基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，屬于免疫檢測方法【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法利用核殼量子點具有激發(fā)譜線寬、發(fā)射譜線窄、量子尺寸效應、熒光量子效率高、光化學穩(wěn)定性強的特性的基礎(chǔ)上，采用EDC縮合的方式將量子點與蛋白G或蛋白A分子進行共價連接，利用蛋白G或蛋白A分子做橋，依靠其與抗體Fc端的特異性，實現(xiàn)量子點與抗體分子的柔性偶聯(lián)，不占據(jù)抗體的抗原決定簇部位，大大提高抗體的抗原免疫活性，利用該標記產(chǎn)物進行免疫檢測的靈敏度和特異性都得到極大的提高。
【專利說明】基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前利用納米金顯色的檢測試紙條已被大量應用，其基本原理是以微孔膜為固相載體，包被檢測物的抗原或抗體，加入待測樣本后，經(jīng)微孔膜的毛細管虹吸作用使樣本中檢測物與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，通過納米金標記物自身的顏色判定檢測結(jié)果。但是對于某些含量較低的樣本，納米金的顏色很淺，難于用肉眼來判斷結(jié)果，靈敏度低，只能定性檢測，不能定量分析。由于量子點具有激發(fā)譜線寬、發(fā)射譜線窄、量子尺寸效應、高熒光效率、強光化學穩(wěn)定性等特性，可以替代膠體納米金進行生物標記，用高靈敏的熒光信號代替吸收顯色進行檢測。量子點試紙條既可以進行定性分析，又可以進行定量檢測。
[0003]經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的專利檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利申請?zhí)?00610024086.7的專利，利用量子點的特性，發(fā)明了一種量子點標記快速免疫層析試紙條的檢測方法，對待檢測物進行定性或半定量檢測，該發(fā)明通過改變量子點的粒徑或種類，得到不同波長的熒光，用不同類型的量子點標記不同的抗體，通過多色熒光信號進行多組分的檢測，方法簡單快速，成本低。然而量子點是一種納米材料，具有極大的表面效應，現(xiàn)有的利用量子點檢測的試紙條都是將量子點與抗體分子通過靜電吸附作用、直接共價連接等方式進行生物標記，在標記抗體的過程中，很容易標記到抗體的具有抗原決定簇部位的Fab端，標記后的抗體不能與抗原分子進行免疫反應，因而是一種無效的標記，這種直接連接技術(shù)對于最終的免疫檢測的靈敏度，尤其是特異性會有很大程度的影響，降低檢測效果，定量檢測靈敏度和特異性都無法達到滿意結(jié)果。而且現(xiàn)有的量子點試紙條專利都是利用裸核量子點進行免疫檢測，由于裸核量子點較核殼量子點的熒光特性會有很大的減弱，因而將其應用到試紙條免疫檢測，效果一定弱于用核殼量子點進行免疫檢測的結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了提供一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，該檢測方法具有較高的靈敏度和特異性。
[0005]本發(fā)明提供一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，包括如下:
[0006]步驟一:制備核殼量子點；
[0007]步驟二:將步驟一得到的核殼量子點與蛋白G或蛋白A通過EDC縮合的方式進行共價連接，得到共價連接產(chǎn)物；
[0008]步驟三:將步驟二得到的共價連接產(chǎn)物與待檢測抗原分子的一個抗體分子混合，得到量子點抗體柔性偶聯(lián)的標記產(chǎn)物；[0009]步驟四:將步驟三得到的量子點抗體柔性偶聯(lián)的標記產(chǎn)物涂在玻璃纖維素膜上，得到涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜，將待檢測抗原分子的另一個抗體和二抗分別噴涂在硝酸纖維素膜上形成測試帶和控制帶，得到已平行包被抗體的硝酸纖維素膜；
[0010]步驟五:在單面聚酯或塑料板上，依次粘貼上玻璃纖維素濾膜、涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜、吸水纖維素膜、已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，將粘貼后的聚酯或塑料板制作得到免疫層析試紙條；
[0011]步驟六:將步驟五得到的免疫層析試紙條的墊端插入待測樣品溶液中，免疫層析后取出試紙條，確定檢測結(jié)果。
[0012]優(yōu)選的是，所述的核殼量子點為CdTe/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe或CdSe/ZnS核殼量子點。
[0013]優(yōu)選的是，所述的共價連接產(chǎn)物與待檢測抗原分子的一個抗體分子的摩爾比為1:1o
[0014]優(yōu)選的是，所述的步驟四中，測試帶和控制帶平行設(shè)置，測試帶和控制帶的間隔為8-12mm。
[0015]優(yōu)選的是，所述的將待檢測抗原分子的另一個抗體和二抗分別噴涂在硝酸纖維素膜上形成測試帶和控制帶后，室溫晾干20-30分鐘后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉60-120分鐘，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0016]優(yōu)選的是，所述的待測樣品溶液為血液、尿液或唾液。
[0017]優(yōu)選的是，所述的步驟六中，免疫層析后取出試紙條后，具體為:將試紙條在紫外燈下肉眼觀察結(jié)果，或在熒光光譜儀下獲得檢測光譜曲線，通過與標準曲線對比，確定檢測結(jié)果。
[0018]本發(fā)明的有益效果
[0019]1、本發(fā)明提供一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，該方法利用核殼量子點具有激發(fā)譜線寬、發(fā)射譜線窄、量子尺寸效應、熒光量子效率高、光化學穩(wěn)定性強的特性的基礎(chǔ)上，采用EDC縮合的方式將量子點與蛋白G或蛋白A分子進行共價連接，利用蛋白G或蛋白A分子做橋，依靠其與多數(shù)哺乳動物(包括人、羊、兔、鼠、馬、豬、猴等)的抗體Fe端的特異性，實現(xiàn)量子點與抗體分子的柔性偶聯(lián)，不占據(jù)抗體的抗原決定簇部位，大大提高抗體的抗原免疫活性，利用該標記產(chǎn)物進行免疫檢測的靈敏度和特異性都得到極大的提高；
[0020]2、本發(fā)明將得到的量子點抗體柔性偶聯(lián)的標記產(chǎn)物涂在玻璃纖維素膜上，將待檢測抗原分子的另一個抗體和二抗分別噴涂在硝酸纖維素膜上形成測試帶和控制帶，利用雙抗體夾心法原理結(jié)合量子點的柔性標記技術(shù)及其熒光性質(zhì)檢測樣品中是否含有目標抗原分子。通過測試免疫層析試紙條上測試帶與控制帶的熒光光譜，定性或定量判斷檢測結(jié)果;
[0021]3、本發(fā)明通過用不同粒徑大小的量子點標記不同的抗體分子，就可得到不同波長的熒光，用不同尺寸大小的量子點柔性偶聯(lián)不同的抗體分子，可產(chǎn)生多色熒光，實現(xiàn)多組分的檢測，測試帶只需要一條即可，不需要多條測試帶，實驗操作簡單快捷；
[0022]4、本發(fā)明將柔性偶聯(lián)標記技術(shù)的高靈敏高特異性、免疫反應的高特異性與量子點的高效熒光特性三者相結(jié)合，該檢測方法簡便、靈敏，適用于血樣、尿樣、唾液等樣本，可應 用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)療診斷、衛(wèi)生防疫等眾多領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明利用蛋白G實現(xiàn)核殼量子點與抗體分子的柔性偶聯(lián)的示意圖；
[0024]圖2為本發(fā)明量子點試紙條檢測原理示意圖。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明步驟一所述的核殼量子點的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，該方法利用連續(xù)離子層吸附反應技術(shù)(SILAR)實現(xiàn)量子點的核殼包覆。采取一鍋法原理，在同一反應裝置中加入核原料，通過控制核生長的時間獲得不同粒徑大小的裸核量子點，然后再逐滴加入殼原料，利用SILAR技術(shù)進行殼層包覆，最后離心純化處理樣品獲得核殼量子點，具體方法參見文章 J.Phys.Chem.C2008, 112，8587 - 8593。
[0026]本發(fā)明所述的核殼量子點優(yōu)選為CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS等核殼量子點，通過改變量子點的粒子大小，可以實現(xiàn)熒光顏色的調(diào)諧，更優(yōu)選采用裸核尺寸小于3nm的綠光量子點(熒光發(fā)射波段在500-560nm)、3-4nm (熒光發(fā)射波段在560_590nm)的黃光量子點、大于4nm(熒光發(fā)射波段在590-650nm)的紅光量子點進行試紙條的免疫檢測。以CdTe/CdS核殼量子點為例，具體方法為:
[0027]1、在蒸餾水中加入碲粉和硼氫化鈉，得到碲氫化鈉的溶液，所述的蒸餾水為用氮氣充分除氧的蒸餾水，碲粉和硼氫化鈉的摩爾比為1:5 ；
[0028]2、稱取六水合高氯酸鎘，加入到含有無氧水的三頸瓶中，再加入巰基丙酸，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值在10-11之間；所述的六水合高氯酸鎘和巰基丙酸的摩爾比為1:2.4 ;
[0029]3、將I得到的碲氫化鈉的溶液加入步驟二的三頸瓶中，升溫至100°C，合成CdTe裸核量子點，通過改變反應的時間長短獲得裸核尺寸小于3nm的含有綠光量子點綠色溶液、3-4nm的黃光量子點黃色溶液、大于4nm的紅光量子點紅色溶液；
[0030]4、重復步驟2，制備鎘的殼原料；將九水合硫化鈉粉末溶于無氧水中，制備硫的殼原料，根據(jù)文章J.Phys.Chem.C2008, 112，8587 - 8593的實驗步驟利用連續(xù)離子層吸附反應技術(shù)進行殼層包覆，制備CdTe/CdS核殼量子點。
[0031]本發(fā)明步驟二所述的將步驟一得到的核殼量子點與蛋白G或蛋白A通過EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)縮合的方式進行的共價連接，具體為:將核殼量子點與EDC縮合劑混合，活化量子點表面的羧基集團，室溫攪拌20-40分鐘，優(yōu)選30分鐘，然后加入蛋白G或蛋白A，室溫攪拌反應90-150min，優(yōu)選120min，帶有羧基集團的量子點與帶有胺基集團的蛋白G或蛋白A分子在EDC縮合劑的作用下形成酰胺鍵，實現(xiàn)帶有羧基的量子點與帶有胺基的蛋白質(zhì)的共價連接，用NAP-5柱子分離純化，得到共價連接產(chǎn)物；所述的核殼量子點、EDC縮合劑、蛋白G或蛋白A的摩爾比為1:(100-200):1。
[0032]本發(fā)明步驟三所述的將得到的共價連接產(chǎn)物與待檢測抗原分子的一個抗體分子混合，得到量子點抗體柔性偶聯(lián)的標記產(chǎn)物，所述的共價連接產(chǎn)物與待檢測抗原分子的一個抗體分子的摩爾比優(yōu)選為1:1，所述的對待檢測抗原分子的一個抗體分子沒有特殊限制，只要能與蛋白G或蛋白A連接的抗體都可以，優(yōu)選為乙肝表面抗體(HBsAb)，所述的混合溫度優(yōu)選為室溫，混合時間優(yōu)選為30-60min。本發(fā)明利用蛋白G實現(xiàn)核殼量子點與抗體分子的柔性偶聯(lián)的示意圖如圖1所示。
[0033]本發(fā)明步驟四所述的將得到的量子點抗體柔性偶聯(lián)的標記產(chǎn)物涂在玻璃纖維素膜上，如果檢測的是多組分的抗原分子，則將得到的幾種量子點抗體柔性偶聯(lián)的標記產(chǎn)物等比例混合后再涂在玻璃纖維素膜上，得到涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜；將待檢測抗原分子的另一個抗體和二抗分別噴涂在硝酸纖維素膜上形成測試帶和控制帶后，室溫晾干20-30分鐘后，得到已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉60-120分鐘，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆?。所述的測試帶和控制帶平行設(shè)置，測試帶和控制帶的間隔為8-12_，帶寬為2-5_左右，所述的待檢測抗原分子的另一個抗體沒有特殊限制，可以與待檢測抗原分子的一個抗體分子相同，也可以不同，優(yōu)選為乙肝表面抗體(HBsAb);所述的二抗沒有特殊限制，優(yōu)選為羊抗人IgG、兔抗人IgG或鼠抗人IgG。
[0034]本發(fā)明步驟五所述的在單面聚酯或塑料板上，依次粘貼上玻璃纖維素濾膜、涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜、吸水纖維素膜、已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，最后貼上吸水紙，吸收層析后多余的溶液，所述的膜與膜之間都要緊密相連，將粘貼好的聚酯或塑料板切成3-6_寬的試紙條，得到免疫層析試紙條，干燥封裝，4-25°C避光保存。
[0035]本發(fā)明步驟六所述的將免疫層析試紙條樣品的墊端(吸收墊一端)插入待測樣品溶液中，當待測樣品中含有目標抗原分子時，目標抗原分子先與量子點柔性標記的抗體結(jié)合，由于層析作用反應結(jié)合物沿包被硝酸纖維素膜向前移動，當遇到包被抗體時形成抗體-抗原(目標物)-量子點柔性偶聯(lián)標記的抗體復合物而富集在測試帶上，多余的量子點抗體標記產(chǎn)物繼續(xù)移動到控制帶位置，由于二抗與量子點柔性偶聯(lián)的抗體發(fā)生免疫反應，又富集在控制帶上，本發(fā)明量子點試紙條檢測原理示意圖如圖2所示；然后層析作用5-20分鐘后，取出試紙條，將試紙條在紫外燈下肉眼觀察結(jié)果，或在熒光光譜儀下獲得檢測光譜曲線，通過與標準曲線對比，確定檢測結(jié)果。如果測試帶與控制帶處都有熒光，為陽性結(jié)果，說明待測樣品中含有目標抗原分子，與平行樣進行對比分析，測試帶上的熒光越強，表明目標物抗原分子的含量越高；如果只有控制帶有熒光，為陰性結(jié)果，說明待測樣品中沒有目標抗原分子；如果測試帶與控制帶處都沒有熒光，說明檢測無效。所述的紫外燈照射是指波長在300-400nm的普通紫外燈。熒光檢測光譜儀是目前市場上可以輕易獲得的海洋光譜儀即可。所述的待測樣品溶液優(yōu)選的是血清溶液、尿液、唾液等體液。
[0036]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述。
[0037]實施例1
[0038]1、稱取碲粉0.051克(0.4mmol)，硼氫化鈉0.08克(2mmol)，加入含有用氮氣充分除氧的IOml蒸餾水中，得到碲氫化鈉的溶液；
[0039]2、稱取六水合高氯酸鎘0.6714克(1.6mmol)，加入到含有IOOml無氧水的三頸瓶中，再加入巰基丙酸342微升(3.84mmol)，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值在10-11之間；
[0040]3、取I步驟所合成的碲氫化鈉的溶液注入步驟2中的三頸瓶中，升溫至100°C，合成CdTe裸核量子點，通過改變反應的時間在15-30分鐘之內(nèi)獲得裸核尺寸小于3nm的含有綠光量子點綠色溶液；
[0041]4、重復步驟2，制備鎘的殼原料；將九水合硫化鈉粉末溶于無氧水中，制備硫的殼原料，根據(jù)文章J.Phys.Chem.C2008, 112，8587 - 8593的實驗步驟利用連續(xù)離子層吸附反應技術(shù)進行殼層包覆，制備CdTe/CdS核殼量子點；
[0042]5、將I μ molCdTe/CdS核殼量子點與在100 μ molEDC縮合劑混合，活化量子點表面的羧基集團，室溫攪拌30分鐘，然后加入I μ mol蛋白G，室溫攪拌反應2小時，用NAP-5柱子分離純化得到量子點-蛋白G的共價連接產(chǎn)物；
[0043]6、將量子點-蛋白G的共價連接產(chǎn)物與乙肝表面抗體(HBsAb)等比例混合，室溫攪拌I小時，得到量子點-蛋白G-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物；
[0044]7、將量子點-蛋白G-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物均勻地噴涂在玻璃纖維素膜上，得到涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆茫辉谙跛崂w維素膜上用機器劃兩條平行帶，帶寬控制在2mm左右，兩條帶間隔8mm，其中一條帶上噴涂HBsAb形成測試帶；另一條帶上噴涂羊抗人IgG形成控制帶，室溫晾干20分鐘后，得到已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉60分鐘，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0045]8、在單面塑料板上，依次粘貼上玻璃纖維素膜、涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜、吸水玻璃纖維素膜、已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，最后貼上長30厘米，寬2厘米的吸水紙，吸收層析后多余的溶液，膜與膜之間都要緊密相連，制成免疫層析試紙大板用切條機將粘貼好的塑料板縱向切成4_寬的免疫試紙條，干燥下封袋，4-25°C避光保存；
[0046]9、將4mm寬的免疫試紙條樣品墊一端插入待測血清中，層析作用15分鐘后，取出試紙條在紫外燈下觀察結(jié)果，或在熒光光譜儀下測試量子點的熒光光譜，測定HBsAg強陽性標本5分鐘報結(jié)果，測定弱陽和陰性標本20分鐘報結(jié)果。如果膜上的測試帶與控制帶處都有綠色熒光，即兩條熒光，說明待測樣品中含有HBsAg，為陽性結(jié)果，在測試帶的熒光越強，HBsAg的含量越高；如果只有控制帶有綠色熒光，即一條熒光，說明待測樣品中沒有HBsAg;如果測試帶與控制帶都沒有熒光，說明檢測無效。該檢測方法法靈敏度為lng/ml，特異性為90%以上，批內(nèi)與批間重復性小于20%。
[0047]實施例2
[0048]1、稱取硒粉0.051克(0.4mmol)，硼氫化鈉0.08克(2mmol)，加入含有用氮氣充分除氧的IOml蒸餾水中，得到碲氫化鈉的溶液；
[0049]2、稱取六水合高氯酸鎘0.6714克(1.6mmol)，加入到含有IOOml無氧水的三頸瓶中，再加入巰基丙酸342微升(3.84mmol)，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值在10-11之間；
[0050]3、取I步驟所合成的硒氫化鈉的溶液注入步驟2中的三頸瓶中，升溫至100°C，合成CdSe裸核量子點，通過改變反應的時間在15-30分鐘之內(nèi)獲得裸核尺寸小于3nm的含有綠光量子點綠色溶液；
[0051]4、重復步驟2，制備鎘的殼原料；將九水合硫化鈉粉末溶于無氧水中，制備硫的殼原料，根據(jù)文章J.Phys.Chem.C2008, 112，8587 - 8593的實驗步驟利用連續(xù)離子層吸附反應技術(shù)進行殼層包覆，制備CdSe/CdS核殼量子點；
[0052]5、將I μ molCdSe/CdS核殼量子點與在100 μ molEDC縮合劑混合，活化量子點表面的羧基集團，室溫攪拌30分鐘，然后加入I μ mol蛋白G，室溫攪拌反應2小時，用NAP-5柱子分離純化得到量子點-蛋白G的共價連接產(chǎn)物；[0053]6、將量子點-蛋白G的共價連接產(chǎn)物與乙肝表面抗體(HBsAb)等比例混合，室溫攪拌I小時，得到量子點-蛋白G-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物；
[0054]7、將量子點-蛋白G-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物均勻地噴涂在玻璃纖維素膜上，得到涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆?；在硝酸纖維素膜上用機器劃兩條平行帶，帶寬控制在2mm左右，兩條帶間隔8mm，其中一條帶上噴涂HBsAb形成測試帶；另一條帶上噴涂兔抗人IgG形成控制帶，室溫晾干30分鐘后，得到已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉60分鐘，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0055]8、在單面塑料板上，依次粘貼上玻璃纖維素膜、涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜、吸水玻璃纖維素膜、已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，最后貼上長30厘米，寬2厘米的吸水紙，吸收層析后多余的溶液，膜與膜之間都要緊密相連，制成免疫層析試紙大板用切條機將粘貼好的塑料板縱向切成4_寬的免疫試紙條，干燥下封袋，4-25°C避光保存；
[0056]9、將4mm寬的免疫試紙條樣品墊一端插入待測血清中，層析作用10分鐘后，取出試紙條在紫外燈下觀察結(jié)果，或在熒光光譜儀下測試量子點的熒光光譜，測定HBsAg強陽性標本5分鐘報結(jié)果，測定弱陽和陰性標本20分鐘報結(jié)果。如果膜上的測試帶與控制帶處都有綠色熒光，即兩條熒光，說明待測樣品中含有HBsAg，為陽性結(jié)果，在測試帶的熒光越強，HBsAg的含量越高；如果只有控制帶有綠色熒光，即一條熒光，說明待測樣品中沒有HBsAg;如果測試帶與控制帶都沒有熒光，說明檢測無效。該檢測方法法靈敏度為lng/ml，特異性為90%以上，批內(nèi)與批間重復性小于20%。
[0057]實施例3
[0058]1、稱取碲粉0.051克(0.4mmol)，硼氫化鈉0.08克(2mmol)，加入含有用氮氣充分除氧的IOml蒸餾水中，得到碲氫化鈉的溶液；
[0059]2、稱取六水合高氯酸鎘0.6714克(1.6mmol)，加入到含有IOOml無氧水的三頸瓶中，再加入巰基丙酸342微升(3.84mmol)，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值在10-11之間；
[0060]3、取I步驟所合成的碲氫化鈉的溶液注入步驟2中的三頸瓶中，升溫至100°C，合成CdTe裸核量子點，通過改變反應的時間在15-30分鐘之內(nèi)獲得裸核尺寸小于3nm的含有綠光量子點綠色溶液；
[0061]4、重復步驟2，制備鎘的殼原料；將九水合硫化鈉粉末溶于無氧水中，制備硫的殼原料，根據(jù)文章J.Phys.Chem.C2008, 112，8587 - 8593的實驗步驟利用連續(xù)離子層吸附反應技術(shù)進行殼層包覆，制備CdTe/CdS核殼量子點；
[0062]5、將I μ molCdTe/CdS核殼量子點與在100 μ molEDC縮合劑混合活化量子點表面的羧基集團，室溫攪拌30分鐘，然后加入I μ mol蛋白A，室溫攪拌反應2小時，用NAP-5柱子分離純化得到量子點-蛋白A的共價連接產(chǎn)物；
[0063]6、將量子點-蛋白A的共價連接產(chǎn)物與乙肝表面抗體(HBsAb)等比例混合，室溫攪拌I小時，得到量子點-蛋白A-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物；
[0064]7、將量子點-蛋白A-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物均勻地噴涂在玻璃纖維素膜上，得到涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆?；在硝酸纖維素膜上用機器劃兩條平行帶，帶寬控制在2mm左右，兩條帶間隔8mm，其中一條帶上噴涂HBsAb形成測試帶；另一條帶上噴涂鼠抗人IgG形成控制帶，室溫晾干20分鐘后，得到已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉60分鐘，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0065]8、在單面塑料板上，依次粘貼上玻璃纖維素膜、涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜、吸水玻璃纖維素膜、已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，最后貼上長30厘米，寬2厘米的吸水紙，吸收層析后多余的溶液，膜與膜之間都要緊密相連，制成免疫層析試紙大板用切條機將粘貼好的塑料板縱向切成4_寬的免疫試紙條，干燥下封袋，4-25°C避光保存；
[0066]9、將4mm寬的免疫試紙條樣品墊一端插入待測血清中，層析作用5分鐘后，取出試紙條在紫外燈下觀察結(jié)果，或在熒光光譜儀下測試量子點的熒光光譜，測定HBsAg強陽性標本5分鐘報結(jié)果，測定弱陽和陰性標本20分鐘報結(jié)果。如果膜上的測試帶與控制帶處都有綠色熒光，即兩條熒光，說明待測樣品中含有HBsAg，為陽性結(jié)果，在測試帶的熒光越強，HBsAg的含量越高；如果只有控制帶有綠色熒光，即一條熒光，說明待測樣品中沒有HBsAg ；如果測試帶與控制帶都沒有熒光，說明檢測無效。該檢測方法法靈敏度為lng/ml，特異性為90%以上，批內(nèi)與批間重復性小于20%。
[0067]實施例4
[0068]1、稱取碲粉0.051克(0.4mmol)，硼氫化鈉0.08克(2mmol)，加入含有用氮氣充分除氧的IOml蒸餾水中，得到碲氫化鈉的溶液；
[0069]2、稱取六水合高氯酸鎘0.6714克(1.6mmol)，加入到含有IOOml無氧水的三頸瓶中，再加入巰基丙酸342微升(3.84mmol)，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值在10-11之間；
[0070]3、取I步驟所合成的碲氫化鈉的溶液注入步驟2中的三頸瓶中，升溫至100°C，合成CdTe裸核量子點，通過改變反應的時間在1-10小時之內(nèi)獲得裸核尺寸大于4nm的含有紅光量子點紅褐色溶液；
[0071]4、重復步驟2，制備鎘的殼原料；將九水合硫化鈉粉末溶于無氧水中，制備硫的殼原料，根據(jù)文章J.Phys.Chem.C2008, 112，8587 - 8593的實驗步驟利用連續(xù)離子層吸附反應技術(shù)進行殼層包覆，制備CdTe/CdS核殼量子點；
[0072]5、將I μ molCdTe/CdS核殼量子點與在100 μ molEDC縮合劑混合，活化量子點表面的羧基集團，室溫攪拌30分鐘，然后加入I μ mol蛋白A，室溫攪拌反應2小時，用NAP-5柱子分離純化得到量子點-蛋白A的共價連接產(chǎn)物；
[0073]6、將量子點-蛋白A的共價連接產(chǎn)物與乙肝表面抗體(HBsAb)等比例混合，室溫攪拌I小時，得到量子點-蛋白A-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物；
[0074]7、將量子點-蛋白A-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物均勻地噴涂在玻璃纖維素膜上，得到涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆茫辉谙跛崂w維素膜上用機器劃兩條平行帶，帶寬控制在2mm左右，兩條帶間隔8mm，其中一條帶上噴涂HBsAb形成測試帶；另一條帶上噴涂羊抗人IgG形成控制帶，室溫晾干30分鐘后，得到已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉60分鐘，干燥后封袋，放置4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0075]8、在單面塑料板上，依次粘貼上玻璃纖維素膜、涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜、吸水玻璃纖維素膜、已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，最后貼上長30厘米，寬2厘米的吸水紙，吸收層析后多余的溶液，膜與膜之間都要緊密相連，制成免疫層析試紙大板用切條機將粘貼好的塑料板縱向切成4_寬的免疫試紙條，干燥下封袋，4-25°C避光保存；
[0076]9、將4mm寬的免疫試紙條樣品墊一端插入待測血清中，層析作用20分鐘后，取出試紙條在紫外燈下觀察結(jié)果，或在熒光光譜儀下測試量子點的熒光光譜，測定HBsAg強陽性標本5分鐘報結(jié)果，測定弱陽和陰性標本20分鐘報結(jié)果。如果膜上的測試帶與控制帶處都有紅色熒光，即兩條熒光，說明待測樣品中含有HBsAg，為陽性結(jié)果，在測試帶的熒光越強，HBsAg的含量越高；如果只有控制帶有紅色熒光，即一條熒光，說明待測樣品中沒有HBsAg;如果測試帶與控制帶都沒有熒光，說明檢測無效。該檢測方法法靈敏度為lng/ml，特異性為90%以上，批內(nèi)與批間重復性小于20%。
[0077]實施例5
[0078]1、稱取碲粉0.051克(0.4mmol)，硼氫化鈉0.08克(2mmol)，加入含有用氮氣充分除氧的IOml蒸餾水中，得到碲氫化鈉的溶液；
[0079]2、稱取六水合高氯酸鎘0.6714克(1.6mmol)，加入到含有IOOml無氧水的三頸瓶中，再加入巰基丙酸342微升(3.84mmol)，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值在10-11之間；
[0080]3、取I步驟所合成的碲氫化鈉的溶液注入步驟2中的三頸瓶中，升溫至100°C，合成CdTe裸核量子點，通過改變反應的時間在15-600分鐘之內(nèi)獲得不同尺寸大小的量子點，根據(jù)量子點粒徑大小的不同，獲得裸核尺寸小于3nm的綠光核殼量子點和裸核尺寸大于4nm的紅光光核殼量子點；
[0081]4、重復步驟2，制備鎘的殼原料；將九水合硫化鈉粉末溶于無氧水中，制備硫的殼原料，根據(jù)文章J.Phys.Chem.C2008, 112，8587 - 8593的實驗步驟利用連續(xù)離子層吸附反應技術(shù)進行殼層包覆，制備裸核尺寸小于3nm的綠光CdTe/CdS核殼量子點和裸核尺寸大于4nm的紅光CdTe/CdS核殼量子點；
[0082]5、分別將I μ mol裸核尺寸小于3nm的綠光核殼量子點和I μ mol裸核尺寸大于4nm的紅光核殼量子點與在100 μ molEDC縮合劑混合，活化量子點表面的羧基集團，室溫攪拌30分鐘，然后分別加入I μ mol蛋白G，室溫攪拌反應2小時，用NAP-5柱子分離純化得到綠光量子點-蛋白G的共價連接產(chǎn)物和紅光量子點-蛋白G的共價連接產(chǎn)物；
[0083]6、將綠光量子點-蛋白G的共價連接產(chǎn)物與乙肝表面抗體(HBsAb)等比例混合，紅光量子點-蛋白G的共價連接產(chǎn)物與乙肝e抗體(HBeAb)等比例混合，室溫攪拌I小時，得到綠光量子點-蛋白G-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物和綠光量子點-蛋白G-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物；
[0084]7、將綠光量子點-蛋白G-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物和綠光量子點-蛋白G-HBsAb的柔性偶聯(lián)標記產(chǎn)物等比例混合后，均勻地噴涂在玻璃纖維素膜上，得到涂有綠光和紅光量子點標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆茫辉谙跛崂w維素膜上用機器劃兩條平行帶，帶寬控制在2mm左右，兩條帶間隔8mm，其中一條帶上噴涂等量HBsAb和HBeAb形成測試帶；另一條帶上噴涂羊抗人IgG形成控制帶,室溫晾干30分鐘后，得到已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉60分鐘，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0085]8、在單面塑料板上，依次粘貼上玻璃纖維素膜、涂有綠光和紅光量子點標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜、吸水玻璃纖維素膜、已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，最后貼上長30厘米，寬2厘米的吸水紙，吸收層析后多余的溶液，膜與膜之間都要緊密相連，制成免疫層析試紙大板用切條機將粘貼好的塑料板縱向切成4_寬的免疫試紙條，干燥下封袋，4-25°C避光保存；
[0086]9、將4mm寬的免疫試紙條樣品墊一端插入待測血清中，層析作用15分鐘后，取出試紙條在熒光光譜儀下測試量子點的熒光光譜，測定HBsAg和HBeAg強陽性標本5分鐘報結(jié)果，測定弱陽和陰性標本20分鐘報結(jié)果。如果膜上的測試帶與控制帶處都有綠色和紅色熒光，即兩條熒光，說明待測樣品中含有HBsAg和HBeAg，為陽性結(jié)果，在測試帶的熒光越強，HBsAg和HBeAg的含量越高；如果膜上的測試帶與控制帶處都有熒光，即兩條熒光，測試帶上只有綠光，說明待測樣品中含有HBsAg，為陽性結(jié)果，測試帶上只有紅光，說明待測樣品中含有HBeAg，為陽性結(jié)果，在測試帶的熒光越強，HBsAg和(或)HBeAg的含量越高；如果只有控制帶有熒光，即一條熒光，說明待測樣品中沒有HBsAg和HBeAg ;如果測試帶與控制帶都沒有熒光，說明檢測無效。該檢測方法法靈敏度為lng/ml，特異性為90%以上，批內(nèi)與批間重復性小于20%ο
【權(quán)利要求】
1.一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，其特征在于，包括如下: 步驟一:制備核殼量子點； 步驟二:將步驟一得到的核殼量子點與蛋白G或蛋白A通過EDC縮合的方式進行共價連接，得到共價連接產(chǎn)物； 步驟三:將步驟二得到的共價連接產(chǎn)物與待檢測抗原分子的一個抗體分子混合，得到量子點抗體柔性偶聯(lián)的標記產(chǎn)物； 步驟四:將步驟三得到的量子點抗體柔性偶聯(lián)的標記產(chǎn)物涂在玻璃纖維素膜上，得到涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜，將待檢測抗原分子的另一個抗體和二抗分別噴涂在硝酸纖維素膜上形成測試帶和控制帶，得到已平行包被抗體的硝酸纖維素膜； 步驟五:在單面聚酯或塑料板上，依次粘貼上玻璃纖維素濾膜、涂有標記產(chǎn)物的玻璃纖維素膜、吸水纖維素膜、已平行包被抗體的硝酸纖維素膜，將粘貼后的聚酯或塑料板制作得到免疫層析試紙條； 步驟六:將步驟五得到的免疫層析試紙條的墊端插入待測樣品溶液中，免疫層析后取出試紙條，確定檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，其特征在于，所述的核殼量子點為CdTe/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe或CdSe/ZnS核殼量子點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，其特征在于，所述的共價連接產(chǎn)物與待檢測抗原分子的一個抗體分子的摩爾比為1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，其特征在于，所述的步驟四中，測試帶和控制帶平行設(shè)置，測試帶和控制帶的間隔為 8_12mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，其特征在于，所述的將待檢測抗原分子的另一個抗體和二抗分別噴涂在硝酸纖維素膜上形成測試帶和控制帶后，室溫晾干20-30分鐘后，再放入含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中封閉60-120分鐘，干燥后封袋，放置4°C保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，其特征在于，所述的待測樣品溶液為血液、尿液或唾液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于核殼量子點柔性偶聯(lián)標記物免疫層析試紙條的檢測方法，其特征在于，所述的步驟六中，免疫層析后取出試紙條后，具體為:將試紙條在紫外燈下肉眼觀察結(jié)果，或在熒光光譜儀下獲得檢測光譜曲線，通過與標準曲線對比，確定檢測結(jié)果。
【文檔編號】G01N33/68GK103760363SQ201410008389
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】曾慶輝, 紀文宇 申請人:中國科學院長春光學精密機械與物理研究所