一種測(cè)定天然水體中胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法
【專(zhuān)利摘要】一種測(cè)定天然水體中胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法，其步驟為：1）過(guò)濾水樣前鏡檢，根據(jù)水樣的渾濁程度和微囊藻的檢出效果確定需要的水量；2）過(guò)濾水樣，將濾膜剪碎渦旋混勻后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并離心分離出上清液；3）在固相萃取柱中富集含有微囊藻毒素的上清液；4）洗脫富集在固相萃取柱中的微囊藻毒素，氮吹至干后定容待測(cè)。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單、靈活性高，可操作強(qiáng)，適用于長(zhǎng)期測(cè)定不同季節(jié)不同區(qū)域天然水體中胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種測(cè)定天然水體中胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)?！炯夹g(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種長(zhǎng)期測(cè)定不同季節(jié)、不同天然水體中常見(jiàn)胞內(nèi)微囊藻毒素的水樣預(yù)處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，水體的富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，從而導(dǎo)致藍(lán)藻水華頻繁發(fā)生。淡水藍(lán)藻中能產(chǎn)生毒素的有四十余種，其中微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是出現(xiàn)頻率最高和造成危害最嚴(yán)重的藍(lán)藻毒素，嚴(yán)重危害水體的生態(tài)系統(tǒng)健康?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了 80多種微囊藻毒素的同分異構(gòu)體，最常見(jiàn)的是MC-LR、MC-RR和MC-YR，其中以MC-LR的毒性最大。
[0003]藻毒素分為胞內(nèi)藻毒素和胞外藻毒素兩種，通常情況下，藻毒素都存在于藻細(xì)胞內(nèi)，但在藍(lán)藻大量繁殖的情況下，藻類(lèi)代謝、衰老或者死亡會(huì)釋放出藻毒素，因此，胞內(nèi)藻毒素會(huì)成為嚴(yán)重的安全隱患。目前胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理可以利用干藻粉或者直接利用水體中的微囊藻，但天然水體中的微囊藻少，而且長(zhǎng)期測(cè)定不同季節(jié)、不同區(qū)域天然水中的微囊藻毒素需要制備干藻粉，一方面需要很大的工作量，另一方面降低了其精準(zhǔn)性。而現(xiàn)有的直接利用天然水中微囊藻的預(yù)處理需要IOL或者2L水樣，一方面會(huì)導(dǎo)致需要水量過(guò)多而加大采樣負(fù)荷、延長(zhǎng)過(guò)濾時(shí)間，另一方面可能會(huì)導(dǎo)致微囊藻過(guò)少所取水量過(guò)小檢不出微囊藻毒素。傳統(tǒng)方法采用的細(xì)胞破碎時(shí)間以及離心次數(shù)一致，不適用于不同季節(jié)微囊藻含量變化幅度大的情況，精準(zhǔn)性不高?？傊F(xiàn)有的測(cè)定胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法不適用于不同區(qū)域的天然水體，沒(méi)有形成一個(gè)系統(tǒng)的可執(zhí)行的預(yù)處理方法。
[0004]因此為了高效的測(cè)定不同天然水體中胞內(nèi)微囊藻毒素的含量，其預(yù)處理方法的確定和改進(jìn)是一項(xiàng)亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定天然水中胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法，以解決【背景技術(shù)】中存在的工作量大、精準(zhǔn)性不高、適應(yīng)性不強(qiáng)等問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的測(cè)定胞內(nèi)微囊藻毒素的水樣預(yù)處理方法，其步驟為:
[0006]I)過(guò)濾水樣前鏡檢，根據(jù)水樣的渾濁程度和微囊藻的檢出效果確定需要的水量；
[0007]2)過(guò)濾水樣，將濾膜剪碎渦旋混勻后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并離心分離出上清液；
[0008]3)在活化過(guò)的固相萃取柱中富集含有微囊藻毒素的上清液，并除雜；
[0009]4)洗脫富集在固相萃取萃取柱中的微囊藻毒素，氮吹至干后定容待測(cè)。
[0010]所述的水樣預(yù)處理方法中，步驟I)的水樣是用電子顯微鏡鏡檢兼目測(cè)。
[0011]所述的水樣預(yù)處理方法中，步驟2)是加入5%的乙酸渦旋混勻，通過(guò)超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行間歇破碎10-15min至無(wú)塊狀濾膜。
[0012]所述的水樣預(yù)處理方法中，步驟2)的離心重復(fù)2-4次至離心管中顏色接近原濾膜色，每次離心前先進(jìn)行渦旋混勻。
[0013]所述的預(yù)處理方法中，步驟3)的富集是用Waters HLB固相萃取小柱，流速為3mL/min ;而活化和除雜時(shí)流速為5mL/min，在除雜之前固相萃取柱中的液體不能低于上層篩片。
[0014]所述的水樣預(yù)處理方法中，步驟4)是用含有0.1%三氟乙酸(TFA)的90%的甲醇溶液洗脫。
[0015]本發(fā)明的技術(shù)效果是:
[0016]本發(fā)明在過(guò)濾水樣前鏡檢，根據(jù)水樣的渾濁程度和微囊藻的檢出效果確定需要的水量，節(jié)省時(shí)間，避免藻殘留，提高了過(guò)濾水樣的利用率，適用于測(cè)定不同季節(jié)不同區(qū)域的大批量水樣；將濾膜剪碎渦旋混勻后進(jìn)行細(xì)胞破碎，而且破碎時(shí)間由濾膜的破碎程度決定有助于藻細(xì)胞的徹底破碎，提高效率；進(jìn)行細(xì)胞破碎及離心之前渦旋混勻，有利于微囊藻毒素的釋放；離心的次數(shù)由離心管中濾膜的顏色決定，可以在最短的時(shí)間最有效地將沉淀與上清液分離，并將釋放出的微囊藻毒素收集起來(lái)，減少預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的誤差固相萃取小柱中進(jìn)行活化、萃取時(shí)液體不能低于上層篩片，都有助于增加小柱的活性；富集過(guò)程的流速比活化和除雜過(guò)程的流速低，使得釋放的胞內(nèi)微囊藻毒素更好更徹底的富集在小柱內(nèi)。用含有0.1%TFA的90%甲醇溶液洗脫，能更有效地將富集在HLB小柱中的微囊藻毒素洗脫下來(lái)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明的水樣預(yù)處理方法，包括如下步驟:
[0018]I)混勻水樣后利用顯微鏡鏡檢，可明顯檢測(cè)出微囊藻存在，水樣渾濁取0.5L，不渾濁取IL ;可檢出微囊藻存在，水樣渾濁取1L，不渾濁取1.5L ;不可檢出微囊藻存在，水樣渾濁取2L，不渾濁取3L，通過(guò)0.45um的GF/C濾膜過(guò)濾。
[0019]2)濾膜在_20°C下冷凍24小時(shí)解凍后剪碎至IOmL離心管中，加5%的乙酸渦旋混勻Imin后在冰浴條件下間歇破碎10-15min至離心管中無(wú)塊狀濾膜，每隔5min潤(rùn)旋混勻
0.5min,功率為50%。在4°C, 8000r/min的條件下離心12min,收集上清液。再重復(fù)離心2_4次至離心管中顏色接近原濾膜色，每次離心前加入5%的乙酸后渦旋混勻0.5min，合并上清液。
[0020]3)用15mL的甲醇活化HLB固相萃取小柱，待甲醇接近上層篩片時(shí)再用15mL的純凈水進(jìn)行活化，流速為5mL/min。然后將收集的上清液以3mL/min的流速通過(guò)萃取柱，富集結(jié)束后分別以20mL10%的甲醇和10mL20%的甲醇除雜，流速為5mL/min，在除雜之前固相萃取柱中的液體不能低于上層篩片。
[0021]4)用IOmL含有0.1%TFA的90%甲醇溶液洗脫富集在HLB萃取小柱中的微囊藻毒素，流速為3mL/min ;將收集的洗脫液在40°C的條件下氮吹至干，用50%的甲醇溶液分兩次溶洗至lmL，于_20°C的條件下保存待測(cè)。
[0022]本發(fā)明采用0.1%TFA的90%甲醇溶液比0.1%的純甲醇和90%的甲醇溶液的洗脫效果好，回收率高，重現(xiàn)性好，具體回收率如表I所示。
[0023]以下列舉3個(gè)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0024]實(shí)施例1
[0025]7月陽(yáng)澄湖水體中三種胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理包括如下步驟:
[0026]I)水樣混勻后不渾濁，鏡檢過(guò)程中未看到微囊藻的存在，取3L水樣過(guò)濾。[0027]2)濾膜在_20°C下冷凍24小時(shí)解凍后剪碎至IOmL離心管中，加5%的乙酸渦旋混勻Imin后通過(guò)超聲細(xì)胞破碎儀在冰浴條件下間歇破碎IOmin,每隔5min潤(rùn)旋混勻0.5min,功率為50%。在4°C，8000r/min的條件下離心12min，收集上清液。再重復(fù)離心2次，每次離心前加入5%的乙酸后渦旋混勻0.5min,合并上清液。
[0028]3)用15mL的甲醇活化HLB固相萃取小柱，待甲醇接近上層篩片時(shí)再用15mL的純凈水進(jìn)行活化，流速為5mL/min。然后將收集的上清液以3mL/min的流速通過(guò)萃取柱，富集結(jié)束后分別以20mL10%的甲醇和10mL20%的甲醇除雜，流速為5mL/min，在除雜之前固相萃取柱中的液體不能低于上層篩片。
[0029]4)用IOmL0.1%TFA的90%甲醇溶液來(lái)洗脫富集在HLB萃取小柱中的微囊藻毒素，流速為3mL/min，將收集的洗脫液在40°C的條件下氮吹至干，用50%的甲醇溶液分兩次溶洗至lmL，于-20°C條件下保存待測(cè)。
[0030]實(shí)施例2
[0031]7月太湖水體中三種胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法
[0032]I)水樣混勻后渾濁，鏡檢過(guò)程中可明顯看到微囊藻的存在，取0.5L水樣過(guò)濾。
[0033]2)濾膜在_20°C下冷凍24小時(shí)解凍后剪碎至IOmL離心管中，加5%的乙酸渦旋混勻Imin后通過(guò)超聲細(xì)胞破碎儀在冰浴條件下間歇破碎15min,每隔5min潤(rùn)旋混勻0.5min,功率為50%。在4°C，8000r/min的條件下離心12min，收集上清液。再重復(fù)離心4次，每次離心前加入5%的乙酸后渦旋混勻0.5min,合并上清液。
[0034]3)用15mL的甲醇活化HLB固相萃取小柱，待甲醇接近上層篩片時(shí)再用15mL的純凈水進(jìn)行活化，流速為5mL/min。然后將收集的上清液以3mL/min的流速通過(guò)萃取柱，富集結(jié)束后分別以20mL10%的甲醇和10mL20%的甲醇除雜，流速為5mL/min，在除雜之前固相萃取柱中的液體不能低于上層篩片。
[0035]4)用IOmL0.1%TFA的90%甲醇溶液來(lái)洗脫富集在HLB萃取小柱中的微囊藻毒素，流速為3mL/min，將收集的洗脫液在40°C的條件下氮吹至干，用50%的甲醇溶液分兩次溶洗至lmL，于-20°C條件下保存待測(cè)。
[0036]實(shí)施例3
[0037]4月太湖水體中三種胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法
[0038]I)水樣混勻后渾濁，鏡檢過(guò)程中可看到微囊藻的存在，取IL水樣過(guò)濾。
[0039]2)濾膜在_20°C下冷凍24小時(shí)解凍后剪碎至IOmL離心管中，加5%的乙酸渦旋混勻Imin后通過(guò)超聲細(xì)胞破碎儀在冰浴條件下間歇破碎15min,每隔5min潤(rùn)旋混勻0.5min,功率為50%。在4°C，8000r/min的條件下離心12min，收集上清液。再重復(fù)離心3次，每次離心前加入5%的乙酸后渦旋混勻0.5min,合并上清液。
[0040]3)用15mL的甲醇活化HLB固相萃取小柱，待甲醇接近上層篩片時(shí)再用15mL的純凈水進(jìn)行活化，流速為5mL/min。然后將收集的上清液以3mL/min的流速通過(guò)萃取柱，富集結(jié)束后分別以20mL10%的甲醇和10mL20%的甲醇除雜，流速為5mL/min，在除雜之前固相萃取柱中的液體不能低于上層篩片。
[0041]4)用IOmL0.1%TFA的90%甲醇溶液來(lái)洗脫富集在HLB萃取小柱中的微囊藻毒素，流速為3mL/min，將收集的洗脫液在40°C的條件下氮吹至干，用50%的甲醇溶液分兩次溶洗至lmL，于-20°C條件下保存待測(cè)。[0042]表1:不同洗脫液MC-LR、MC-RR和MC-YR回收率比較
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種適用于測(cè)定天然水體中胞內(nèi)微囊藻毒素的預(yù)處理方法，其步驟為: 1)過(guò)濾水樣前鏡檢，根據(jù)水樣的渾濁程度和微囊藻的檢出效果確定需要的水量； 2)過(guò)濾水樣，將濾膜剪碎渦旋混勻后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并離心分離出上清液； 3)在活化過(guò)的固相萃取柱中富集含有微囊藻毒素的上清液，并除雜； 4)洗脫富集在固相萃取柱中的微囊藻毒素，氮吹至干后定容待測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水樣預(yù)處理方法，其中，步驟I)的水樣是用電子顯微鏡鏡檢兼目測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水樣預(yù)處理方法，其中，步驟2)是加入5%的乙酸渦旋混勻，通過(guò)超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行間歇破碎10-15min至無(wú)塊狀濾膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水樣預(yù)處理方法，其中，步驟2)的離心重復(fù)2-4次至離心管中顏色接近原濾膜色，每次離心前先進(jìn)行渦旋混勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其中，步驟3)的富集是用WatersHLB固相萃取小柱，流速為3mL/min ;而活化和除雜時(shí)流速為5mL/min，在除雜之前固相萃取柱中的液體不能低于上層篩片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水樣預(yù)處理方法，其中，步驟4)是用含有0.1%三氟乙酸的90%甲醇溶液洗脫。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK103940651SQ201410155218
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】蘇婧, 席北斗, 魏代春, 霍守亮, 紀(jì)丹鳳, 王驥 申請(qǐng)人:中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院