一種檢測hev抗體的方法及試劑盒和該試劑盒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測HEV抗體的方法及試劑盒和該試劑盒的制備方法，本發(fā)明采用雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，解決了以往的HEV?IgG抗體和IgM抗體需單個(gè)檢測或聯(lián)合檢測時(shí)不能區(qū)分IgG抗體和IgM抗體的難點(diǎn)；實(shí)現(xiàn)了微量化檢測HEV?IgG抗體和IgM抗體；采用對(duì)患者血清中的HEV?IgG抗體和IgM抗體的聯(lián)合檢測,還可以提高HEV的臨床檢出率,有助于疾病的診斷與預(yù)防；所述試劑盒的抗原包含了多個(gè)主要抗原表位，能在最大程度上降低漏檢情況的發(fā)生。本發(fā)明的試劑盒具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、檢測方法簡便、高效等特點(diǎn)。
【專利說明】一種檢測HEV抗體的方法及試劑盒和該試劑盒的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測戊型肝炎病毒抗體的方法及試劑盒，具體涉及一種基于雙標(biāo) 記時(shí)間分辨熒光免疫法檢測戊型肝炎病毒抗體的方法及試劑盒和該試劑盒的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 戊型病毒性肝炎是由戊型肝炎病毒（HEV)引起的，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎性壞死為主的 腸道傳播性疾病?；颊咧饕獮槌赡耆耍∷缆瘦^高，尤其孕期最后3個(gè)月的妊娠婦女患病 后，病死率可達(dá)10%?39%。戊型病毒性肝炎，首先在印度次大陸發(fā)現(xiàn)，中亞、東南亞、非 洲、印度次大陸均有較大流行的報(bào)道。多數(shù)爆發(fā)流行為水源性的。食源性的報(bào)道亦見諸文 獻(xiàn)。我國人群戊型肝炎的感染率約18%。急性散發(fā)性肝炎中戊肝約占10%，是我國乙類法 定傳染病之一。
[0003] HEV最初曾被劃分為杯狀病毒科，2005年國際病毒學(xué)分類委員會(huì)（ICTV)將其單獨(dú) 門類為戊型肝炎病毒屬（hepevirus)，將與人類疾病相關(guān)的HEV分為4個(gè)基因型（HEV-1? 4)。但僅有1個(gè)血清型。HEV-1是發(fā)展中國家戊型肝炎暴發(fā)流行及散發(fā)流行的主要病 因，HEV-2僅在南美洲和非洲少數(shù)國家中有報(bào)道，而發(fā)達(dá)國家的本土戊型肝炎病例主要由 HEV-3或HEV-4導(dǎo)致。迄今在我國戊型肝炎患者中僅發(fā)現(xiàn)HEV-1和HEV-4。
[0004] 戊型肝炎潛伏期2?9周，平均約40d。根據(jù)流行病學(xué)史、臨床癥狀和體征及實(shí)驗(yàn) 室檢查結(jié)果，并結(jié)合患者具體情況及動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行綜合分析，做出診斷。
[0005] HEV急性感染的診斷指標(biāo)包括：抗-HEV IgM陽性；抗-HEV IgG陽轉(zhuǎn)或含量有4倍 及以上升高；血清和（或）糞便HEV RNA陽性。一般情況下這3項(xiàng)指標(biāo)的任何一項(xiàng)陽性都 可作為HEV急性感染的臨床診斷依據(jù)，如同時(shí)有2項(xiàng)指標(biāo)陽性則可確診。（1)抗-HEV IgM 陽性戊型肝炎臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)絕大部分已可檢出IgM抗體，并且在3個(gè)月內(nèi)快速消退，但少 數(shù)患者在6個(gè)月后仍可檢出較低水平的IgM抗體。因此，當(dāng)抗-HEV IgM水平較低時(shí)（檢 測值低于試劑盒臨界值的2倍），還應(yīng)結(jié)合抗-HEV IgG水平及其動(dòng)態(tài)變化、HEV RNA檢測 結(jié)果、患者自身所處的免疫功能狀態(tài)等進(jìn)行綜合判斷。（2)抗-HEV IgG陽轉(zhuǎn)或含量有4倍 及以上升高，這一指標(biāo)需定量檢測雙份血清，不利于早期診斷。由于HEV感染的潛伏期相 對(duì)較長，在患者就診時(shí)IgG抗體常已陽轉(zhuǎn)并達(dá)到較高水平，限制了這一指標(biāo)的診斷實(shí)用性。 (3)血清和（或）糞便HEV RNA陽性HEV RNA的檢出是HEV現(xiàn)癥感染的直接證據(jù)。但考慮 到目前HEV RNA的檢測主要采用RT-PCR的方法，易因操作不當(dāng)或環(huán)境條件不佳而造成假陽 性。因此在HEV RNA陽性時(shí)，還需結(jié)合血清抗-HEV IgM、抗-HEV IgG水平或動(dòng)態(tài)變化等進(jìn) 行綜合判斷。在戊型肝炎臨床癥狀開始的1?2周內(nèi)，70%?80%患者的糞便、血清中可檢 出HEV RNA，隨后陽性率顯著下降。由于HEV感染的潛伏期相對(duì)較長，20%?30%的患者在 發(fā)病時(shí)體內(nèi)HEV已基本被清除，因此HEV RNA陰性并不能排除HEV急性感染。在一般臨床 實(shí)踐和研究中，抗-HEV IgG的檢測結(jié)果因試劑和方法的不同會(huì)有較大差異，而且單份血清 IgG檢測陽性難以區(qū)分急性感染和既往感染，因此除非能比較雙份血清的動(dòng)態(tài)變化，一般不 宜作為HEV急性感染的診斷依據(jù)。國內(nèi)外依賴于構(gòu)象性抗原研制的抗-HEV IgM檢測試劑 已較成熟，抗-HEV IgM已成為臨床上最主要的HEV急性感染診斷指標(biāo)，IgM抗體陽性且IgG 抗體陽性一般即可診斷；若IgM抗體陰性而患者處于發(fā)病早期則需進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察；在個(gè)別 情況下IgM抗體陽性但I(xiàn)gG抗體陰性，也需進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。采用對(duì)患者血清中的HEV抗體 (IgG+IgM)的聯(lián)合檢測，還可以提高HEV的臨床檢出率，有助于疾病的診斷與預(yù)防。
[0006] 戊型肝炎在全球各地還存在不同程度爆發(fā)和散發(fā)流行，但隨著流行病學(xué)不斷深入 的調(diào)查和積極的干預(yù)措施，提高人們對(duì)戊型肝炎的認(rèn)識(shí)。以及臨床檢測手段的不斷提高，將 更有助于降低戊型肝炎的患病率，提高人們的生活質(zhì)量。
[0007] 研究表明，提高HEV診斷價(jià)值的首要因素是抗原位點(diǎn)的選擇，HEV抗原表位主要分 布在0RF2和0RF3,理想的診斷試劑應(yīng)包含0RF2及0RF3主要抗原表位，大部分HEV抗體陽 性血清既能和0RF2重組抗原反應(yīng)，也能和0RF3合成肽反應(yīng)。有少部分血清僅針對(duì)0RF2或 0RF3區(qū)抗原呈單陽性反應(yīng)。其中較大的0RF2區(qū)編碼膜結(jié)構(gòu)蛋白，含有較多的抗原表位，而 且相應(yīng)抗體的半衰期較長，因而用于ELISA診斷的敏感性高。在以往的研究中，對(duì)0RF3區(qū) 蛋白的研究不如0RF2,但0RF3區(qū)蛋白也包含了多個(gè)線性抗原表位，在機(jī)體免疫反應(yīng)中起了 重要作用。為提高重組蛋白與合成肽抗原在HEV檢測中的診斷價(jià)值，應(yīng)盡可能多地保留各 種毒株的高效抗原表位，從而減少變異株所致的HEV檢測中漏檢的可能。合成肽抗原是通 過固相合成的方法制備，無需純化，由于沒有宿主菌蛋白混雜，且分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，避免 了與其他抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的可能，因而特異性高；但由于合成肽一般肽鏈比較短，包含的 抗原位點(diǎn)較少，影響了陽性的檢出率。目前，商品化的試劑盒分別以0RF2部分片段重組蛋 白（如北京萬泰試劑盒）、以0RF2片段為模板序列合成的多肽和0RF3重組蛋白的混合抗原 (如Genelabs試劑盒）和合成肽（如上?？迫A試劑盒）為抗原。
[0008] 目前抗-HEV常用方法有放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA)、酶 聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)、化學(xué)發(fā)光 免疫分析法（chemiluminescent immunoassay, CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法 (electro-chemiluminescence immunoassay，ECLI)等。RIA 由于放射性污染，對(duì)環(huán)境和 操作者影響較大，批內(nèi)批間變異較大，難于自動(dòng)化；ELISA采用大分子酶標(biāo)記，且酶容易 失活，這種依靠比色法或偏振光法的檢測技術(shù)所受的干擾因素太多（即使是優(yōu)秀的"管 式ELISA"，其試管形狀的變化也會(huì)影響試驗(yàn)的結(jié)果），其靈敏度、線性和穩(wěn)定性未能高于 RIA ;CLIA的化學(xué)發(fā)光通常是瞬間完成，發(fā)光峰值很快衰減，溫度和pH值對(duì)發(fā)光有很大影 響，該類因素影響了該類方法的應(yīng)用；ECLI仍為非開放系統(tǒng)，試劑依賴進(jìn)口，試劑昂貴， 維修及檢測成本高，這也限制了其推廣應(yīng)用。由于時(shí)間分辨熒光免疫法（time-resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)獨(dú)特的技術(shù)原理，有區(qū)別于傳統(tǒng)的免疫標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu) 勢(shì)，已被人們廣泛接受，與現(xiàn)在廣泛使用的RIA、ELISA、CLIA和ECLI相比，TRFIA克服了 RIA 放射性污染的不足、酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定性和定量范圍窄的缺陷、化學(xué)發(fā)光僅能一次發(fā)光、一 般熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾的難點(diǎn)和ECLI的非直接標(biāo)記等缺點(diǎn)，Eu標(biāo)記TRFIA的靈敏度可達(dá) l(T19m〇l/L，應(yīng)用范圍廣，致使其試劑盒的生產(chǎn)和檢測儀器的更新?lián)Q代進(jìn)展甚速，目前已實(shí) 現(xiàn)了分析技術(shù)的自動(dòng)化，TRFIA已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)最有發(fā) 展前景的分析手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種基于雙標(biāo)記時(shí)間 分辨熒光免疫法檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，以及所述試劑盒的制備方法，本發(fā)明還 提供了一種采用所述試劑盒檢測HEV抗體的方法。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，所述 試劑盒包括：包被有HEV抗原的固相載體，與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體，校 準(zhǔn)品，樣本稀釋液，實(shí)驗(yàn)緩沖液，濃縮洗液以及增強(qiáng)液。
[0011] 優(yōu)選地，所述包被有抗原的固相載體中抗原為含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV 重組抗原。
[0012] 優(yōu)選地，所述包被有HEV抗原的載體是采用以下步驟制備而得的：
[0013] 將HEV抗原用包被緩沖液稀釋，在固相載體上進(jìn)行包被，將固相載體洗滌1次，然 后再用封閉液進(jìn)行封閉，將固相載體甩干，晾干，真空包裝，2?8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0014] 優(yōu)選地，所述與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體為Eu3+標(biāo)記的鼠抗人IgG 抗體和Sm3+標(biāo)記的鼠抗人μ鏈抗體的組合。當(dāng)所述與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢 測抗體為Eu 3+標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體和Sm3+標(biāo)記的鼠抗人μ鏈抗體的組合時(shí)，所述Eu3+標(biāo) 記的鼠抗人IgG抗體和所述Sm 3+標(biāo)記的鼠抗人μ鏈抗體在本發(fā)明所述試劑盒中是分開儲(chǔ) 存的，在使用時(shí)再聯(lián)合加入。
[0015] 優(yōu)選地，所述Eu3+標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體是參照Eu3+標(biāo)記試劑盒說明書操作而制 備的，所述Sm 3+標(biāo)記的鼠抗人μ鏈抗體是參照Sm3+標(biāo)記試劑盒說明書操作而制備的。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種采用上述所述試劑盒檢測HEV抗體的方法，所述方法包括以 下步驟：
[0017] (1)用實(shí)驗(yàn)緩沖液配制與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體；
[0018] (2)用純化水將濃縮洗液稀釋成工作洗滌液；
[0019] (3)將待檢樣本用樣本稀釋液稀釋，將校準(zhǔn)品或已稀釋待檢樣本加入到包被有 HEV抗原的固相載體中；
[0020] (4)固相載體在室溫下孵育；
[0021] (5)用步驟（2)中工作洗滌液洗滌抗原固相載體；
[0022] (6)加入步驟（1)中配制的與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體，在室溫下 孵育；
[0023] (7)用步驟⑵中工作洗滌液洗滌抗原固相載體；
[0024] (8)加入增強(qiáng)液，繼續(xù)孵育；
[0025] (9)孵育結(jié)束后，采用對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記窗口檢測程序進(jìn)行檢測并分析。
[0026] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體為Eu3+標(biāo)記 的鼠抗人IgG抗體和Sm 3+標(biāo)記的鼠抗人μ鏈抗體的組合。
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中包被有抗原的固相載體中抗原為含有0RF2和0RF3抗原 表位的HEV重組抗原。
[0028] 本發(fā)明還提供了一種上述所述試劑盒的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0029] (1)制備包被有HEV抗原的固相載體；
[0030] ⑵制備校準(zhǔn)品；
[0031] (3)制備與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體；
[0032] (4)制備樣本稀釋液、實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液以及增強(qiáng)液；
[0033] (5)貼標(biāo)簽；
[0034] (6)組裝為試劑盒。
[0035] 本發(fā)明的有益效果在于：目前，商品化的試劑盒所采用的診斷抗原多以HEV0RF3 表達(dá)蛋白與合成肽的混合抗原，或單以HEV 0RF2部分片段的表達(dá)蛋白，由于抗原表位的不 全，在HEV臨床診斷過程中常發(fā)生漏檢現(xiàn)象。本發(fā)明提供的檢測試劑盒的重組蛋白抗原包 含了 0RF2片段和0RF3全片段，含有多個(gè)主要抗原表位，能在最大程度上降低漏檢情況的發(fā) 生，克服了以合成多肽作為抗原的檢測試劑的弱點(diǎn)，提高了檢測試劑的敏感性，0RF3C端和 0RF2C端被認(rèn)為是抗原性較強(qiáng)的區(qū)域，對(duì)抗原決定簇的研究多數(shù)是針對(duì)這兩個(gè)區(qū)域開展的。 本發(fā)明采用雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，解決了以往的HEV IgG抗體和IgM抗體需 單個(gè)檢測或聯(lián)合檢測時(shí)不能區(qū)分IgG抗體和IgM抗體的難點(diǎn)；本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一個(gè)微孔檢測 能分別檢測出HEV IgG抗體和IgM抗體，也實(shí)現(xiàn)了試劑盒能同時(shí)定量檢測HEV IgG抗體和 IgM抗體；將試劑盒溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)血清物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了 HEV IgG抗體和IgM抗體檢測結(jié)果的 溯源性；利用了時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)的高靈敏和高特異的獨(dú)特技術(shù)原理，實(shí)現(xiàn)了微 量化檢測HEV IgG抗體和IgM抗體，采用對(duì)患者血清中的HEV IgG抗體和IgM抗體的聯(lián)合 檢測，還可以提高HEV的臨床檢出率，有助于疾病的診斷與預(yù)防。本發(fā)明的試劑盒具有檢 測結(jié)果準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、檢測方法簡便、高效等特點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為采用本發(fā)明所述試劑盒檢測本發(fā)明所述試劑盒中校準(zhǔn)品時(shí)校準(zhǔn)品中 HEVIgG抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0037] 圖2為采用本發(fā)明所述試劑盒檢測本發(fā)明所述試劑盒中校準(zhǔn)品時(shí)校準(zhǔn)品中 HEVIgM抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0038] 圖3為采用本發(fā)明所述試劑盒檢測企業(yè)HEV IgG抗體參考品時(shí)的劑量-反應(yīng)曲線 圖；
[0039] 圖4為采用本發(fā)明所述試劑盒檢測企業(yè)HEV IgM抗體參考品時(shí)的劑量-反應(yīng)曲線 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明 作進(jìn)一步說明。實(shí)施例中的HEV重組抗原、鼠抗人IgG抗體、鼠抗人μ鏈抗體購于Sigma 公司；固相載體為96孔微孔空白板（8X12孔）購于深圳市金燦華實(shí)業(yè)有限公司；銪 (Eu3+)與杉（Sm 3+)標(biāo)記試劑盒購于芬蘭Wallac公司；瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B購于 瑞典Pharmacia公司；HEV IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)090091]和HEV IgM抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) [GBW(E)090089]為北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司提供；HEV IgG抗體參考品和HEV IgM 抗體參考品為中國食品藥品檢定研究院提供；參比試劑盒為戊型肝炎病毒IgG抗體診斷試 劑盒（酶聯(lián)免疫法）和戊型肝炎病毒IgM抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法），由北京萬泰生 物藥業(yè)股份有限公司提供；第三方驗(yàn)證試劑盒為由意大利Dia. Pro Diagnostic Bioprobes S.r.l.公司提供的戊型肝炎病毒IgG、IgM抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法），以及由北京金 豪制藥股份有限公司提供的戊型肝炎病毒RNA檢測試劑盒（FQ-PCR法）。增強(qiáng)液、濃縮洗 液、實(shí)驗(yàn)緩沖液、FWZ- I型微量振蕩儀、DEM-III型全自動(dòng)酶標(biāo)洗板均由廣州市豐華生物工 程有限公司提供。VictorTM2D1420型TRFIA儀購于美國Perkin Elmer公司。其他試劑為 國產(chǎn)分析純。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 本發(fā)明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的一種實(shí)施例，所述試劑盒包括：包 被有HEV重組抗原的固相載體，Eu 3+標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體，Sm3+標(biāo)記的鼠抗人μ鏈抗體，校 準(zhǔn)品、樣本稀釋液、實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液以及增強(qiáng)液；所述HEV重組抗原含有0RF2和0RF3 抗原表位。
[0043] 本發(fā)明還提供了上述所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的制備方法，所述方法 包括以下步驟：
[0044] (1)制備包被有抗原的固相載體：將HEV重組抗原用包被緩沖液稀釋0. 1? 10 μ g/mL，在固相載體上進(jìn)行包被，將固相載體洗滌1次，然后再用封閉液進(jìn)行封閉，將固 相載體甩干，晾干，真空包裝，2?8°C保存?zhèn)溆?。?yōu)選地，所述包被緩沖液為50mmol/L、 pH9. 6的碳酸緩沖液，20mmol/L、pH4. 5的磷酸鹽緩沖液，50mmol/L、pH7. 8的Tris-HCl緩沖 液和50mmol/L、pH4. 5的檸檬酸鹽緩沖液中的一種，所述封閉液為含1%重量BSA和5%重 量鹿糖的50mmol/L、ρΗ7· 8的Tris-HCl緩沖液。
[0045] (2)制備所述Eu3+標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體：參照Eu3+標(biāo)記試劑盒說明書操作，將 1. 〇mg的鼠抗人IgG抗體加入Millipore公司的截留分子量為50000的超濾離心管中， 8000r/min離心5?6min，再用標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌6次，將處理得到的200μ L鼠抗人 IgG抗體加入到1. Omg的預(yù)先用標(biāo)記緩沖液溶解的Eu3+標(biāo)記試劑充分混勻，2?8°C振蕩 孵育48±2h ;反應(yīng)液經(jīng)用50mmol/L pH7. 80Tris-HCl緩沖液平衡的S印harose CL-6B柱 (lcmX40cm)層析，在A280監(jiān)測收集第一洗脫峰。優(yōu)選地，所述標(biāo)記緩沖液為50mmol/L、 pH9. 6的碳酸緩沖液。
[0046] 制備所述Sm3+標(biāo)記的鼠抗人μ鏈抗體：參照Sm3+標(biāo)記試劑盒說明書操作，將 1. Omg的鼠抗人μ鏈抗體加入Millipore公司的截留分子量為50000的超濾離心管中， 8000r/min離心5?6min，再用標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌6次，將處理得到的200 μ 1鼠抗人 μ鏈抗體加入到1. 〇mg的預(yù)先用標(biāo)記緩沖液溶解的Sm3+標(biāo)記試劑充分混勻，2?8°C振蕩 孵育48±2h。反應(yīng)液經(jīng)用50mmol/L pH7.80Tris-HCl緩沖液平衡的S印harose CL-6B柱 (lcmX40cm)層析，在A280監(jiān)測收集第一洗脫峰。
[0047] 將Eu3+標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體和Sm3+標(biāo)記的鼠抗人μ鏈抗體，分別用含有2g/ L BSA的50mmol/L、pH7. 8的Tris-HCl緩沖液稀釋成最適工作濃度的1/20倍，分別分裝成 0. 5ml/ 瓶。
[0048] (3)制備校準(zhǔn)品：分別以HEV IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)090091]和HEV IgM抗體 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)090089]為參比，將HEV IgG抗體和IgM抗體原料用含有10g/L BSA的 50mmol/L，pH7. 8的Tris-HCl緩沖液稀釋成A、B、C、D、E和F6個(gè)校準(zhǔn)品，其中A校準(zhǔn)品含 有0U/ml HEV IgG抗體和0U/ml HEV IgM抗體，B校準(zhǔn)品含有0.025U/ml HEV IgG抗體和 0.1U/ml HEV IgM 抗體，C 校準(zhǔn)品含有 0.050U/ml HEV IgG 抗體和 0.2U/ml HEV IgM 抗體，D 校準(zhǔn)品含有0. lOU/ml HEV IgG抗體和0. 5U/ml HEV IgM抗體，E校準(zhǔn)品含有0. 50U/ml HEV IgG 抗體和 2. OU/ml HEV IgM 抗體，F(xiàn) 校準(zhǔn)品含有 1. OU/ml HEV IgG 抗體和 4. OU/ml HEV IgM抗體，分裝成0· 5ml/瓶。
[0049] (4)樣本稀釋液：含有BSA、硫柳汞、Tris-HCl緩沖液，分裝成30ml/瓶。
[0050] ⑶實(shí)驗(yàn)緩沖液：含有小牛血清、染料、Tween2〇、EDTA、Procline 3〇0、Tris-HCl緩 沖液，分裝成30ml/瓶。
[0051] (6)濃縮洗液：含有Tween20及染料、Procline300、Tris-HCl緩沖液，分裝成 40ml/ 瓶。
[0052] (7)增強(qiáng)液：含曲拉通、冰乙酸、螯合劑、純化水，分裝成40ml/瓶。
[0053] (8)貼標(biāo)簽。
[0054] (9)組裝為試劑盒產(chǎn)品。
[0055] 上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出3份經(jīng)過特異性、靈敏度、精密性及穩(wěn)定 性檢定合格才能組裝成HEV IgG抗體和IgM抗體雙標(biāo)記測定試劑盒（時(shí)間分辨熒光免疫 法）。組裝完成后還需抽檢合格后才能出廠。
[0056] 實(shí)施例2
[0057] 本發(fā)明所述試劑盒實(shí)驗(yàn)方法簡單快速，可自動(dòng)化操作，檢測系統(tǒng)為開放式操作系 統(tǒng)，本發(fā)明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的使用方法，具體操作如下：
[0058] (1)試劑準(zhǔn)備
[0059] ①抗原固相載體：將試劑及所需數(shù)量的抗原固相載體平衡至室溫（20?25°C )。 余下的抗原固相載體及時(shí)置入自封袋密閉并于2?8°C保存。
[0060] ②洗滌液：將40ml濃縮洗液和960ml純化水在干凈的容器中混合，作為工作洗滌 液備用。純化水敬請(qǐng)用戶自備。
[0061] ③標(biāo)記物混合工作液：使用前30min內(nèi)配制，將Eu3+標(biāo)鼠抗人IgG抗體、Sm 3+標(biāo)鼠 抗人μ鏈抗體與實(shí)驗(yàn)緩沖液按體積比為Eu3+標(biāo)鼠抗人IgG抗體：Sm3+標(biāo)鼠抗人μ鏈抗體： 實(shí)驗(yàn)緩沖液=1:1:20的比例加進(jìn)潔凈的同一個(gè)一次性容器中并混勻；當(dāng)次實(shí)驗(yàn)用完。
[0062] (2)試驗(yàn)操作
[0063] ①將待測血清樣本用樣本稀釋液按1:10稀釋；吸取100 μ 1的抗_HEV(IgG+IgM) 校準(zhǔn)品或已稀釋樣本依次加入到抗原固相載體中。
[0064] ②抗原固相載體在室溫下，用振蕩孵育45min。
[0065] ③第一步孵育結(jié)束后，洗滌4次。
[0066] ④向每個(gè)反應(yīng)位中加入100 μ 1已配好的標(biāo)記物混合工作液。
[0067] ⑤在室溫下，振蕩孵育45min。
[0068] ⑥第二步孵育結(jié)束后，洗滌6次。
[0069] ⑦向每個(gè)反應(yīng)位中加入增強(qiáng)液100 μ 1。
[0070] ⑧固相載體于室溫下緩慢振蕩5min后檢測，在30min內(nèi)完成檢測并進(jìn)行分析。銪 (Eu 3+)標(biāo)記熒光檢測采用銪標(biāo)記窗口檢測程序，釤（Sm3+)標(biāo)記熒光檢測采用釤標(biāo)記窗口檢 測程序，并采用配套的分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析，采用本發(fā)明所述試劑盒檢測本發(fā)明所述試 劑盒中校準(zhǔn)品時(shí)校準(zhǔn)品中HEV IgG抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖1，采用本發(fā)明所述試劑盒檢測 本發(fā)明所述試劑盒中校準(zhǔn)品時(shí)校準(zhǔn)品中HEV IgM抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖2。
[0071] 實(shí)施例3
[0072] 本發(fā)明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的分析性能評(píng)價(jià)：
[0073] (l)HEV IgG抗體的檢測性能
[0074] 陰性參考品符合率：檢測HEV IgG抗體國家陰性參考品30支，陽性反應(yīng)不多于1 份；
[0075] 陽性參考品符合率：檢測HEV IgG抗體國家陽性參考品10支，陰性反應(yīng)不多于1 份；
[0076] 最低檢出限：檢測國家最低檢出限參考品6份，陽性反應(yīng)不少于3份且基質(zhì)血清 S1為陰性反應(yīng)；
[0077] 線性：檢測企業(yè)參考品，L1?L5共5個(gè)樣品測定值統(tǒng)計(jì)分析后，實(shí)測值與理論值 的線性相關(guān)系數(shù)r大于0.98,如圖3。
[0078] 準(zhǔn)確度：檢測企業(yè)參考品，L1?L5共5個(gè)樣品的實(shí)測值與理論值相對(duì)偏倚均在 ±20. 0% 內(nèi)。
[0079] 重復(fù)性：平行測定HEV IgG抗體國家精密度參考品10孔，實(shí)測濃度值的精密度（CV 值）彡15% ;
[0080] 穩(wěn)定性：試劑盒自成品生產(chǎn)之日起于37°C放置6天（有效期為12個(gè)月）；成品剩 余效期內(nèi)，則按37°C放置6天有效期為12個(gè)月推算37°C放置的時(shí)間進(jìn)行檢測，結(jié)果符合各 項(xiàng)目規(guī)定的要求。
[0081] (2)HEV IgM抗體的檢測性能
[0082] 陰性參考品符合率：檢測HEV IgM抗體國家陰性參考品20支，均為陰性反應(yīng) (20/20)；
[0083] 陽性參考品符合率：檢測HEV IgM抗體國家陽性參考品12支，均為陽性反應(yīng) (12/12)；
[0084] 重復(fù)性：平行測定HEV IgM抗體國家精密度參考品10孔，實(shí)測濃度值的精密度（CV 值）彡15% ;
[0085] 最低檢出量（稀釋度）：檢測國家靈敏度參考品，最低檢出量（稀釋度1:8 ;
[0086] 線性：檢測企業(yè)參考品，L1?L5共5個(gè)樣品測定值統(tǒng)計(jì)分析后，實(shí)測值與理論值 的線性相關(guān)系數(shù)r大于0.98,如圖4。
[0087] 準(zhǔn)確度：檢測企業(yè)參考品，L1?L5共5個(gè)樣品的實(shí)測值與理論值相對(duì)偏倚均在 ±20. 0% 內(nèi)；
[0088] 穩(wěn)定性：試劑盒自成品生產(chǎn)之日起于37°C放置6天（有效期為12個(gè)月）；成品剩 余效期內(nèi)，則按37°C放置6天有效期為12個(gè)月推算37°C放置的時(shí)間進(jìn)行檢測，結(jié)果符合各 項(xiàng)目規(guī)定的要求。
[0089] 本發(fā)明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的干擾試驗(yàn)評(píng)價(jià)：
[0090] 本發(fā)明實(shí)施例1制備的HEV IgG抗體和IgM抗體雙標(biāo)記測定試劑盒（時(shí)間分辨熒 光免疫法）的分析特異性評(píng)價(jià)如下：
[0091] 血樣本中膽紅素818 μ mol/L、血紅蛋白180g/L、甘油三酯21. 54mmol/L對(duì)本試 劑盒的檢測結(jié)果無干擾作用。不受血樣本中檸檬酸鈉（l.〇88mol/L)、乙二胺四乙酸二鉀 (0. 2744mol/L)、草酸鉀（0. 5428mol/L)、氟化鈉（0. 4878mol/L)、肝素鈉（150U/L)等抗凝劑 的干擾。檢測甲型肝炎病毒抗體（8U/mL)、乙型肝炎病毒表面抗體（640mIU/mL)、乙型肝炎 病毒e抗體（16NCU/mL)、乙型肝炎病毒核心抗體（8NCU/mL)、丙型肝炎病毒抗體（4NCU/mL)、 梅毒抗體（160mIU/mL)均無交叉反應(yīng)。
[0092] 本發(fā)明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒與參比試劑盒的等效性評(píng)價(jià)：
[0093] 本發(fā)明實(shí)施例1制備的HEV IgG抗體和IgM抗體雙標(biāo)記測定試劑盒（時(shí)間分辨熒 光免疫法）的等效性評(píng)價(jià)結(jié)果如表1、表2、表3 :
[0094] 表1 1020例正常人血清樣本的臨床比對(duì)
[0095]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：包被有HEV抗 原的固相載體，與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體，校準(zhǔn)品，樣本稀釋液，實(shí)驗(yàn)緩 沖液，濃縮洗液以及增強(qiáng)液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述包被有 抗原的固相載體中抗原為含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV重組抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述包被有 HEV抗原的載體是采用以下步驟制備而得的： 將HEV抗原用包被緩沖液稀釋，在固相載體上進(jìn)行包被，將固相載體洗滌1次，然后再 用封閉液進(jìn)行封閉，將固相載體甩干，晾干，真空包裝，2?8°C保存?zhèn)溆谩?br> 4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述與HEV抗 體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體為Eu3+標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體和Sm 3+標(biāo)記的鼠抗人μ 鏈抗體的組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述Eu3+標(biāo) 記的鼠抗人IgG抗體是參照Eu 3+標(biāo)記試劑盒說明書操作而制備的，所述Sm3+標(biāo)記的鼠抗人 μ鏈抗體是參照Sm3+標(biāo)記試劑盒說明書操作而制備的。
6. -種采用如權(quán)利要求1所述試劑盒檢測戊型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 用實(shí)驗(yàn)緩沖液配制與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體； (2) 用純化水將濃縮洗液稀釋成工作洗滌液； (3) 將待檢樣本用樣本稀釋液稀釋，將校準(zhǔn)品或已稀釋待檢樣本加入到包被有HEV抗 原的固相載體中； (4) 固相載體在室溫下孵育； (5) 用步驟（2)中工作洗滌液洗滌抗原固相載體； (6) 加入步驟（1)中配制的與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體，在室溫下孵 育； (7) 用步驟（2)中工作洗滌液洗滌抗原固相載體； (8) 加入增強(qiáng)液，繼續(xù)孵育； (9) 孵育結(jié)束后，采用對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記窗口檢測程序進(jìn)行檢測并分析。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述步驟（1) 中與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體為Eu 3+標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體和Sm3+標(biāo)記的 鼠抗人μ鏈抗體的組合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述步驟（3) 中包被有抗原的固相載體中抗原為含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV重組抗原。
9. 一種如權(quán)利要求1所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的制備方法，其特征在于， 所述方法包括以下步驟： (1) 制備包被有HEV抗原的固相載體； (2) 制備校準(zhǔn)品； (3) 制備與HEV抗體結(jié)合的鑭系元素標(biāo)記的檢測抗體； (4) 制備樣本稀釋液、實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液以及增強(qiáng)液； (5) 貼標(biāo)簽； (6) 組裝為試劑盒。
【文檔編號(hào)】G01N33/576GK104090105SQ201410327852
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】譚玉華, 盧德祥, 李奕輝, 范主橋 申請(qǐng)人:廣州市豐華生物工程有限公司