本發(fā)明所用的捕獲抗原是包含有人肺炎鏈球菌特異性Faml PspA及Fam2PspA蛋白抗原胞外區(qū)富含抗原表位的混合抗原，病人血清中針對(duì)其產(chǎn)生的抗體水平高，因此捕獲效果好。
[0062]3、本發(fā)明所用的捕獲抗原特異性高，與其他常見(jiàn)的呼吸道病原體(如甲、乙型人流感病毒、人流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、人肺炎支原體、人肺炎衣原體等)的抗體之間無(wú)抗原抗體交叉反應(yīng)。
[0063]4、本發(fā)明所用抗原為基因工程重組抗原，蛋白質(zhì)表達(dá)量高，且為可溶性表達(dá)，無(wú)需復(fù)性，故較為廉價(jià)易得。
[0064]5、本發(fā)明檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速(30min之內(nèi))，易于判定，檢測(cè)成本低廉，克服了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率低、成本高、操作復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、臨床應(yīng)用不便的不足。
[0065]6、本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體的同步檢測(cè)，解決了分項(xiàng)檢測(cè)所帶來(lái)的操作過(guò)程繁瑣，檢測(cè)不夠方便快捷，檢測(cè)成本較高等問(wèn)題，而目前市面上還未曾見(jiàn)到抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體同步檢測(cè)的產(chǎn)品或者相關(guān)科學(xué)報(bào)道的出現(xiàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0066]本發(fā)明是根據(jù)免疫學(xué)中的抗體抗原反應(yīng)原理，利用納米磁珠對(duì)樣品的可富集性、分離的速度快、效率高等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合量子點(diǎn)光化學(xué)穩(wěn)定性高、熒光強(qiáng)度高等特性，建立的一套具備多重信號(hào)協(xié)同放大、具有超高靈敏度及高度特異性的快速同步檢測(cè)抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體的新方法，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
[0067]本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步具體描述。
[0068]各種試劑的配制及所需材料的說(shuō)明
[0069]1.PBSA緩沖液:稱取1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉，0.2g氯化鉀，5g牛血清白蛋白溶解于900ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調(diào)pH至7.4后用去離子水定容至1000ml。
[0070]2.PBS緩沖液:稱取1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉，0.2g氯化鉀溶解于900ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調(diào)pH至7.4后用去離子水定容至1000ml。
[0071]3.重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白:為本發(fā)明自制,將本發(fā)明自制的濃度均為0.2mg/ml的重組PspAl-His融合蛋白與重組PspA2_His融合蛋白按體積比1:1混合后搖勻，制得重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白。
[0072]4.鼠抗人IgM單克隆抗體:為Abcam公司產(chǎn)品，貨號(hào)ab99741，用PBS緩沖液稀釋，搖勻，使溶液中單克隆抗體重量百分比濃度為lmg/ml。
[0073]5.鼠抗人IgG單克隆抗體:為Abcam公司產(chǎn)品，貨號(hào)ab99757，用PBS緩沖液稀釋，搖勻，使溶液中單克隆抗體重量百分比濃度為lmg/ml。
[0074]6.量子點(diǎn):本發(fā)明中所用的兩種量子點(diǎn)均為羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)，其發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm及600nm，自武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司購(gòu)買，產(chǎn)品名稱為羧基水溶性量子點(diǎn)-520及羧基水溶性量子點(diǎn)-600。
[0075]7.磁珠:本發(fā)明中所用磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團(tuán)為羧基、粒徑為分別為50nm、180nm、350nm、1150nm、3 μ m的羧基磁珠,可從陜西北美基因股份有限公司、上海奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司購(gòu)買。
[0076]實(shí)施例1重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備與純化
[0077]1.相關(guān)基因的克隆
[0078]對(duì)人肺炎鏈球菌Faml PspA, Fam2 PspA蛋白(其NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的access1n number分別為AAF27703、AAF27712)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分別獲取其胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對(duì)應(yīng)的DNA編碼序列，同時(shí)在其5’引入酶切位點(diǎn)Ndel、3’端引入終止信號(hào)TAA和酶切位點(diǎn)XhoI后分別化學(xué)合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交貨時(shí)人工合成的基因片段均分別連于載體PUC57上)，記為PspAl, PspA2。其基因全序列如序列表所不。其中，PspAl基因編碼的蛋白質(zhì)序列為人肺炎鏈球菌Faml PspA蛋白(access1n number:AAF27703)的29_406&3。？8口六2基因編碼的蛋白質(zhì)序列為人肺炎鏈球菌Fam2 PspA蛋白(access1n number:AAF27712)的26_427aa。將分別含有該兩段人工合成的DNA片段的載體pUC57分別用NdeI及XhoI進(jìn)行雙酶切后按常規(guī)方法分別回收目的片段，備用。同時(shí)采用NdeI及XhoI對(duì)載體pET-28a(+)進(jìn)行雙酶切，并按常規(guī)方法分別將經(jīng)雙酶切后獲得的PspAl，PspA2連入pET-28a (+)載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，構(gòu)建pET-PspAl、pET_PspA2表達(dá)載體。經(jīng)酶切和序列測(cè)定證實(shí)表達(dá)載體構(gòu)建無(wú)誤。該載體分別表達(dá)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白。
[0079]2.重組PspAl-His、PspA2_His融合蛋白的表達(dá)與純化
[0080]將鑒定正確的陽(yáng)性克隆菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，按常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliBL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化完成后將菌液涂布于含50μ g/mL卡那霉素的LB平板上，按常規(guī)方法篩選表達(dá)菌株。分別挑取pET-PSpAl、pET-PSpA2轉(zhuǎn)化的具有外源蛋白表達(dá)能力的單個(gè)菌落并分別接種入10mL LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)過(guò)夜。分別取出菌液后，按1: 100分別接種于10mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6時(shí)，加入lmol/L IPTG至終濃度為lmmol/L,于37°C搖菌培養(yǎng),誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)4h后分別于8000r/min下離心1min收集菌體。將此兩份菌體分別用20mL磷酸鹽緩沖液(8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/LKH2P04,1.44g/L Na2HPO4 pH = 7.4)洗滌 3 次并分別用 1mL 上樣緩沖液(20mM Na3PO4, 0.5M NaCl ;30mM咪唑，pH7.4)重懸后進(jìn)行超聲破碎，操作條件為:50HZ，200W，超聲3S，間歇5S，工作100次。超聲完成后，12000g離心15min分別收集沉淀和上清后進(jìn)行電泳檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白均以可溶性表達(dá)方式存在于菌體中。收集此兩份細(xì)胞破碎的上清液，分別用His Trap affinity columns (GE healthcare公司產(chǎn)品)，按照說(shuō)明書(shū)用同樣的方法進(jìn)行純化。具體方法如下:
[0081]I)用5mL注射器吸滿蒸餾水，擰開(kāi)柱的塞子，用提供的接頭將柱和注射器連接上，以lmL/min流速洗柱。
[0082]2)用1mL上樣緩沖液平衡，lmL/min流速。
[0083]3)將融合蛋白上樣，lmL/min流速。
[0084]4)用1mL上樣緩沖液，以lmL/min流速洗柱。
[0085]5)用 1mL 洗脫緩沖液(20mM Na3PO4,0.5M NaCl,300mM 咪唑，ρΗ7.4)，以 lmL/min流速洗脫，分管收集，每管lml，12% SDS-PAGE檢測(cè)，合并洗脫組分中含有目的蛋白的樣品，用PBS緩沖液透析過(guò)夜。收集透析液經(jīng)bradford試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定后,用PBS緩沖液調(diào)整濃度為0.2mg/mL。
[0086]3.重組人肺炎鏈球菌PspA融合蛋白的制備
[0087]將上述步驟2制備的分別含重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白的PBS緩沖液按體積比1:1混合即制得重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白，供納米磁珠包被用。
[0088]實(shí)施例2抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠的制備
[0089]1.重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白偶聯(lián)磁珠反應(yīng)條件的優(yōu)化:
[0090]以偶聯(lián)了重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的磁珠作為固相載體，量子點(diǎn)標(biāo)記的鼠抗人IgM單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，檢測(cè)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性血清，觀察磁珠與重組蛋白的偶聯(lián)情況。分別對(duì)磁珠的粒徑，以及EDC/NHS活化劑濃度、偶聯(lián)抗體濃度、偶聯(lián)時(shí)間、封閉劑種類等偶聯(lián)條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化選擇。
[0091]1.1磁珠粒徑的選擇
[0092]選擇粒徑為50nm、180nm、350nm、1150nm、3 μ m的羧基納米磁珠，均加入含4mg/mlEDC及4mg/ml NHS的PBS緩沖液進(jìn)行活化反應(yīng)后，分別與重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白偶聯(lián)反應(yīng)。分別將制備好的羧基納米磁珠檢測(cè)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性血清，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，選擇熒光強(qiáng)度大，背景熒光干擾少，以及在磁場(chǎng)作用下分離速度較快者為最適磁珠粒徑。結(jié)果表明粒徑1150nm的磁珠最符合本發(fā)明的要求,確定最適羧基磁珠粒徑為1150nmo
[0093]1.2 EDC/NHS活化劑濃度的選擇
[0094]將反應(yīng)體系中EDC和NHS濃度各自設(shè)為I?10mg/ml后進(jìn)行濃度梯度組合，分別活化粒徑1150nm的羧基納米磁珠。將制備好的羧基納米磁珠檢測(cè)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性血清，選擇熒光最強(qiáng)者為EDC和NHS溶液的最適活化濃度。結(jié)果表明當(dāng)EDC濃度為5mg/ml、NHS濃度為4mg/ml時(shí)偶聯(lián)效果最好。
[0095]1.3偶聯(lián)抗原濃度的選擇
[0096]將10μ g、50y g、100y g、150y g、200y g、250y g、300y g 的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白分別與Img按上述最優(yōu)方法活化的粒徑為1150 nm的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)。將制備好的羧基納米磁珠分別檢測(cè)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重組蛋白的投放量小于200μ g/mg時(shí)，熒光強(qiáng)度隨著抗體的濃度增加而增加，而當(dāng)重組蛋白的投放量大于200 μ g/mg時(shí)，熒光強(qiáng)度基本不變甚至略有減小，因此本實(shí)施例選擇重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的偶聯(lián)量為200 μ g/mg。
[0097]1.4偶聯(lián)時(shí)間的選擇
[0098]確定磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度及抗體偶聯(lián)量后，將重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白與磁珠的偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為0.5h、lh、2h、3h、4h、5h。將制備好的羧基納米磁珠分別檢測(cè)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)偶聯(lián)時(shí)間>3h時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，此后再延長(zhǎng)偶聯(lián)時(shí)間，熒光不再增強(qiáng)。因此，確定重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白與磁珠的最適偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為3h。偶聯(lián)時(shí)間遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)ELISA法的24h。
[0099]1.5封閉劑的選擇
[0100]按照上述確定的最優(yōu)條件選擇磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度、抗體偶聯(lián)量及偶聯(lián)時(shí)間后進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。偶聯(lián)結(jié)束后，選擇BSA，乙醇胺，Tris和D-氨基葡萄糖鹽酸鹽作為納米磁珠封閉劑，制得成品羧基納米磁珠。將制備好的納米磁珠分別檢測(cè)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙醇胺作為封閉劑的納米磁珠的檢測(cè)熒光值最高。推測(cè)由于乙醇胺的分子較小，可以較好的消耗由于空間位阻未與抗體結(jié)合的表面羧基，使封閉更為完全，并且有效減少空間位阻效應(yīng)對(duì)已連接抗體的結(jié)構(gòu)影響。
[0101]同時(shí)，以偶聯(lián)了重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的羧基納米磁珠作為固相載體，對(duì)應(yīng)的量子點(diǎn)標(biāo)記的鼠抗人IgG單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立抗人肺炎鏈球菌IgG抗體的檢測(cè)體系，對(duì)相應(yīng)的檢測(cè)體系中的重組蛋白偶聯(lián)磁珠的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該檢測(cè)體系中的最佳偶聯(lián)條件均與上述步驟1.1-1.5所給出的結(jié)果完全一致。
[0102]2.偶聯(lián)過(guò)程:
[0103]取5mg磁珠(以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為1150nm的羧基磁珠)于1.5ml普通離心管中，用lml MES緩沖液(2g/L MES, pH6.0)洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離(0.4T)后移除上清，依次加入用上述MES緩沖液配制的濃度為10mg/ml的EDC溶液及用上述MES緩沖液配制的濃度為8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，磁分離后移除上清，用Iml上述的MES緩沖液重懸；取5個(gè)離心管，每個(gè)離心管中加入200 μ L上述活化的磁珠，磁分離后吸出上清，向各管中加入用PBS緩沖液(8g/L NaCL, 0.2g/LKCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, ρΗ7.4)稀釋的濃度為 200 μ g/ml 的實(shí)施例1所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各lml,室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h，磁分離移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基。磁分離后移除各管上清，各用 Iml 洗滌緩沖液(8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.5ml/L Tween-20,pH7.4)洗滌三遍，最后各用 Iml 保存緩沖液(8g/L NaCL, 0.2g/L KCl,0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/L NaN3, 5g/L BSA, pH7.4)重懸磁珠，置于 4°C保存?zhèn)溆?，至此制得抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠。
[0104]實(shí)施例3多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針的制備
[0105]1.納米羧基量子點(diǎn)標(biāo)記鼠抗人IgM單克隆抗體反應(yīng)條件的優(yōu)化:
[0106]1.1、羧基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳標(biāo)記pH的確定
[0107]將標(biāo)記反應(yīng)中磷酸鹽緩沖液pH分別設(shè)為5，6，7，8，9，對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，觀察不同PH值對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響，確定了量子點(diǎn)標(biāo)記單抗反應(yīng)的最佳pH為7.0-8.0。本實(shí)驗(yàn)選擇pH7.4。
[0108]1.2、羧基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳標(biāo)記量的確定
[0109]將量子點(diǎn)摩爾濃度與單抗?jié)舛戎确謩e設(shè)置為1:1，1:2，1:3及1:4，進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)后，對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，觀察二者不同濃度比對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響，確定量子點(diǎn)標(biāo)記鼠抗人IgM單克隆抗體反應(yīng)的最佳摩爾濃度比為量子點(diǎn)與抗體摩爾比為1:3。本實(shí)驗(yàn)選擇該最優(yōu)濃度比來(lái)確定標(biāo)記量。
[0110]1.3、羧基量子點(diǎn)標(biāo)記抗體探針最佳封閉劑種類的確定
[0111]以乙醇胺、Tris, PEG2000-NH2或者BSA作為封閉劑，按步驟1.1及1.2確定的條件進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)后，對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物利用全光譜儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，觀察不同的封閉劑對(duì)于標(biāo)記反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEG2000-NH2為最佳封閉劑，其可顯著提高標(biāo)記復(fù)合物的膠體穩(wěn)定性及免疫活性。
[0112]納米羧基量子點(diǎn)標(biāo)記鼠抗人IgG單克隆抗體反應(yīng)的條件優(yōu)化結(jié)果與步驟1.1-1.3描述的納米羧基量子點(diǎn)標(biāo)記鼠抗人IgM單克隆抗體反應(yīng)相關(guān)條件的優(yōu)化結(jié)果均完全一致。
[0113]2.標(biāo)記過(guò)程:
[0114]向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點(diǎn)(發(fā)射波長(zhǎng)520nm)、600nmolN-羥基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和600nmol碳二亞胺(EDC)，以磷酸鹽緩沖液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，pH 7.4)定容為2ml，不停地混合溶液，37°C反應(yīng)30min后,透析去除過(guò)量的作為活化劑的sulfo-NHS與EDC。在活化的量子點(diǎn)中，加入12nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇(PEG2000_NH2)至終濃度為1%，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)lh。用0.2μπι PES濾器過(guò)濾除去抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離心管中，以SOOOg離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和反應(yīng)中的副產(chǎn)物。收集超濾管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，pH 7.4)中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離心管中，以SOOOg離心力在4°C下離心15min，收集超濾管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L BSA,
0.3g/L疊氮鈉，pH 7.4)中，至此制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgM納米探針，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0115]按上述相同方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的羧基水溶性量子點(diǎn)制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgG納米探針。將上述兩種量子點(diǎn)標(biāo)記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0116]實(shí)施例4羧基納米磁珠對(duì)人肺炎鏈球菌抗原進(jìn)行免疫捕獲條件的優(yōu)化
[0117]以偶聯(lián)了重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的磁珠作為固相載體，多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針作為檢測(cè)抗體，建立人肺炎鏈球菌抗體的檢測(cè)體系。分別對(duì)檢測(cè)體系中羧基納米磁珠的用量，捕獲時(shí)間等條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化選擇。
[0118]實(shí)驗(yàn)1.羧基納米磁珠加入量的選擇
[0119]將5μ 1、10μ 1、20μ 1、30μ 1、50μ 1、70μ I的由實(shí)施例2所制備好的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠分別加入到0.5ml含抗人肺炎鏈球菌IgG抗體的人血清稀釋液中，進(jìn)行免疫捕獲，再由實(shí)施例3所描述的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針進(jìn)行檢測(cè)，記錄熒光值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著羧基納米磁珠加入量的增加，熒光值逐漸增大，當(dāng)羧基納米磁珠加入量達(dá)到20 μ I時(shí)，熒光值達(dá)到最大。再繼續(xù)增加羧基納米磁珠的量，熒光值反而降低。故本實(shí)驗(yàn)選擇20 μ I作為納米磁珠的最佳加入量。
[0120]實(shí)驗(yàn)2.免疫捕獲時(shí)間的選擇
[0121]確定磁珠的加入量后，取四份實(shí)施例2所制備好的納米磁珠，在室溫下以1r/min,對(duì)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行5min、lOmin、15min、20min、30min及40min的免疫捕獲，再由實(shí)施例3所描述的量子點(diǎn)標(biāo)記探針進(jìn)行檢測(cè)，記錄熒光值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熒光值在免疫捕獲15min時(shí)表現(xiàn)出最大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，數(shù)值有所下降。故本實(shí)驗(yàn)選擇15min作為免疫捕獲的最佳時(shí)間。
[0122]同時(shí)，以偶聯(lián)了重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的羧基納米磁珠作為固相載體，對(duì)應(yīng)的量子點(diǎn)標(biāo)記的鼠抗人IgG單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立抗人肺炎鏈球菌IgG抗體的檢測(cè)體系，對(duì)相應(yīng)的檢測(cè)體系中的捕獲條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述檢測(cè)體系中的最佳捕獲條件均與上述實(shí)驗(yàn)I及實(shí)驗(yàn)2所給出的結(jié)果完全一致。
[0123]實(shí)施例5 PBST緩沖液的配制
[0124]取8g NaCL, 0.2g KC1,0.24 KH2PO4,1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3, 0.5mlTween-20溶解于900ml蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)整pH至7.4，再定容至1000ml。
[0125]實(shí)施例6質(zhì)控品的制備
[0126]6.1)陽(yáng)性質(zhì)控品:
[0127]6.1.1)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽(yáng)性的血清構(gòu)成；
[0128]6.1.2)抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽(yáng)性質(zhì)控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性的血清構(gòu)成；
[0129]6.2)陰性質(zhì)控品:由0.5ml抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構(gòu)成。
[0130]實(shí)施例7試劑盒的制備
[0131]由實(shí)施例2所描述的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠溶液2ml、實(shí)施例3所描述的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針溶液5ml、實(shí)施例5所描述的PBST緩沖液200ml、實(shí)施例6所描述的質(zhì)控品一套共同組成基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒。
[0132]實(shí)施例8待檢血清稀釋度的確定
[0133]用臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM抗體分別為陰性及陽(yáng)性的人血清樣本各20份，用PBSA緩沖液分別進(jìn)行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800，1:1600倍稀釋，
選擇陽(yáng)性血清與陰性血清的檢測(cè)熒光數(shù)值之比>3的最高稀釋度作為待檢血清的最適工作濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200倍稀釋的效果最佳。
[0134]同樣，用臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgG抗體分別為陰性及陽(yáng)性的人血清樣本各20份，用PBSA緩沖液分別進(jìn)行I:50,1:100、1:200、1:400、1:800，1:1600倍稀釋，選擇陽(yáng)性血清與陰性血清的檢測(cè)熒光數(shù)值之比>3的最高稀釋度作為待檢血清的最適工作濃度。結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，200倍稀釋的效果最佳。
[0135]實(shí)施例9試劑盒的使用方法
[0136]I)取待檢血清樣本5 μ I用995 μ I PBSA緩沖液稀釋(200倍稀釋)后將稀釋液轉(zhuǎn)入1.5ml普通離心管中；
[0137]2)向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)15min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清；
[0138]3)添加基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩沖液Iml洗滌兩遍，采用納米磁分離器磁分離后吸出洗滌液，最后用
0.2ml PBS緩沖液重懸磁珠，制得納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點(diǎn)“三明治”復(fù)合物；
[0139]4)將步驟3)得到的0.2ml納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點(diǎn)復(fù)合物載于酶標(biāo)板中，使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)同為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為520nm及600nm的參數(shù)下分別對(duì)其熒光值進(jìn)行分別讀數(shù)；
[0140]5)⑶T-OFF值的確定:按與上述步驟I)-4)同樣的方法檢測(cè)100份經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本，分別讀取發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為520nm及600nm下的突光值；所述100份經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的熒光值的平均值(58.3)與3倍標(biāo)準(zhǔn)差(11.66)之和記為⑶T-OFFl值(93.28);所述100份經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的熒光值的平均值(42.5)與3倍標(biāo)準(zhǔn)差(9.8)之和記為CUT-0FF2值(71.9)；
[0141]6)按與上述步驟1)-4)相同的方法同時(shí)檢測(cè)試劑盒中提供的四份陰性質(zhì)控品樣品及四份陽(yáng)性質(zhì)控品樣品，分別讀取發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為520nm及600nm下的熒光值；四份陰性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的熒光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的熒光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的熒光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽(yáng)性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為及600nm下的熒光值記為PCX2 ;若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的檢測(cè)熒光值大于⑶T-OFFl值(93.28)且PCX1/NCX1 ^ 2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽(yáng)性；若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為520nm的檢測(cè)熒光值小于⑶T-OFFl值(93.28)且PCX1/NCX1 ^ 2.1，則判斷為人待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性；若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的檢測(cè)熒光值大于CUT-0FF2值(71.9)且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性；若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)(Em)為600nm的檢測(cè)熒光值小于⑶T-0FF2值(71.9)且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性；gPCXl/NCXl< 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
[0142]實(shí)施例10試劑盒的特異性試驗(yàn)
[0143]用呼吸道常見(jiàn)病原體如人呼吸道合胞病毒、人肺炎支原體、人肺炎衣原體、人腺病毒3型、人腺病毒7型、人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、人流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌感染者的相應(yīng)病原體抗體呈陽(yáng)性的血清來(lái)代替人肺炎鏈球菌抗體陽(yáng)性血清用實(shí)施例7所述的試劑盒按實(shí)施例9所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
[0144]實(shí)施例11臨床測(cè)試?yán)?br> [0145]應(yīng)用本發(fā)明制備的基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒對(duì)臨床診斷明確的抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性血清樣本60份和陰性血清樣本80份進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1。
[0146]表1抗人肺炎鏈球菌IgM抗體臨床血清檢驗(yàn)結(jié)果
[0147]

【權(quán)利要求】
1.一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟: 1)重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備； 2)將步驟I)制備得到的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白與納米磁珠通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制得抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠； 3)將鼠抗人IgM單克隆抗體與發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的納米量子點(diǎn)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgM納米探針；將鼠抗人IgG單克隆抗體與發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的納米量子點(diǎn)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，制備量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgG納米探針；將量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgM納米探針與量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgG納米探針等量混合即制得多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針； 4)取人血清樣本，用PBSA緩沖液適當(dāng)稀釋后，分別向血清稀釋液中加入步驟2)制備得到的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠以及步驟3)制備得到的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針，充分混合，反應(yīng)10-45min后進(jìn)行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使用熒光酶標(biāo)儀，在發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm及600nm下分別讀取熒光值；所述PBSA緩沖液中各組分含量分別為:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA ;所述PBSA緩沖液的pH = 7.4 ;所述PBST緩沖液中各組分含量分別為:8g/L NaCL,0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA，0.3g/L NaN3,0.5ml/L Tween-20 ；所述PBST緩沖液的pH = 7.4 ; 5)根據(jù)步驟4)的方法檢測(cè)至少30份經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清，分別讀取發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm及600nm下的熒光值；所述抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清簡(jiǎn)稱人肺炎鏈球菌抗體陰性對(duì)照樣品；所述人肺炎鏈球菌抗體陰性對(duì)照樣品在發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為CUT-OFFl值；所述人肺炎鏈球菌抗體陰性對(duì)照樣品在發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為⑶T-0FF2值；若步驟4)中人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的檢測(cè)熒光值大于CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽(yáng)性；若步驟4)中人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的檢測(cè)熒光值小于CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性；若步驟4)中人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的檢測(cè)熒光值大于CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性；若步驟4)中人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的檢測(cè)熒光值小于CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性。
2.一種基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒，其特征在于:所述基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒由具有富集抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠、多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質(zhì)控品以及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包括陽(yáng)性質(zhì)控品以及陰性質(zhì)控品；所述陽(yáng)性質(zhì)控品由兩份人肺炎鏈球菌感染者的抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性的血清及兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性的血清組成；所述陰性質(zhì)控品是四份抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清。
3.一種用于制備如權(quán)利要求2所述的基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的方法,其特征在于:所述方法包括以下步驟: I)抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠的制備: 1.1)重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備、純化: 1.1.D對(duì)人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分別獲取人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對(duì)應(yīng)的基因序列； 1.1.2)在步驟1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分別引入酶切位點(diǎn)并分別化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為PspAl、PspA2 ； 1.1.3)將步驟1.1.2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物學(xué)方法分別克隆入表達(dá)載體pET-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白均以可溶性表達(dá)形式存在于基因工程菌體中； 1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組PspAl-His, PspA2_His融合蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，用PBS緩沖液分別透析過(guò)夜；收集透析液，經(jīng)bradford試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定后，用PBS緩沖液分別調(diào)整濃度均為2mg/mL ;所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/LNa2HP04，所述 PBS 緩沖液的 pH=7.4 ； 1.1.5)將步驟1.1.4)得到的兩種重組蛋白溶液按體積比1:1混合即制得重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白； 1.2)納米磁珠的包被: 1.2.1)取5mg磁珠，用Iml MES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、粒徑為1150nm的羧基磁珠；所述MES緩沖液是質(zhì)量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES緩沖液的pH = 6.0 ;所述納米磁分離器的磁性強(qiáng)度是0.4T ； 1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8_12mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以10-40rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠； 1.2.3)取5個(gè)離心管，在每個(gè)離心管中加入200 μ L步驟1.2.2)所得到的活化后的磁珠，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為100-400 μ g/ml的由步驟1.1.5)所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各1ml，室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2_6h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液,室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)2 h以封閉磁珠上未與抗體反應(yīng)的羧基；所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/LNaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,所述 PBS 緩沖液的 pH = 7.4 ； 1.2.4)封閉反應(yīng)完成后，將該5個(gè)離心管置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/LKC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.5ml/L Tween-20，所述洗滌緩沖液的 pH = 7.4 ； 1.2.5)向各個(gè)離心管中分別加入Iml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存?zhèn)溆茫恢链酥频每谷朔窝祖溓蚓贵w捕獲納米磁珠；所述保存緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/LNaN3，5g/L BSA，所述保存緩沖液的pH=7.4 ； 2)多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針的制備: 其具體制備方法包括: 2.1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點(diǎn)、600nmol N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為5ml，混合溶液，37°C反應(yīng)30min后,透析去除過(guò)量的作為活化劑的sulfo-NHS及E:DC,得到活化后的量子點(diǎn)；所述羧基水溶性量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)是520nm ;所述磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩沖液的pH = 7.4 ; 2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入8-16nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為I %，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)Ih ； 2.3)用0.2μπι PES濾器過(guò)濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉(zhuǎn)移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的抗體和反應(yīng)中的副產(chǎn)物； 2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50000 MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點(diǎn)-抗體偶聯(lián)物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液中，置于4°C保存?zhèn)溆?，至此制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgM納米探針；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH = 7.4 ;所述磷酸鹽保存液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH = 7.4 ; 2.5)按與步驟2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的羧基水溶性量子點(diǎn)制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人IgG納米探針；將上述兩種量子點(diǎn)標(biāo)記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針； 3)PBST緩沖液的配制: 其具體配制方法包括:
取 8g NaCL, 0.2g KC1,0.24 KH2PO4,1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3,0.5ml Tween-20溶解于900ml蒸餾水中，用5M NaOH調(diào)整pH至7.4，再定容至100ml ； 4)質(zhì)控品的制備: 4.1)陽(yáng)性質(zhì)控品: 4.1.1)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽(yáng)性的血清構(gòu)成； 4.1.2)抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽(yáng)性質(zhì)控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性的血清構(gòu)成； 4.2)陰性質(zhì)控品:由0.5ml抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述步驟1.2.2)中，依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠； 所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為200 μ g/ml的由步驟1.1.5)所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各Iml,室溫下以15rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀中反應(yīng)3h，置于納米磁分離器中進(jìn)行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液； 所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點(diǎn)中，加入12nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應(yīng)2h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述量子點(diǎn)是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內(nèi)核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團(tuán)為羧基、粒徑為1150nm的羧基磁珠。
7.一種基于如權(quán)利要求2所述的基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的使用方法，其特征在于:所述使用方法包括以下步驟: 1)取待檢血清樣本5μ I用995 μ I PBSA緩沖液稀釋后將稀釋液轉(zhuǎn)入1.5ml普通離心管中；所述PBSA緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA ;所述 PBSA 緩沖液的 pH = 7.4 ； 2)向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠10-100 μ I及基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)5-25min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清； 3)添加基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩沖液Iml洗滌兩遍，采用納米磁分離器磁分離后吸出洗滌液，最后用0.2mlPBS緩沖液重懸磁珠，制得納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點(diǎn)“三明治”復(fù)合物；所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4Jy^iPBS緩沖液的pH = 7.4 ； 4)將步驟3)得到的納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點(diǎn)復(fù)合物載于酶標(biāo)板中，使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)同為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm及600nm的參數(shù)下分別對(duì)其熒光值進(jìn)行分別讀數(shù)； 5)按上述同樣的方法檢測(cè)至少30份經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本，分別讀取發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm及600nm下的熒光值；所述經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為CUT-OFFl值；所述經(jīng)臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的熒光值的平均值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和記為CUT-0FF2值；同時(shí)檢測(cè)試劑盒中提供的四份陰性質(zhì)控品樣品及四份陽(yáng)性質(zhì)控品樣品，分別讀取發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm及600nm下的熒光值；四份陰性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的熒光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的熒光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽(yáng)性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的熒光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽(yáng)性質(zhì)控品樣品在發(fā)射波長(zhǎng)為及600nm下的熒光值記為PCX2 ； 若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的檢測(cè)熒光值大于CUT-OFFl值且PCX I/NCXI ^ 2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽(yáng)性； 若步驟4)中待檢樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為520nm的檢測(cè)熒光值小于CUT-OFFl值且PCXl/NCXl ^ 2.1，則判斷為人待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性； 若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的檢測(cè)熒光值大于CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽(yáng)性； 若步驟4)中待檢血清樣本在發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的檢測(cè)熒光值小于CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性； 若PCX1/NCX1 < 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述步驟2)中，向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基于磁性分離和多色量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點(diǎn)分別標(biāo)記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ 1，室溫下以10rpm/min于旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)15min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104181302SQ201410404733
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】胡征, 楊波 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)