一種用于提高maldi靶板上蛋白酶解的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于提高M(jìn)ALDI靶板上蛋白酶解的方法。一種用于提高M(jìn)ALDI靶板上蛋白酶解的方法，包括下列步驟：按照介孔材料、樣品蛋白、胰蛋白酶、CHCA基質(zhì)的順序，依次取0.5-1μL的溶液點(diǎn)在MALDI靶板上，后一種溶液點(diǎn)在前一種溶液溶劑揮發(fā)后的靶點(diǎn)上；其中介孔材料、樣品蛋白、胰蛋白酶間質(zhì)量比為35ng～350ng∶5ng～10ng∶2ng～16ng。本發(fā)明所建立的靶上蛋白酶解方法可以直接進(jìn)行蛋白分離后的靶上快速酶解及質(zhì)譜鑒定，能夠提高酶解效率，簡(jiǎn)化操作，節(jié)約時(shí)間，顯示出有序介孔材料在高通量蛋白靶上酶解、鑒定中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種用于提高M(jìn)ALDI靶板上蛋白酶解的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于提高M(jìn)ALDI靶板上蛋白酶解的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)組研究以大規(guī)模分析生物體內(nèi)蛋白質(zhì)為主要內(nèi)容，其目的是實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)基 因組全部編碼蛋白質(zhì)及其相互作用的研究。由于研究對(duì)象復(fù)雜，尤其是對(duì)低豐度蛋白質(zhì)檢 測(cè)所面臨的難度，蛋白質(zhì)組學(xué)所必需的高靈敏度、高鑒定速度使得傳統(tǒng)方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足 要求。如何對(duì)生物體內(nèi)成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)進(jìn)行快速鑒定，是蛋白質(zhì)組研究需要解決的重要 問(wèn)題。
[0003] 蛋白質(zhì)的分析鑒定主要有兩種路線(xiàn)：一種是傳統(tǒng)的二維凝膠電泳蛋白質(zhì)分離、膠 上酶解與質(zhì)譜（MS)鑒定相結(jié)合的方法；另一種則先將混合蛋白質(zhì)酶解，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)纳V 分離之后，對(duì)肽段進(jìn)行MALDI-T0F-MS(基質(zhì)輔助激光解解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，英文名 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 分析并據(jù)此實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定。其中蛋白質(zhì)的酶解效率成為了蛋白質(zhì)高通量分析、鑒定的 一個(gè)關(guān)鍵因素。發(fā)展快速酶解新技術(shù)有重要的價(jià)值和意義。
[0004] 蛋白酶解是實(shí)施肽質(zhì)量指紋譜技術(shù)的關(guān)鍵步驟，胰蛋白酶是該過(guò)程中的常用酶， 能夠選擇性地在精氨酸和賴(lài)氨酸殘基處進(jìn)行酶切形成特異性肽段。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中 最普遍的蛋白質(zhì)酶解手段主要有兩種，即膠上酶解和溶液酶解。膠上酶解是第一個(gè)蛋白質(zhì) 組學(xué)分析技術(shù)平臺(tái)中聯(lián)系雙向電泳和質(zhì)譜鑒定的橋梁，而溶液酶解過(guò)程一般為先使用一定 的變性劑或通過(guò)加熱使蛋白質(zhì)變性，然后以一定的酶/底物比例加入胰蛋白酶，PH7-8條件 下37°C酶解過(guò)夜。由于酶/底物比必須保持很低來(lái)避免多余酶的自降解所產(chǎn)生的肽段碎片 的生成，因此一般溶液酶解的反應(yīng)時(shí)間都要多于5小時(shí)，不利于蛋白質(zhì)組學(xué)中高通量的蛋 白鑒定、分析。
[0005] 固定化酶技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白酶解帶來(lái)了新的思路，已有多種不同的胰蛋白酶的固 化材料應(yīng)用于蛋白酶解，包括多孔硅、玻璃、薄膜、硅膠、多聚體、多孔整體柱，取得了良好的 效果，但是這些材料存在一定的缺陷：1)在制備固定載體過(guò)程中酶的固定，因制備條件和 部分有機(jī)試劑造成酶變形失活；2)多孔載體易被蛋白阻塞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于解決蛋白MALDI-T0F-MS分析中蛋白酶解難題，以實(shí)現(xiàn)提高酶 解效率，簡(jiǎn)化操作，節(jié)約時(shí)間。
[0007] 為此，本發(fā)明公開(kāi)了一種用于提高M(jìn)ALDI靶板上蛋白酶解的方法，包括下列步驟：
[0008] 按照介孔材料、樣品蛋白、胰蛋白酶、CHCA基質(zhì)的順序，依次取0. 5-1 μ L的溶液點(diǎn) 在MALDI靶板上，后一種溶液點(diǎn)在前一種溶液溶劑揮發(fā)后的靶點(diǎn)上；
[0009] 其中介孔材料、樣品蛋白、胰蛋白酶間質(zhì)量比為35?350 : 5?10 : 2?16。
[0010] 在一些實(shí)施例中，所述介孔材料為有序硅基介孔材料。所述介孔材料的上樣濃度 優(yōu)選為35ng/ μ L。
[0011] 在一些實(shí)施例中，所述酶為胰蛋白酶。
[0012] 在一些實(shí)施例中，所述酶與樣品蛋白質(zhì)量比為0.8 : 1
[0013] 另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)一種有序硅基介孔材料，其電鏡下呈現(xiàn)面心立方的籠狀 介孔結(jié)構(gòu)，介孔籠孔徑尺寸為25nm，孔穴之間的窗口大小為15nm。
[0014] 本發(fā)明所述的有序娃基介孔材料，合成步驟為：Pluronic F127(E0106P070E0106)、2M HC1、TMB 和 KC1 按照質(zhì)量比 1 :60 :1. 2 :4 于 40°C混勻，再加入 1 :4倍硅源TE0S攪拌24小時(shí)后，550°C焙燒6小時(shí)形成。
[0015] 本發(fā)明以一種新合成的有序硅基介孔材料作為催化劑，能有效提高M(jìn)ALDI-T0F-MS 蛋白靶上酶解效率。利用優(yōu)化的上樣介孔材料量、胰蛋白酶量等反應(yīng)條件，所建立的靶上蛋 白酶解方法可以直接進(jìn)行蛋白分離后的靶上快速酶解及質(zhì)譜鑒定，能夠提高酶解效率，簡(jiǎn) 化操作，節(jié)約時(shí)間，顯示出有序介孔材料在高通量蛋白靶上酶解、鑒定中具有一定的應(yīng)用價(jià) 值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1介孔材料的透射電鏡照片。
[0017] 圖2未加入介孔材料的牛血清白蛋白（30ng/μ L)靶上酶解質(zhì)譜圖。
[0018] 圖3加入介孔材料的牛血清白蛋白（30ng/μ L)靶上酶解質(zhì)譜圖。
[0019] 圖4靶上酶解中加入介孔材料的濃度是3. 5 μ g/ μ L時(shí)的肌紅蛋白酶解質(zhì)譜圖。
[0020] 圖5靶上酶解中加入介孔材料的濃度是0 μ g/ μ L時(shí)的肌紅蛋白酶解質(zhì)譜圖。
[0021] 圖6靶上酶解中加入介孔材料的濃度是35ng/ μ L時(shí)的肌紅蛋白酶解質(zhì)譜圖。
[0022] 圖7胰蛋白酶上樣量與樣品蛋白比例為8ng :10ng，介孔材料為35ng時(shí)的肌紅蛋 白酶解質(zhì)譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0024] 實(shí)施例1硅基大孔徑介孔材料的合成及電鏡下形態(tài)
[0025] Pluronic F127(E0106P070E0106)、2M HC1、TMB 和 KC1 按照質(zhì)量比 1 :60 :1· 2 :4 于 40°C混勻，再加入4倍硅源TE0S攪拌24小時(shí)后，550°C焙燒6小時(shí)形成有序硅基介孔材料。 JE0L-2011型高分辨透射電子顯微鏡下，該介孔材料具有整齊劃一的面心立方的籠狀介孔 結(jié)構(gòu)，介孔籠孔徑尺寸為25nm，而連接孔穴之間的窗口為15nm，開(kāi)放的大孔窗口有利于蛋 白分子的出入。
[0026] 實(shí)施例2介孔材料用于靶上酶解蛋白
[0027] 將一定量的介孔材料加入水溶液中，超聲5分鐘形成懸浮液；將樣品蛋白溶于水 中配成蛋白水溶液；胰蛋白酶溶于0. 1%的三氟乙酸溶液中，然后用NH4HC03溶液稀釋至所 需濃度。按照介孔材料、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、胰蛋白酶、CHCA基質(zhì)（10mg/mL)的順序，依次取0. 5yL 的溶液點(diǎn)在MALDI靶板上，后一種溶液點(diǎn)在前一種溶液溶劑揮發(fā)后的靶點(diǎn)上。待點(diǎn)樣液 干燥、結(jié)晶后，將靶板放進(jìn)質(zhì)譜儀，進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜測(cè)定：質(zhì)譜操作在4700Pr 〇te〇miCS Analyzer (Applied Biosystems)上完成；激光器為Nd-YAG激光，波長(zhǎng)355nm，激光脈沖頻率 200Hz ;加速電壓20kV，正離子模式，反射式T0F條件下檢測(cè)。胰蛋白酶濃度為4ng/l·! L
[0028] 以大分子量的牛血清白蛋白為樣品，對(duì)未加介孔材料和加入介孔材料的靶上酶解 效率進(jìn)行考察，結(jié)果如圖2所示。圖a、b中，肽段的氨基酸覆蓋率分別為12%、34%，b圖的 譜圖質(zhì)量明顯要高于a圖，說(shuō)明介孔材料可以有效地提高靶上酶解的效率。原因在于加入 介孔材料后，蛋白分子被快速吸附到介孔材料富含硅羥基孔道表面，使樣品蛋白分子變性， 從而催化了酶解反應(yīng)。
[0029] 實(shí)施例3介孔材料、樣品蛋白和酶上樣量的考察
[0030] 以5ng標(biāo)準(zhǔn)肌紅蛋白為上樣品，酶上樣量2ng，靶上酶解中加入介孔材料的濃度分 別為〇 μ g/ μ L、35ng/ μ L和3. 5 μ g/ μ L時(shí)，考察肌紅蛋白酶解質(zhì)譜圖。如圖3所示，當(dāng)介 孔材料的上樣量為3. 5 μ g/μ L時(shí)，靶上酶解反應(yīng)后所測(cè)到的氨基酸覆蓋率（13% )比未加 介孔材料時(shí)的低（21 % )，而當(dāng)?shù)纳蠘恿拷禐?5ng/μ L時(shí)，靶上酶解譜圖的信噪比提高，氨 基酸覆蓋率增加到61%。較多的介孔材料上樣量形成的信號(hào)峰較低，原因是較多的使得上 樣品分子分布過(guò)于分散，不利于基質(zhì)的解吸離子化。
[0031] 酶用量在一定范圍內(nèi)的變化，影響酶解產(chǎn)量。本發(fā)明考察了酶與樣品蛋白質(zhì)量比 分別為1. 6 :1，0. 8 :1，0. 4 :1，0. 2 :1的條件下的酶解效率。當(dāng)酶與底物比為0. 8 :1時(shí)，所得 肽產(chǎn)物信號(hào)強(qiáng)度最高，酶自降解弱。酶自降解峰強(qiáng)度低源于酶解肽產(chǎn)量多，較強(qiáng)的信號(hào)峰抑 制了酶降解峰。
[0032] 本發(fā)明所涉及的多個(gè)方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神 之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對(duì)其進(jìn)行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請(qǐng) 所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于提高M(jìn)ALDI靶板上蛋白酶解的方法，包括下列步驟： 按照介孔材料、樣品蛋白、酶、CHCA基質(zhì)的順序，依次取0. 5-1 μ L的溶液點(diǎn)MALDI靶板 上，后一種溶液點(diǎn)在如一種溶液溶劑?車(chē)發(fā)后的祀點(diǎn)上； 其中介孔材料、樣品蛋白、酶間質(zhì)量比為35?350 : 5?10 : 2?16。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述介孔材料為有序硅基介孔材料。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述介孔材料的上樣濃度為35ng/μ L。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酶為胰蛋白酶。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酶與樣品蛋白質(zhì)量比為0.8 : 1。
6. -種有序硅基介孔材料，其特征在于其電鏡下呈現(xiàn)面心立方的籠狀介孔結(jié)構(gòu)，介孔 籠孔徑尺寸為25nm，孔穴之間的窗口大小為15nm。
7. 如權(quán)利要求6所述的有序娃基介孔材料，其特征在于其由下列步驟制備：Pluronic F127、2M HC1、TMB和KC1按照質(zhì)量比1 :60 :1. 2 :4于40°C混勻，再加入1 :4倍硅源TE0S攪 拌24小時(shí)后，550°C焙燒6小時(shí)形成。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104090114SQ201410284137
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】武文斌, 巴劍波, 郝蕙玲, 陳雙紅, 徐雄利, 孫錦程, 呂鴻雁 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所