用于暈厥的診斷、預后、評估和治療分層的生物標志物的制作方法

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用于暈厥的診斷、預后、評估和治療分層的生物標志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于患者的暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層的方法，所述方法包括：測定所述患者的體液樣品中至少一個生物標志物的水平，所述生物標志物選自proET-1、proADM、proANP、proBNP、proAVP和PCT或它們至少12個氨基酸的片段，使至少一個生物標志物或其片段的所述水平與暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層相關聯(lián)。
【專利說明】用于暈厥的診斷、預后、評估和治療分層的生物標志物發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及臨床診斷的領域。具體地本發(fā)明涉及暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在明顯和明確的病因學不存在的情況下一過性意識喪失（TL0C)的評價是個復雜問題。TL0C被分成創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性形式，非創(chuàng)傷性TL0C被分類成癲癇性發(fā)作、精神性假性暈厥、罕見的其它原因和暈厥。對于大部分具有不確定的診斷的情況，潛在原因是導致腦血流灌注過少的臨時循環(huán)障礙，常規(guī)地分類為暈厥發(fā)作(Blanc等人2002. Eur Heart .Τ· 23:815-820 :Bartoletti 等人 2006. Eur Heart T 27:83-88)。
[0004] 暈厥表征為通常無警告地發(fā)生的快速發(fā)作、短持續(xù)時間和自發(fā)完全恢復的TLOC。具體地，暈厥可被分成神經(jīng)介導的反射性暈厥（匪S)、直立性低血壓（0H)和心源性暈厥（心律不齊或結構性的），盡管可能會發(fā)生頻率較低的狀況(Moya等人2009. Heart T. 30:2631-2671)。
[0005] 匪S通?；谏婕白疃嗟膫鞒雎窂剑?，交感神經(jīng)或副交感神經(jīng)路徑）來進行分類：如果歸因于直立縮血管緊張喪失的低血壓占優(yōu)勢，則使用術語血管減壓性暈厥；如果心動過緩或心搏停止占優(yōu)勢，則使用術語心動抑制性暈厥；如果兩種機制存在，則診斷為混合形式。此外，匪S還可基于其觸發(fā)因素（即傳入路徑）被分類成血管迷走神經(jīng)性暈厥 (VVS)、情境性暈厥（與一些特殊情境相關的NMS)、頸動脈竇過敏（CSH)和非典型形式（其中匪S因未明確觸發(fā)因素或甚至明顯地在觸發(fā)因素不存在的情況下發(fā)生）的觸發(fā)劑（即傳入路徑）。
[0006] 與匪S相反，在直立性低血壓中，交感神經(jīng)傳出活性長期受損，這樣血管收縮不充分。當站立時，血壓（BP)下降，從而暈厥或先兆暈厥發(fā)生。0H被定義為站立時BP的異常降低。嚴格地從病理生理學觀點來看，匪S與0H之間不存在重疊，但這兩種病況的臨床表現(xiàn)經(jīng)常重疊，有時#得鑒別診斷奪得閑難（Mova等人2009. Heart T. 30:2631-2671)。0H可被分成典型0H (定義為在3分鐘內的站立大于等于20mmHg的收縮BP的下降以及大于等于 lOmmHg的舒張 BP的下降(T Neurol Sci 1996 :144:218-219))、初始件0H(表征為剛站起時大于40mmHg的BP下降和BP至正常的自發(fā)快速回復，導致短期的低血壓和癥狀（Wieling 等人2007. Clin Sci (Lond) 112:157-165))、延遲的(進行性）OH(表征為在假定直立姿勢時收縮 BP 的緩慢進行性下降(Gibbons and Freeman 2006. Neurology67:28-32))，和體位直立性心運過速綜合征（POTS)(表征為每分鐘大于30次搏動或每分鐘大于120次搏動的非常顯著的心率增加以及BP的不穩(wěn)定性(Grubb等人1997. Pacing Clin Electrophysiol 20:2205-2212))。
[0007] 心源性暈厥可由心律不齊（心動過緩、心動過速）或結構性疾?。ɡ纾难K瓣膜病、急性心肌梗塞/缺血、冠狀動脈的先天異常、肺性高血壓等）引起。
[0008] 暈厥分類的概述示于圖1中。
[0009] 根據(jù)當前暈厥指導方針，推薦2個主要調查路線，基于長期ECG監(jiān)控和自主測試的先進心臟評估，其中直立傾斜試驗（HUTT)具有中心作用(Mova等人2009. Heart T. 30:2631-2671)。路線的選擇通常取決于患者的歷史和暈厥情況。
[0010] ECG監(jiān)控是用于診斷間歇性緩慢性和快速性心律失常的方法。暈厥診斷的金標準是何時記錄到癥狀與已記錄的心律失常之間的關聯(lián)。一般而言，僅當存在鑒定與暈厥相關的心律失常的高驗前概率時才顯示需要ECG監(jiān)控。
[0011] 在自主測試中，直立性挑戰(zhàn)（orthostatic challenge)(從仰臥位變化至直立位）產(chǎn)生血液從胸部至下肢的移位，這導致靜脈回流和心輸出量的減少。在代償機制不存在的情況下，BP的下降可導致暈厥。目前，存在兩個不同的用于評估對從仰臥位至直立位的姿勢的改變的反應的方法：主動站立測試，其中患者主動從仰臥位至直立位站立，另一種是以 60或70°的頭離位分傾斜。主動站立測試用于使用血壓計診斷不同類型的直立耐受不能 (orthostatic intolerance)。傾斜測試使得能夠在實驗室情境中再現(xiàn)神經(jīng)介導的反射。因直立應激和制動（immobilization)引起的血液滯積和靜脈回流的減少觸發(fā)反射。然而，診斷過程是非常耗時的并且并非總是成功的(Croci等人2002. Europace 4:351-355)。
[0012] 已在具有不同類型的具有異質結果的暈厥的患者中研究了血管活性激素的循環(huán) 水平。在具有VVS的患者中，未發(fā)現(xiàn)精氨酸-加壓素（AVP)在基線（在HUT測試之前）上的差異(Kaufmann 等人 199L Lancet 338:8782-8783 :Kaufmann 等人 1992. Neurology 42:590-593 :Tardine 等人 1997. Am T Cardiol 79:1302-1306:Roul 等人 1999.Pacing Clin Electrophvsiol 22:1020-1030 :The〇pistou等人 2001. Am T Cardiol. 88:376-381)。已顯示成熟AVP的增加在具有陽性HUT測試結果的組（被分類為具有VVS的患者）中相較于陰性HUT測試組更明顯(Tardine等人1997. Am T Cardiol 79:1302-1306 : Roul 等人 1999.Pacing Clin Electrophysiol 22:1020-1030 :Kaufmann 等人 1991. Lancet338:8782-8783 :Kaufmann 等人 1992. Neurology 42:590-593 :Theopistou 等人 2001. Am T Cardiol. 88:376-381)。此外，肽素（也稱為 C_ 末端 proAVP (CT-proAVP)的 proAVP前體的穩(wěn)定片段）的水平在具有心動抑制型暈厥與血管減壓反射性暈厥的患者之間沒有差異(Holmegard等人2012. Scand T Clin Lab Invest,出版中）。類似地，在具有VVS的患者中未發(fā)現(xiàn)心房或腦鈉尿肽（ANP或BNP)的差異(Tardine等人1997. Am T Cardiol 79:1302-1306 :Roul 等人 1999.Pacing Clin Electrophvsiol 22:1020-1030 : Magerkurth 等人 2005. Cl in Autonom Res 15:299-301)。相反地，Holmegard 等人手艮導了當與具有血管減壓反射性暈厥的患者相比較時在具有心動抑制型暈厥的患者中存在更高水平的中段心房鈉尿肽原（MR-proANP)(前proANP的穩(wěn)定片段），然而BNP的水平在組之間無差異(Holmegard 等人 2012. Scand .T Clin Lab Invest,出版中）。類似地，Jardine 等人顯示在傾斜過程中正常受試者和VVS的ANP的減少，這在正常群體中更明顯(Tardine等人 1997. Am T Cardiol 79:1302-1306)。與這些結果相反，F(xiàn)reitas等人報導BNP的仰臥位水平在具有神經(jīng)介導性暈厥的患者中相較于具有神經(jīng)源性0H的患者顯著更低，然而ANP的水平不變(Freitas 等人 2007. Int T Cardiol 116:242-248)。此外，ANP 和 BNP 的差（Λ 傾斜 /基線）在具有神經(jīng)介導性暈厥的患者之間相較于具有神經(jīng)源性0Η的患者無差異。Gajek 等人報導了在自發(fā)性暈厥的患者與藥物誘發(fā)暈厥的患者之間，心動抑制反射的患者的基線腎上腺髓質素濃度無差異(Gaiek 等人 2004. Pol Merkur Lekarski 17:267-270)。
[0013] 當與健康對照或具有不明原因暈厥的患者相比較時在具有CSH的患者中未發(fā) 現(xiàn)AVP基線水平的差異，然而具有CSH的患者和具有不明原因暈厥的患者的AVP在傾斜過程中顯示顯著的增加，這在健康受試者中不明顯(Kenny等人1987. Cardiovasc Res 21:545-550)。
[0014] 在無 VVS史但具有一定直立耐受不能的健康志愿者中，在基線水平上，血清內皮縮血管肽水平在于HUTT過程中經(jīng)歷暈厥的受試者中相較于無暈厥的受試者顯著更高 (Magerkurth等人2005. Clin Autonom Res 15:299-301)。此夕卜，作者聲明這些結果意味著具有血管迷走神經(jīng)性暈厥傾向的受試者的永久性增強的內皮縮血管肽釋放，以及將來的研究必須調查內皮縮血管肽血清水平是否可增強診斷血管迷走神經(jīng)性暈厥的特異度和靈敏度。具有VVS的患者和正常受試者的ET-1在HUT測試過程中增加，然而該增加在具有VVS 的患者中更明顯(Kaufmann等人1991. Lancet 338: 8782-8783)。相反地，Mehta等人報導了當與具有陽性HUTT結果的患者相比較時，基線內皮縮血管肽水平在具有暈厥史和陰性 HUTT的患者中顯著更高(Mehta等人1995. Am T Cardiol 76:86-88)。然而，在暈厥亞型心動抑制型、血管減壓性和混合型之間無差異，并且在時間樣品（timed sample)之間無差異。
[0015] 研究健康志愿者的腎上腺髓質素（ADM)，根據(jù)下體負壓試驗（LBNP)將受試者分成高（無暈厥）和低（暈厥癥狀）直立性挑戰(zhàn)耐受性(Gasiorowska等人2005. T Phvsiol Pharmacol 56:179-193)。ADM的基線值在低耐受性受試者中相較于對于直立性挑戰(zhàn)具有高耐受性的受試者顯著更高，然而ADM在測試過程中在兩個組中類似地增加。
[0016] 然而，對于所有這些研究，重要地要指出，在2009年公布ESC指導方針之前(Moya 等人2009. Heart T. 30:2631-2671),不存在對于暈厥患者的金標準診斷,因而關于不同形式的直立性不穩(wěn)定性不存在一致意見，它們與暈厥發(fā)作的關系是不可獲得的。此外，對少數(shù) 選擇患者系列（主要地與健康個體相比較）進行上述生物標志物研究，所述研究不包括全譜的基本機制。因此，特定類型的暈厥的診斷具有挑戰(zhàn)性并且不太可靠。
[0017] 此外，可靠的診斷是適當療法的選擇的重要前提。療法的目的主要是預防復發(fā) 和相關損傷，以及提高生活質量。用于神經(jīng)介導性暈厥的療法選擇是例如身體抗壓動作 (physical counterpressure manoeuvre)(例如腿或臂的等長PCM，如腿交叉或手緊握和手臂繃緊）和傾斜訓練以及藥物治療（例如米多君，α-拮抗劑）以及心臟起搏法。Brignole 已報導主動起搏器治療顯著減少具有嚴重神經(jīng)介導性暈厥的患者，特別地具有心動抑制的 CSH 的暈厥復發(fā)(oral presentation. American College of Cardiology. Chicago USA. 24-27 of March 2012) 〇實際上，在嚴重心動抑制不存在的情況下忌用起搏。因此，暈厥的準確診斷和嚴重度的評估是強制性的。
[0018] 關于與暈厥相關的預后（即風險分層），應當考慮兩個重要因素：（i)死亡和威脅生命的事件的風險；和（ii)暈厥和身體傷害復發(fā)的風險。
[0019] 因此，本發(fā)明的目的是提供允許暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層的方法。
[0020] 發(fā)明概述
[0021] 本發(fā)明的主題是用于患者的暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層的方法，所述方法包括：
[0022] -測定所述患者的體液樣品中至少一個生物標志物的水平，所述生物標志物選自 proADM、proANP、proBNP、proAVP、proET-Ι和PCT或者它們至少12個氨基酸的片段，
[0023] -使至少一個生物標志物的所述水平與暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層相關聯(lián)。
[0024] 優(yōu)選方法變型描述于從屬權利要求中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1 :暈厥亞型的分類
[0026] 圖2 :用于暈厥的診斷的MR-proANP值的盒須圖
[0027] 圖3 :用于暈厥的診斷的MR-proADM值的盒須圖
[0028] 圖4 :用于暈厥的診斷的CT-proET-Ι值的盒須圖
[0029] 圖5 :用于暈厥的診斷的CT-proAVP值的盒須圖
[0030] 圖6 :用于暈厥的診斷的PCT診斷的盒須圖
[0031] 圖7 :MR-proANP與VVS之間的線性關系
[0032] 圖8 :CT-proET-l與VVS之間的線性關系
[0033] 圖9 :CT-proET-l與0H之間的線性關系
[0034] 圖10 :MR-proANP與CSH之間的線性關系和閾值樣作用
[0035] 圖11 :CT-proET-l與心動抵制反射之間的線性關系
[0036] 圖12 :CT-proAVP與初始性0H之間的閾效應
[0037] 發(fā)明詳述
[0038] 本發(fā)明的主題是提供用于患者的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層的方法，所述方法包括：
[0039] 測定所述患者的體液樣品中至少一個生物標志物的水平，所述生物標志物選自 proADM、proANP、proBNP、proAVP、proET-Ι和PCT或者它們至少12個氨基酸的片段，
[0040] 使至少一個生物標志物的所述水平與暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層相關聯(lián)。
[0041] 暈厥被定義為因一過性全腦低灌注引起的一過性意識喪失，其表征為快速發(fā)作、短持續(xù)時間和自發(fā)完全恢復(Mova等人2009. Heart T. 30:2631-2671)。
[0042] VVS被定義為與明顯的低血壓和/或心動過緩/心搏停止的特征模式相關的暈厥的再現(xiàn)。
[0043] CSH被定義為大于等于50mmHg的SBP的下降和/或超過3秒的心搏停止。
[0044] 0H被定義為大于等于20mmHg的收縮BP (SBP)的持續(xù)下降和/或大于等于lOmmHg 的舒張 BP (DBP)的下降，或小于90mmHg的收縮BP (典型0H，在3min的傾斜期內；和延遲0H，在3至20min內），然而POTS具有在站立姿勢時大于30/min的心率增加或大于120/min的心動過速的直立耐受不能的特征癥狀。當短暫BP在站立后15秒內下降超過40mmHg SBP 和/或超過20mmHg DBP時，初始性0H存在，腦低灌注的癥狀發(fā)生并且患者報告了典型的暈厥情況(Wieling 等人 2007. Clin Sci(Lond)。112:157-165)。
[0045] 心動抑制性暈厥被定義為至超過10秒的低于40bpm的心室率的心率下降，或超過 3秒的心搏停止，然而，血管減壓反射被定義為在暈厥時與其峰值相比小于等于10 %的心率下降(Brignole 等人 2000. Europace 2:66-76)。
[0046] 如本文中所述，"測定"或"診斷測定"可以是用于診斷領域的任何類型的測定。這樣的測定可基于待檢測的分析物以一定親和力與一種或多種捕獲探針的結合。關于捕獲分子與靶分子或目標分子之間的相互作用，親和常數(shù)優(yōu)選大于io8m'
[0047] 在本發(fā)明的上下文中，"捕獲分子"是可用于結合靶分子或目標分子即來自樣品的分析物（例如在本發(fā)明上下文中的肽）的分子。捕獲分子因此必須在空間上和表面特征 (例如表面電荷、疏水性、親水性、路易斯供體和/或受體的存在或不存在）方面被充分地塑造來特異性結合靶分子或目標分子。因此，結合可以例如通過捕獲分子與靶分子或目標分子之間的離子、范德瓦爾斯、π-π、σ-Ji、疏水或氫鍵相互作用或上述相互作用的兩個或更多個的組合介導。在本發(fā)明的上下文中，捕獲分子可以例如選自核酸分子、碳水化合物分子、PNA分子、蛋白質、抗體、肽或糖蛋白。優(yōu)選，捕獲分子是具有足夠的對于靶或目標分子的親和力的抗體，包括其片段，以及包括重組抗體或重組抗體片段，以及所述抗體的化學和 /或生物化學修飾衍生物或其源自可變鏈的至少12個氨基酸的長度的片段。
[0048] 優(yōu)選檢測法包括以各種形式存在的免疫測定，例如放射免疫測定（RIA)、化學發(fā)光和熒光免疫測定、酶聯(lián)免疫測定（ELISA)、基于Luminex的珠粒陣列、蛋白質微陣列測定和快速測試形式例如免疫層析試條測試色譜試條測試。
[0049] 測定可以是均相測試或異相測定，競爭性和非競爭性測定。在特別優(yōu)選實施方案中，測定以夾心測定的形式存在，其為非競爭性免疫測定，其中待檢測和/或定量的分子結合于第一抗體和第二抗體。第一抗體可結合于固相，例如珠粒、孔或其它容器、芯片或試條的表面，第二抗體是例如利用染料、放射性同位素或反應性部分或催化活性部分標記的抗體。隨后通過適當?shù)姆椒y量結合于分析物的標記抗體的量。與"夾心測定"有關的一般組合物和方法已被良好建立并且對于本領域技術人員來說是已知的(The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild,Elsevier LTD, Oxford ：第 3 版(May 2005), ISBN-13 ： 978-0080445267 :Hultschig C 等人，Curr (bin Chem Biol. 2006 Feb :10(1) :4-10. PMID : 16376134,通過此用并入本文）。
[0050] 在特別優(yōu)選實施方案中，測定包括兩種捕獲分子，優(yōu)選作為分散體均存在于液體反應混合物中的抗體，其中第一標記組分連接于第一捕獲分子，其中所述第一標記組分為基于熒光-或化學發(fā)光-淬滅或放大的標記系統(tǒng)的部分，并且所述標記系統(tǒng)的第二標記組分連接于第二捕獲分子，以便在兩種捕獲分子結合分析物后，產(chǎn)生允許檢測在包含樣品的溶液中形成的夾心復合物的可測量信號。
[0051] 甚至更優(yōu)選，所述標記系統(tǒng)包含與熒光染料或化學發(fā)光染料，特別地花青類型的染料組合的稀土穴狀化合物或稀土螯合劑。
[0052] 甚至更優(yōu)選，所述標記系統(tǒng)包含與熒光染料或化學發(fā)光染料，特別地花青類型的染料組合的稀土穴狀化合物或稀土螯合劑。在本發(fā)明的說明書中，基于熒光的測定包括染料的使用，所述染料可以例如選自FAM(5-或6-羧基熒光素）、VIC、NED、熒光素、異硫氰酸熒光素（FITC)、IRD-700/800、花青染料例如 CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、CY7、咕噸、6-羧基-2'，4'，7'，4,7_ 六氯熒光素（HEX)、TET、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基熒光素（J0E)、Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基-6-羧基羅丹明（TAMRA)、6_羧基-X-羅丹明（R0X)、 5_羧基羅丹明-6G (R6G5)、6_羧基羅丹明-6G (RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明 110、B0DIPY染料例如B0DIPY TMR、俄勒岡綠、香豆素類例如傘形酮、苯甲亞胺例如Hoechst 33258 ;菲啶類例如德克薩斯紅、Yakima黃、Alexa Fluor、PET、溴化乙錠、吖啶酯染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、紫菜堿染料、聚甲炔染料等。
[0053] 在本發(fā)明的說明書中，基于化學發(fā)光的測定包括基于在 Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology,第 4 版·，執(zhí) 斗丁編輯，.L I. Kroschwitz :編輯，Μ· Howe-Grant, .Tohn Wiley&Sons, 1993,第 15 卷，d. 518-562 (通過引用并入本文，包括第551-562頁上的引用）中針對化學發(fā)光材料描述的物理原理的染料的使用。優(yōu)選化學發(fā)光染料為吖啶酯。
[0054] "診斷"在本發(fā)明的說明書中涉及受試者的疾病或臨床病況的識別和（早期）檢測，并且還可包括鑒別診斷。
[0055] 術語"評估"涉及患者的疾病的嚴重度的評價。
[0056] 在本發(fā)明中，術語"預后"是指受試者（例如患者）的醫(yī)學狀況將如何進展的預測。這可包括所述受試者的恢復可能性或不良后果（例如暈厥發(fā)作的復發(fā)或死亡）的可能性的評價。
[0057] 如本文中所用，術語"患者"是指正在接受醫(yī)療護理或因疾病而應當接受醫(yī)療護理的活著的人或非人生物體。這包括正被調查病理學體征的無明確疾病的人。因此，本文中描述的方法和測定適用于人和獸醫(yī)學疾病。
[0058] 如本文中所用，術語"樣品"是指為了目標受試者例如患者的診斷、預后或評價而獲得的體液的樣品。優(yōu)選測試樣品包括血液、血清、血漿、腦脊髓液、尿、唾液、痰和胸腔積液。此外，本領域技術人員可認識到一些測試樣品在分級分離或純化步驟例如全血至血清或血漿組分的分離后可更容易分析。
[0059] 因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊髓液樣品、唾液樣品和尿樣品或上述樣品的任何樣品的提取物。優(yōu)選，樣品為血液樣品，最優(yōu)選血清樣品或血漿樣品。
[0060] 如本文中針對診斷和預后標志物的用途所用的，術語"使......相關聯(lián)"是指將標志物在患者中的存在或水平與其在已知患有給定的病況或處于發(fā)生所述病況的風險中的人中的存在或量相比較?？蓪⒒颊邩悠返臉酥疚锼脚c已知與特定診斷相關的水平相比較。樣品的標志物水平被認為與診斷相關；即，本領域技術人員可使用標志物水平來確定患者是否患有特定類型的疾病和相應地作出反應?；蛘撸蓪悠返臉酥疚锼脚c已知與良好結果（例如疾病的不存在等）相關的標志物水平相比較。在優(yōu)選實施方案中，使一小組標志物水平與總概率或特定結果相關聯(lián)。
[0061] 診斷和/或預后測試的靈敏度和特異度不僅取決于測試的分析"質量"，它們還取決于構成異常結果的事物的定義。實際上，接收器操作特征曲線（R0C曲線）通常通過將為量的值針對其在"正常"（即表面上健康）與"患病"群體（即患有糖尿病、胰島素抗藥性和 /或代謝綜合征的患者）中的相對頻率作圖來計算。對于任何特定標志物，具有疾病和不具有疾病的受試者的標志物水平的分布將可能重疊。在這樣的條件下，測試不能以100%的準確性將正常與疾病絕對區(qū)分開，重疊的面積表示其中測試不能區(qū)分正常與疾病。選擇閾值，高于其（或低于其，取決于標志物如何隨疾病變化），則測試被認為是異常的，低于其，則測試被認為是正常的。R0C曲線下面積是察覺測量將允許修正病況的鑒定的概率的量度。甚至當測試結果不一定給出準確數(shù)值時，亦可使用R0C曲線。只要可將結果分級，就可產(chǎn)生 R0C曲線。例如，對"疾病"樣品的測試的結果可能按照程度（例如，1 =低，2 =正常以及 3=高）來進行分級?？墒乖摲旨壟c"正常"群體中的結果相關聯(lián)，并且ROC曲線產(chǎn)生。這些方法在本領域是公知的（參見，例如，Hanley等人1982. Radiology 143 :29-36)。優(yōu)選， R0C曲線導致大于約0. 5,更優(yōu)選大于約0. 7,更優(yōu)選大于約0. 8,更優(yōu)選大于約085,最優(yōu)選大于約0. 9的AUC。在本說明書中，術語"約"是指給定測量的+/-5%。
[0062] R0C曲線的水平軸代表（1-特異性），其隨假陽性的比率增加而增加。曲線的垂直軸代表靈敏度，其隨真陽性的比率增加而增加。因此，對于選擇的具體截斷值，可測定 (1-特異度）的值，并且可獲得對應的靈敏度。R0C曲線下面積是測量的標志物水平將允許修正疾病或病況的鑒定的概率的量度。因此，R0C曲線下面積可用于測定測試的有效性。
[0063] 在某些實施方案中，標志物和/或標志物小組被選擇來顯示至少約70 %的特異度，更優(yōu)選至少約80%的特異度，更優(yōu)選至少約85 %的特異度，更優(yōu)選至少約90 %的特異度，最優(yōu)選至少約95%的特異度組合的至少約70 %的靈敏度，更優(yōu)選至少約80%的靈敏度，更優(yōu)選至少約85 %的靈敏度，更優(yōu)選至少約90 %的靈敏度，最優(yōu)選至少約95 %的靈敏度。在特別優(yōu)選實施方案中，靈敏度和特異度為至少約75 %，更優(yōu)選至少約80 %，更優(yōu)選至少約85%，更優(yōu)選至少約90%，最優(yōu)選至少約95%。在本說明書中，術語"約"是指給定的測量的+/-5%。
[0064] 閾值水平可以例如從Kaplan-Meier分析獲得，其中疾病的發(fā)生與群體中心血管標志物的四分位數(shù)相關。根據(jù)該分析，具有高于第75百分位數(shù)的心血管標志物水平的受試者具有顯著增加的患根據(jù)本發(fā)明的疾病的風險。該結果進一步得到具有對典型風險因素的全面調整的Cox回歸分析的支持：最高百分位相對所有其它受試者與增加的患根據(jù)本發(fā)明的疾病的風險高度顯著相關。
[0065] 其它優(yōu)選截斷值例如為正常群體的第90、95或99百分位。通過使用比第75百分位更高的百分位，可減少鑒定的假陽性受試者的數(shù)目，但可能錯過鑒定處于中等（雖然仍然增加的）風險中的受試者。因此，可能采用取決于其是否被認為更適合于以也鑒定"假陽性"為代價鑒定大多數(shù)處于風險中的受試者，或其是否被認為更適合于以錯過處于中等風險的若干受試者為代價主要鑒定處于高風險中的受試者的截斷值。
[0066] 通過使用個體的心血管標志物水平值以及其它預后實驗室和臨床參數(shù)來計算個體的風險的其它數(shù)學可能性是例如NRI (凈新分類指數(shù)）或IDI (綜合判別指數(shù)）?？?根據(jù) Pencina(Pencina MT.等人：Evaluating the added predictive ability of a new marker :from area under the ROC curve to reclassification and beyond. Stat Med. 2008 ：27:157-172)計算指標。
[0067] 在本發(fā)明的說明書中，術語"水平"涉及獲自患者樣品的標志多肽的濃度（優(yōu)選地表達為重量/體積；w/v)。
[0068] 如本文中在蛋白質和其它肽的背景中提及的，術語"片段"是指來源于更大的蛋白質或肽的更小的蛋白質或肽，其因而包含更大的蛋白質或肽的部分序列。所述片段可通過一個或多個其肽鍵的皂化從更大的蛋白質或肽衍生而來。標志物PCT、proANP、proBNP、 pr〇ET-l、proADM和proAVP的"片段"優(yōu)選涉及在長度上具有至少6個氨基酸，最優(yōu)選在長度上具有至少12個氨基酸殘基的片段。這樣的片段優(yōu)選可利用本文中描述的免疫測定法來檢測。
[0069] 鈉尿肽原選自心房鈉尿肽原（proANP)和腦鈉尿肽原（proBNP)或在長度上具有至少12個氨基酸的其片段。
[0070] 153個氨基酸的前proANP的序列示于SEQ ID N0:1中。在切割N末端信號肽 (25個氨基酸）和2個C末端氨基酸后，釋放pr〇ANP(SEQ ID N0:2)。該激素原被切割成 28個氨基酸的成熟肽ANP，也稱為ANP (1-28)或α -ANP，和氨基末端proANP片段（1-98) (NT-proANP，SEQ ID N0:3)。中段 proANP(MR-proANP)被定義為 NT-proANP 或包含 proANP 的至少氨基酸殘基53-90 (SEQ ID NO: 4)的其任意片段。
[0071] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，測定proANP前體片段MR-proANP的水平。
[0072] 腎上腺髓質素的前體肽（pre-pro-腎上腺髓質素）的氨基酸序列示于SEQ ID N0:5中。腎上腺髓質素原涉及腎上腺髓質素原前體的氨基酸殘基22至185。腎上腺髓質素原（proADM)的氨基酸序列示于SEQ ID N0:6中。MR-腎上腺髓質素原（MR-proADM)涉及 proADM前體的氨基酸殘基45-92。MR-proADM的氨基酸序列示于SEQ ID N0:7中。
[0073] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，測定proADM前體片段MR-proADM 的水平。
[0074] 加壓素的164個氨基酸的前體肽（前加壓素原）的序列示于SEQ ID N0:8中。加壓素涉及加壓素原前體的序列的氨基酸殘基19至164。加壓素原的氨基酸序列示于SEQ ID N0:9中。加壓素原被切割成成熟加壓素、后葉激素運載蛋白II和C-末端加壓素原 (CT-proAVP或肽素）。肽素涉及加壓素原前體的氨基酸殘基126至164。肽素的氨基酸序列提供于SEQ ID N0:10中。后葉激素運載蛋白II包含加壓素原體前體的氨基酸殘基32 至124并且其序列示于SEQ ID N0:11中。
[0075] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，測定proAVP前體片段肽素的水平。
[0076] 原降鈣素是降鈣素和抗鈣素的前體。PCT 1-116的氨基酸序列示于SEQ ID N0:12 中。
[0077] 134個氨基酸的腦鈉尿肽的前體肽（前proBNP)的序列示于SEQ ID NO: 13中。 proBNP涉及前proBNP的氨基酸殘基27至134。proBNP的序列示于SEQIDN0:14中。 proBNP被切割成N末端proBNP (NT-pro-BNP)和成熟BNP。NT-proBNP包含氨基酸殘基27 至102并且其序列示于SEQ ID NO: 15中。SEQ ID NO: 16顯示包含前BNP肽原的氨基酸殘基103至134的BNP的序列。
[0078] 212個氨基酸的內皮縮血管肽-1的前體肽（前內皮縮血管肽-1原）的序列示于SEQIDN0 :17中。ET-l原涉及前proET-l的序列的氨基酸殘基18至212。ET-l原的氨基酸序列示于SEQIDN0 :18中。ET-l原被切割成成熟ET-l、大-ET-l和C-末端 proET-1 (CT-proET-Ι)。ET-1涉及前proET-Ι的氨基酸殘基53至73。ET-1的氨基酸序列示于SEQIDN0:19中。CT-proET-l涉及前proET-l的氨基酸殘基168至212。CT-proET-l 的氨基酸序列提供于SEQ ID N0:20中。大-ET-1包含前proET-Ι的氨基酸殘基53至90 并且其序列示于SEQ ID N0:21中。
[0079] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，測定前proBNP片段NT-proBNP或BNP的水平。
[0080] 在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)選實施方案中，測定由氨基酸1至116或2至116 或3至116組成的PCT的水平。
[0081] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線CT-proET-Ι水平高于預定閾值水平時，患者被診斷為患有直立性低血壓（全部）。優(yōu)選地，預定閾值水平為30至70pmol/ L，更優(yōu)選45至70pmol/L，更優(yōu)選55至70pmol/L，最優(yōu)選60至（高于）70pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線CT-proET-Ι水平高于30pmol/L，優(yōu)選高于40pmol/L，更優(yōu) 選高于45pmol/L，更優(yōu)選高于55pmol/L，更優(yōu)選高于60pmol/L，最優(yōu)選高于70pmol/L時，患者被診斷為患有0H。
[0082] 更優(yōu)選，當所述測定的基線CT-proET-Ι水平低于預定閾值水平時，患者被診斷為不具有直立性低血壓（全部）。優(yōu)選，預定閾值水平為30至70pmol/L，更優(yōu)選30至60pmol/ L，更優(yōu)選30至55pmol/L，最優(yōu)選30至45pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線CT-proET-Ι水平低于70pmol/L，優(yōu)選低于60pmol/L，更優(yōu)選低于55pmol/L，更優(yōu)選低于 45pmol/L，最優(yōu)選低于30pmol/L時，患者被診斷為不患有0H。
[0083] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線MR-proANP水平低于預定閾值水平時，患者被診斷為患有CSH。優(yōu)選，預定閾值水平為50至200pmol/L，更優(yōu)選50至 150pmol/L，更優(yōu)選50至100pmol/L，最優(yōu)選50至85pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線MR-proANP水平低于200pmol/L，優(yōu)選低于150pmol/L，更優(yōu)選低于100pmol/L，更優(yōu)選低于85pmol/L，最優(yōu)選低于50pmol/L時，患者被診斷為不患有CSH。
[0084] 更優(yōu)選，當所述測定的基線MR-proANP水平高于預定閾值水平時，患者被診斷為患有CSH。優(yōu)選，預定閾值水平為50至200pmol/L，更優(yōu)選85至200pmol/L，更優(yōu)選100至 200pmol/L，最優(yōu)選150至200pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線MR-proANP水平高于50pmol/L，優(yōu)選高于85pmol/L，更優(yōu)選高于100pmol/L，更優(yōu)選高于150pmol/L，最優(yōu) 選高于200pmol/L時，患者被診斷為不患有CSH。
[0085] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線CT-proET-Ι水平低于預定閾值水平時，患者被診斷為患有心動抑制反射。優(yōu)選，預定閾值水平為30至70pmol/L，更優(yōu)選30至60pmol/L，更優(yōu)選30至55pmol/L，最優(yōu)選30至45pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線CT-proET-Ι水平低于70pmol/L，優(yōu)選低于60pmol/L，更優(yōu)選低于55pmol/ L，更優(yōu)選低于45pmol/L，最優(yōu)選低于30pmol/L時，患者被診斷為患有心動抑制反射。
[0086] 更優(yōu)選，當所述測定的基線CT-proET-Ι水平高于預定閾值水平時，患者被診斷為未患有心動抑制反射。優(yōu)選，預定閾值水平為30至70pmol/L，更優(yōu)選45至70pmol/L，更優(yōu)選55至70pmol/L，最優(yōu)選60至70pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線 CT-proET-Ι水平高于30pmol/L，優(yōu)選高于45pmol/L，更優(yōu)選高于55pmol/L，更優(yōu)選高于 60pmol/L，最優(yōu)選高于70pmol/L時，患者被診斷為未患有心動抑制反射。
[0087] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線CT-proAVP水平低于預定閾值水平時，患者被診斷為患有初始性0H。優(yōu)選，預定閾值水平為2. 5至20pmol/L，更優(yōu)選 2. 5 至 10pmol/L，更優(yōu)選 2. 5 至 8pmol/L，更優(yōu)選 2. 5 至 6pmol/L，最優(yōu)選 2. 5 至 4pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線CT-proAVP水平低于20pmol/L，優(yōu)選低于10pmol/L，更優(yōu)選低于8pmol/L，更優(yōu)選低于6pmol/L，更優(yōu)選低于4pmol/L，最優(yōu)選低于2. 5pmol/L時，患者被診斷為未患有初始性0H。
[0088] 更優(yōu)選，當所述測定的基線CT-proAVP水平高于預定閾值水平時，患者被診斷為未患有初始性OH。優(yōu)選，預定閾值水平為2· 5至20pmol/L，更優(yōu)選4至20pmol/L，更優(yōu)選6 至20pmol/L，更優(yōu)選8至20pmol/L，最優(yōu)選10至20pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的CT-proAVP水平高于2. 5pmol/L，優(yōu)選高于4pmol/L，更優(yōu)選高于6pmol/L，更優(yōu)選高于 8pmol/L，更優(yōu)選高于10pmol/L，最優(yōu)選高于20pmol/L時，患者被診斷為未患有初始性0H。
[0089] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，當所述測定的基線MR-proANP水平低于預定閾值水平時，患者被診斷為患有血管迷走神經(jīng)性暈厥。優(yōu)選，預定閾值水平為50至 200pmol/L，更優(yōu)選 50 至 150pmol/L，更優(yōu)選 50 至 100pmol/L，更優(yōu)選 50 至 85pmol/L。在優(yōu) 選實施方案中，當所述測定的MR-proANP水平低于200pmol/L，優(yōu)選低于150pmol/L，更優(yōu)選低于l〇〇pmol/L，更優(yōu)選低于85pmol/L，最優(yōu)選低于50pmol/L時，患者被診斷為患有血管迷走神經(jīng)性暈厥。
[0090] 更優(yōu)選，當所述測定的基線MR-proANP水平高于預定閾值水平時，患者被診斷為未患有血管迷走神經(jīng)性暈厥。優(yōu)選，預定閾值水平為50至200pmol/L，更優(yōu)選85至 200pmol/L，更優(yōu)選100至200pmol/L，最優(yōu)選150至200pmol/L。在優(yōu)選實施方案中，當所述測定的MR-proANP水平高于50pmol/L，優(yōu)選高于85pmol/L，更優(yōu)選高于100pmol/L，更優(yōu) 選高于150pmol/L，最優(yōu)選高于250pmol/L時，患者被診斷為未患有血管迷走神經(jīng)性暈厥。
[0091] 上述截斷值在其它測定中可能不同，如果已根據(jù)本發(fā)明中使用的測定系統(tǒng)對這些截斷值不同地進行了校準的話。因此，考慮到校準的差異，上述截斷值可相應地用于這樣不同地校準的測定。校準中定量差異的一個可能是所述測定（例如，PCT測定）與本發(fā)明中使用的各自生物標志物測定（例如，BRAHMS KRYPT0R PCT測定）的比較分析（使相關聯(lián)）法（通過使用兩種方法測量樣品中各自生物標志物（例如，PCT))。另一個可能性是利用所述測定法測定（條件是該測試具有足夠的分析靈敏度）代表性正常群體的中位生物標志物水平，將結果與（例如在 PCT 的 EP 09011073. 5- "Procalcitonin for the prognosis of adverse events in the asymptomatic population" 中）所述的中位生物標志物水平相比較，并基于通過該比較獲得的差異重新計算校準。通過本發(fā)明中使用的校準，已測量來自正常（健康）受試者的樣品：中位（四分位距）血漿原降鈣素為0.018(0. 015 - 0.022) ng/ml (在男人中）和 0.014(0. 012-0. 017)ng/ml (在婦女中）(Abbasi 等人 2010. TCEM 95:E26~E31).中位（范圍）血漿 MR-proADM 為 0· 41 (0. 23-0. 64) nmol/L (Smith 等人 2009. Clin Chem 55:1593-1595)、中位(四分位距）肽素濃度為 4· 7 (2· 9 - 7· 5)pmol/L，濃度在男人（6· 2(4. 1 - 9. 5)pmol/L)中顯著高于在婦女（3· 6(2. 4 - 5. 5)pmol/l)中(Mei ier 等人 2010. Kidnev Int 77:29-36)，中位（四分位距）MR-proANP 濃度為 66 (51 _ 86) pmol/L (Melander 等人 2009. ΤΑΜΑ 302:49-57)，平均（范圍）血漿 CT-proET-1 濃度為 44. 3(10. 5 - 77. 4)pmol/L(Papassotiriou 等人 2006. Clin Chem 52:1144-1151)。
[0092] 用于檢測MR-proADM的自動夾心熒光測定使用針對包含人ADM原前體序列的氨基酸68至86(SEQ ID N0:5)的肽的綿羊多克隆抗體和針對包含人ADM原前體序列的氨基酸83至94(SEQ ID N0:5)的狀的綿羊多克降抗體（Caruhel等人2009. Clin Biochem42:725-8)。
[0093] 用于檢測CT-proET-1的自動夾心熒光測定使用針對包含人pr〇ET-l序列的氨基酸167至183(SEQ ID N0:18)的肽的小鼠單克隆抗體和針對包含人proET-Ι序列的氨基酸183至195 (SEQ ID NO : 18)的肽的綿羊多克降抗體（Caruhel等人2008. Clin Chem54:A119)。
[0094] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，可組合至少兩個生物標志物的水平。
[0095] 在本發(fā)明的一個實施方案中，例如在基線上（在立位耐力測試[例如HUT測試或主動站立測試]開始之前）和在這樣的測試的過程中或之后進行生物標志物的系列測量。換句話，測定在立位耐力測試開始前的基線上和所述測試的過程中或之后獲取的所述患者的體液的至少兩個樣品的至少一種生物標志物的水平。
[0096] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，可在數(shù)學算法中組合所述至少一個生物標志物的至少兩個水平。
[0097] 在其它優(yōu)選實施方案中，肽素從基線至站立的增加與心動抑制反射相關。
[0098] 在另一個優(yōu)選實施方案中，CT-proET-Ι從基線至站立的增加不包括直立性低血壓。
[0099] 在另一個優(yōu)選實施方案中，PCT從基線至站立的增加與POTS相關。
[0100] 在其它優(yōu)選實施方案中，將至少一個生物標志物的至少一個水平與一個或多個臨床參數(shù)組合，所述臨床參數(shù)選自年齡、性別、體質指數(shù)（BMI)、收縮血壓、舒張血壓、心率、腎小球濾過率（GFR)、總膽固醇、HDL-膽固醇、暈厥發(fā)作的次數(shù)和距離首次暈厥發(fā)作的時間。 [0101] 術語"組合"被定義為一定數(shù)目的參數(shù)的可能選擇以及使用數(shù)學算法（例如，偏差或比率）進行的這些參數(shù)至指定組的安排。例如，可計算在立位耐力測試過程中或之后采自患者的樣品的生物標志物的水平與在基線時（在立位耐力測試開始之前）采自患者的樣品的相同生物標志物的水平之間的比率。此外，可計算在立位耐力測試過程中或之后采自患者的樣品的生物標志物的水平與在基線時（在立位耐力測試開始之前）采自患者的樣品的相同生物標志物的水平之間的偏差。本文中還包括，可計算不同生物標志物之間的比率。例如，可計算在相同時間點（例如，在基線時[在立位耐力測試開始之前]采自患者的樣品的MR-proADM與CT-proET-Ι之間的比率）或在不同時間點（例如，在基線時采自患者的樣品的MR-proADM與在立位耐力測試過程中或之后采自患者的樣品的CT-proET-Ι之間的比率）從患者采集的樣品的測量的生物標志物水平之間的比率。
[0102] 在另一個優(yōu)選實施方案中，可將所述至少一個生物標志物的水平組合為連續(xù)或分類變量。
[0103] 在優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物MR-proADM和CT-proET-Ι的水平。
[0104] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物MR-proADM和MR-proANP的水平。
[0105] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物MR-proADM和肽素的水平。
[0106] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物CT-proET-Ι和MR-proANP的水平。
[0107] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物CT-proET-Ι和肽素的水平。
[0108] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物MR-proADM、CT-proET-Ι和MR-proANP 的水平。
[0109] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物MR-proADM、CT-proET-Ι和肽素的水平。
[0110] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物MR-proADM、MR-proANP和肽素的水平。
[0111] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物CT-proET-1、MR-proANP和肽素的水平。
[0112] 在另一個優(yōu)選實施方案中，組合生物標志物MR-proADM、CT-proET-1、MR-proANP 和肽素的水平。
[0113] 在本發(fā)明的說明書中，術語"分數(shù)"是指基于某些質量或狀況（例如，生物標志物的水平）在所述患者中存在所達到的特定成就或程度，數(shù)字表達的評級。
[0114] 在本發(fā)明的說明書中，術語"治療分層"是指所述患者的治療性治療的選擇和/或調整。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，就治療性治療對患者進行分層，例如就身體抗壓動作 (例如，腿或手臂的等長PCM，如腿交叉或手緊握和手臂繃緊）、傾斜訓練以及藥物治療（例如米多君，α-拮抗劑）和心臟起搏法對患者進行分層，包括：測定所述患者的體液樣品的至少一個選自proADM、proANP、proBNP、proAVP、proET-l和PCT或它們具至少12個氨基酸的片段的生物標志物的水平，和使所述水平與治療性治療相關聯(lián)。
[0115] 在特別優(yōu)選實施方案中，根據(jù)他們對心臟起搏器的需要對患者進行分層。最優(yōu)選地，根據(jù)他們對心臟起搏器的需要，通過測定至少CT-proET-Ι的水平來對患者進行分層，其中低于預定閾值水平的水平表示不需要心臟起搏器的患有直立性低血壓的患者，以及其中高于預定閾值水平的水平表示需要心臟起搏器的患有心動抑制反射的患者。
[0116] 利用心臟起搏器進行心臟起搏法，所述心臟起搏器是使用通過接觸心肌的電極傳遞來調節(jié)心臟的搏動的電脈沖的醫(yī)療器械。由于心臟的天然起搏器不足夠快，或由于心臟的電興奮傳導系統(tǒng)存在堵塞，因而起搏器的主要目的是維持足夠的心率。現(xiàn)代起搏器是可在外部通過程序控制的，并且允許心臟病學家選擇個體患者的最佳起搏模式?？蓵簳r或永久性地進行心臟起搏法。利用可編程起搏器的永久性起搏包括將一個或多個起搏電極經(jīng)靜脈放置于心臟的室內。存在3個根據(jù)牽涉的室的數(shù)目和它們的基本操作機制分類的基本類型的永久性起搏器：單室、雙室和頻率反應性起搏器。實施例
[0117] 研究裝置、檢查方案和診斷指標
[0118] 在 2008 年 9 月與 2011 年 4 月之間，在Malmd的Sk^ne University Hospital 的暈厥單元（地區(qū)三級醫(yī)療中心）調查總共255位具有病因學不明的懷疑暈厥發(fā)作的患者 (119個男人，平均年齡60±21賺錢，范圍15至93歲）。前101個患者直接在引入期中從急診科招募而來，如先前描述(Fedorowski等人2010. Europace 12:1322-1328)。當暈厥單元正式建立時，患者的招募通過從Malmd地區(qū)的初級保健醫(yī)生、急癥科和門診病人或醫(yī) 院門診部引薦來確定。通常地，在調查之前已進行了一組額外檢查，例如Holter-ECG、腦成像、起聲心動描記術和運動試驗-ECG或在一些情況下EEG。作為這些檢查是陰性或無確定結果的結果，患者被進一步移交至暈厥單元。具有確認心臟（即心律失?；蚪Y構性心臟和血管疾病）、神經(jīng)學、代謝、中毒和TL0C的其它明確病因學的臨床體征和測試結果的患者被先驗地排除，正如那些具有晚期癡呆和身體殘疾的患者一樣。研究參與者被要求定期服藥，并且在測試前禁食2小時，雖然允許他們隨意飲水。他們還被要求填寫問卷，所述問卷調查患者的醫(yī)療史，包括暈厥-相關癥狀的持續(xù)時間和頻率，以及目前的藥物治療。由于物流原因，在早晨（8至10a. m.)和下午（13至15p. m.)進行測試。
[0119] 檢查基于擴展的直立傾斜試驗（HUTT)方案，包括外周靜脈插管、15分鐘的仰臥靜息、血液取樣、根據(jù)新城疫苗方案的頸動脈竇按摩（CSM) (Parry等人2009. Heart 95:416-420)、頭朝上傾斜和3分鐘后重復的血液取樣以及根據(jù)Italian方案的可選的硝酸甘油激發(fā)(Bartoletti等人2000. Europace 2:339-342)、由Goldstein提議的堵鼻鼓氣法 (Goldstein and Sharabi 2009. Circulation 119:139-146)和最后根據(jù) Wieling 的主動站立測試（Wieling 等人 2007. Clin Sci (Lond) 112:157-165)。使用驗證的 Nexfin 監(jiān)護儀 (BMEYE，The Netherlands)連續(xù)跟蹤血壓（BP)和其它血液動力學參數(shù)以及ECG(Eeftinck 等人2009. Hvpertens 22:378-383)。如果在測試的特定部分過程中血液動力反應是診斷性的，盡管如此，我們仍然繼續(xù)進行至下一部分以調查診斷之間的可能重疊。如果結果是非診斷性的或非結論性的，則主要研究人員與可能對延長的ECG監(jiān)控和額外的心臟測試作決定的心律失常專家討論其它方法。
[0120] 當a)患者顯示典型的前驅癥狀（眩暈、輕度頭痛、暈厥前期）和/或再現(xiàn)的暈厥，和b)血液動力反應滿足血管迷走反射（神經(jīng)介導的）暈厥（VVS、匪S)、頸動脈竇過敏 (CSH)、體位直立性心動過速綜合征（POTS)和直立性低血壓（0H)的診斷標準(Mova等人 2009. Eur Heart T 30:2631-2671 :Parrv 等人 2009. Heart95:416-420)，則測試是診斷性的。簡而言之，VVS被定義為與明顯的低血液和/或心動過緩/心搏停止的特征模式相關的暈厥的再現(xiàn)，CSH被定義為大于等于50mm Hg的SBP的下降和/或大于3秒的心搏停止， 0H被定義為大于等于20mm Hg的收縮BP(SBP)的持續(xù)下降和/或大于等于10mm Hg的舒張 BP (DBP)的下降，或小于90mmHg的收縮BP (典型0H，在3min的傾斜期內；和延遲0H，在3至 20min之間），而POTS具有大于30/min的心率增加或在站立位時大于120/min的心運過速的直立耐受不能的特征癥狀。心動抑制性暈厥被定義為達到少于40bpm(超過10秒）的心室率的心率下降或大于3秒的心搏停止，然而血管減壓反射被定義為在暈厥時與其峰值相差小于等于10%的心率下降(Brignole等人2000. Europace2:66-76)。當在站立后15秒內瞬間BP下降大于40mmHg (對于SBP)和/或大于20mmHg (對于DBP)，伴隨腦低灌注的癥狀發(fā)生并且患者報告典型的暈厥情況(Wieling等人2007. Clin Sci (Lond)。112:157-165) 時，呈現(xiàn)初始性〇H。
[0121] 如果在傾斜期中直立性挑戰(zhàn)在常規(guī)0H標準（大于等于20mm Hg的持續(xù)SBP下降）方面是陽性的，但患者未再現(xiàn)癥狀或結果是不確定的，如果站立SBP>90mmHg的話，我們通常繼續(xù)進行硝酸甘油激發(fā)。如果患者發(fā)生低血壓和心動過速而無特征性血液動力血管迷走神經(jīng)模式和伴隨癥狀，則硝酸甘油激發(fā)不是診斷性的(Moya等人2009. Eur Heart 了 30:2631-2671)。為了確定診斷的準確性，隨后使用由Nexfin系統(tǒng)提供的NexfinO PC(BMEYE，The Netherlands)(被開發(fā)來顯現(xiàn)、重演和再分析測試測量（incl. ECG)的軟件工具）離線檢查數(shù)字測試記錄。
[0122] 生物標志物測量
[0123] 在開始測試之前以仰臥位體積15分鐘后收集血液樣品。從收集后于_80°C冷凍的血液樣品（塑料熱管中的16χ250μ 1的EDTA血漿等分）測量生物標志物。按照制造商的說明書使用下列測定法測量肽素（C末端精氨酸加壓素原；CT-proAVP)，精氨酸加壓素前體的穩(wěn)定膚(Fenske 等人 2009. .T Clin Endocrinol Me tab 94 :123 - 129)、C 末端內皮縮血管肽-1 前體片段（CT-proET-1) (Papassotiriou 等人 2006. Clin Chem 52:1144-1151)、心房鈉尿膚原中段（MR-proANP) (Morgenthaler 等人 2004. Clin Chem 50:234-236)、腎上腺髓質素原中段（MR-proADM) (Caruhel等人2008. Clin Chem 54 :A119)和原降鈣素 (Morgenthaler 等人 2002. Clin Chem 48 :788-790) ： Thermo Scientific B.R.A.H.M.S CT-proAVP LIA ；Thermo Scientific B · R · A · Η · M · S CT-proET-1 KRYPTOR ；Thermo Scientific B · R · A · Η · M · S MR-proANP KRYPTOR ;Thermo Scientific B · R · A · Η · M · S MR-proADM KRYPTOR ；Thermo Scientific B*R*A*H*M*S PCT sensitive LIA (BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Germany)〇
[0124] 統(tǒng)計分析
[0125] 我們使用邏輯回歸模型來評估特定診斷與分析的生物標志物之間的關系。我們進行多重變量調整后邏輯回歸分析（multivariate adjusted logistic regression analysis)，將VVS、CSH、OH、POTS、初始性OH、心動抑制和血管減壓反射作為應變量輸入，同時分別添加每一個生物標志物作為協(xié)變量。針對年齡、性別和BMI調整模型1，然而針對 SBP、DBP、心率和估計的GFR額外地調整更加綜合的模型2。在下一階段，同時在模型2中輸出與特定診斷顯著相關的生物標志物，我們進行協(xié)變量的后退消去法以鑒定特定暈厥診斷的獨立預測因素。隨后我們評估暈厥診斷在對應的顯著相關的生物標志物的血漿濃度的四分位數(shù)間的分布。我們應用邏輯回歸模型1和2,輸入四分位數(shù)（第一或第四），以特定診斷的最低頻率作為參照。CSH的分布限定于超過60歲的那些人，因為該狀態(tài)在更年輕的個體中極其罕見。未評估POTS的分布，因為僅有11個個體具有POTS診斷。使用IBM SPSS 統(tǒng)計軟件19. 0版（SPSS Inc.，Chicago, IL)進行所有計算。所有檢驗是雙側的，p〈0. 05被認為是統(tǒng)計上顯著的。
[0126] 結果
[0127] 如可在表1中看到的，包括的患者報告在8年的時間中發(fā)生平均7次暈厥發(fā)作。此外，10個患者中有4個報告他們因高血壓而被治療，最常見地利用β -阻斷劑、RAAS抑制劑和鈣離子通道阻斷劑進行治療。估量的生物標志物的靜息血漿濃度（Resting plasma concentrations)示于表2中。基于擴展HUTT的結果，總共142個（56% )患者被診斷為患有VVS，85個（33% )被診斷為患有0H，47個（18% )被診斷為患有CSH，11個（4% )被診斷為患有POTS。直立性低血壓在典型（η = 42)與延遲形式（η = 43)之間等同地分布。在30個患者（12% )中，未發(fā)現(xiàn)明確的暈厥病因學，但在它們的兩個中長期ECG監(jiān)控顯示暈厥過程中的緩慢心律失常，隨后用起搏器治療他們。診斷之間不存在重疊，因為0Η和POTS 頻繁地促成VVS (分別地在31和6個患者中），18個具有VVS的患者也滿足CSH標準。總共35個患者（13. 7% )在測試過程中具有心動抑制性暈厥；在這些患者中，29個歸因于血管迷走反射，6個歸因于頸動脈竇反射。平行地，32個患者（12.5% )在暈厥過程中顯示血管減壓模式。在179個具有表明初始性0H的歷史的患者中進行主動站立測試；在這些患者中，40個（22. 3% )滿足初始性直立性低血壓的診斷標準。
[0128] 不同暈厥診斷的單標志物值的盒須圖示于圖2至6中。
[0129] 在單標志物多重變量調整后模型中，VVS與更低的MR-proANP、MR-proADM、 CT-pr〇ET-l、CT-pr〇AVP和原降鈣素顯著相關，然而0H與更高的腎素和CT-proET-1顯著相關（表出。此外，CSH與更低的MR-proANP、MR-proADM和CT-proET-Ι相關，對于心動抑制反應亦如此。血管減壓反射與更低的原降鈣素和MR-proADM弱相關（p〈0. 10)。最后，POTS 與更低的原降鈣素顯著相關，初始性OH與更低的CT-proAVP相關（表$。在多重標志物調整后模型2中，在協(xié)變量的后退消去后，VVS與更低的MR-pr〇ANP(比值比[OR]/ -個標準差[SD] :0· 51，0· 34-0. 77 ;p = 0· 001)和 CT-proET-1 (OR :0· 38, 0· 23-0. 62 ;ρ〈0· 001)、更高的靜息38?((?/10臟?。?.17,95%的置信區(qū)間：1.03-1.32，？ = 0.015)以及更低的靜息心率（0R/10bpm :0· 76, (λ 61-0. 95, ρ = (λ 020)相關。平行地，更高的 CT-proET-1 和腎素 (分別地，OR/ 一個 SD :1. 94, 1. 27-2. 96 ;p = 0· 002,和 1. 34, 1. 01-1. 78 ;p = 0· 041)和增齡（0R/10 歲：L 23, L 04-L 42，p = 0· 015)預示著 0H。此外，CSH 與更低的 MR-proANP(OR/ 一個 SD :0· 40, 0· 24-0. 66 ;ρ〈0· 001)和增齡（0R/10 歲：2. 38, 1. 86-2. 92 ;ρ〈0· 001)相關，然而POTS與更低的原降鈣素（OR/-個SD :0.21,0. 06-080 ;p = 0.023)和年齡（0R/10 歲：0· 46, 0· 44-0. 63 ;ρ = 0· 001)、女性（OR :10· 0, 1. 1-90. 9 ;ρ = 0· 043)和更高的靜息心率（0R/10bpm :1· 94, 1. 0-2. 19 ;ρ = 0· 037)相關。初始性 0Η 與更低的 CT-proAVP(OR/ - 個 SD :0· 57, 0· 36-0. 89，p = 0· 013)、更高的靜息 DBP(0R/10mmHg :1· 11，1. 03-1. 18，p = 〇. 003)相關，并且相反地，與更低的靜息 SBP(0R/10mmHg :0. 68, 0. 56-0. 85 ;p = 0. 002)和估計的腎小球濾過率（eGFR) (0R/10ml/min :0.86,0. 78-0. 96 ;p = 0.012)相關。此外，更低的CT-proET-1預示著測試期間的心動抑制性暈厥（OR/ -個SD :0. 34, 0. 22-0. 53 ; ρ〈0· 001)，對于更低的靜息心率（0R/10bpm 減少：1. 45, 1. 04-1. 89 ;p = 0· 037)和男性（OR :2. 70, 1. 17-6. 32 ;p = 0. 021)亦如此。血管減壓反射與原降鈣素（OR/-個SD : 0· 59, 0· 35-1. 00 ;p = 0· 050)反相關。
[0130] 如圖7-12中所示，暈厥診斷與鑒定的預測生物標志物的四分位數(shù)之間的關系遵循兩個不同的模式：線性和閾值樣（threshold-like)模式。線性模式表征MR-proANP 與VVS(圖7)之間以及CT-proET-1與VVS(圖8)、0H(圖9)和心動抑制反射（圖11) 之間的關系，然而觀察到CT-proAVP與初始性0H之間的閾效應（圖12)。將MR-proANP 與CSH之間的關系（圖10)與線性和閾值樣效應組合。對于與血管迷走反射相關的 MR-proANP(〈51pmol/L)和CT-proET-1 (<46pmol/L)的最低四分位數(shù)，以及對于與初始性 0H相關的CT-pr〇AVP(〈3. lpmol/L)的最低四分位數(shù)觀察到最強的陽性預測值。平行地， CT-proET-Ι的最低四分位數(shù)預示0H為陰性，然而CT-proET-Ι的最高四分位數(shù)（>69pmol/ L)通常排除心動抑制反射。在完全調整后模型2中每一對暈厥診斷和對應生物標志物的四分位數(shù)的邏輯回歸分析的概述示于表4中。
[0131] 單個標志物和不同暈厥診斷的接收者操作特征曲線（R0C)的曲線下面積（AUC)概述于表5中。不同的截斷值用于測定每一個標志物的對應靈敏度和特異度，以診斷暈厥的各自形式(表6至12)。
[0132] 對于標志物組合，進行對數(shù)轉換的生物標志物值的邏輯回歸。用于的初始性0H 的診斷的 MR-proANP、MR-proADM、CT-proET-Ι 和肽素的組合表現(xiàn)好于（0R (λ 62[95% CI 0· 41 - 0· 91])單個標志物 MR_proANP(0R 0· 70[95 % Cl 0· 48 - 1· 00])、MR_proADM(0R 0· 72 [95 % Cl 0· 50 - 1· 02])、CT-proET-1 (OR 0· 70 [95 % Cl 0· 51-0. 98])或肽素（OR 0.65[95% Cl 0.44 - 0. 96]。此外，用于血管迷走神經(jīng)性暈厥的診斷的MR-proANP、 MR-proADM、CT-proET-1 和肽素的組合表現(xiàn)好于（OR 0· 29[95% CI 0· 20 - 0· 42])單個標志物11?-?1'(^即（(《0.38[95%(：1 0.28 - 0.52])、]\?-?1'(^01((?0.35[95%(：10.25-0· 49])、CT-proET-1 (0R 0· 36 [95 % CI 0· 24-0. 52])或肽素（0R0. 51 [95 % CI 0· 38 - 0·68])。
[0133] 對于系列測量，使用δ對數(shù)轉換的生物標志物值應用邏輯回歸。肽素從基線至站立的增加顯示了與心動抑制反射的強相關性（OR 1.48[95%CI 1.11-1.98])。 CT-proET-1從基線至站立的增加排除了直立性低血壓（OR 0.84[95% Cl 0.65 - 1.08])，然而PCT從基線至站立的增加與POTS顯著相關（OR 2. 42 [95% Cl 1. 04 - 5. 62])。
[0134] 此外，我們的結果顯示肽素從基線至站立的增加與自發(fā)VVS(非由硝酸甘油應用刺激的）密切相關（OR 2. 54[95% Cl 1. 47-4. 39])，然而MR-proANP從基線至站立的增加與自發(fā) VVS 反相關（0R 0· 79 [95 % CI 0· 57 - 1. 10])。
[0135] 表1 :研究參與者的臨床特征（N = 255)
[0136]

【權利要求】
1. 一種用于患者的暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層的方法，所述方法包括： -測定所述患者的體液樣品中至少一個生物標志物的水平，所述生物標志物選自 proET-1、proADM、proANP、proBNP、proAVP 和 PCT 或它們至少 12 個氨基酸的片段， -使至少一個生物標志物或其片段的所述水平與暈厥的診斷和/或預后和/或評估和 /或治療分層相關聯(lián)。
2. 權利要求1的方法，其中在立位耐力測試，優(yōu)選HUT測試或主動站立測試開始之前的基線時采集樣品。
3. 權利要求1和2的方法，其中在立位耐力測試，優(yōu)選HUT測試或主動站立測試過程中或之后采集所述患者的體液的至少一個樣品。
4. 權利要求1至3的方法，其中測試所述患者的至少兩個體液樣品中至少一個生物標志物或其片段的水平，所述樣品是在立位耐力測試，優(yōu)選HUT測試或主動站立測試開始之前的基線時和所述測試過程中或之后采集的。
5. 權利要求1至4的方法，其中在數(shù)學算法中組合至少一個生物標志物或其片段的水平。
6. 前述權利要求的任一項的方法，其中將至少一個生物標志物的至少一個水平與至少一個臨床參數(shù)組合，所述參數(shù)選自年齡、性別、體質指數(shù)（BMI)、收縮血壓、舒張血壓、心率、腎小球濾過率（GFR)、總膽固醇、HDL-膽固醇、年齡、性別、暈厥發(fā)作的次數(shù)和距離首次暈厥發(fā)作的時間。
7. 前述權利要求的任一項的方法，其中進行選自神經(jīng)介導性暈厥（匪S)、直立性低血壓和心源性暈厥的疾病的至少兩種的鑒別診斷。
8. 權利要求7的方法，其中所述匪S選自VVS、CSH、血管減壓反射、心動抑制反射和混合反射。
9. 權利要求7或8的方法，其中所述直立性低血壓選自初始性0H、典型0H、延遲（進行性）0H 和 POTS。
10. 權利要求7至9的任一項的方法，其中所述心源性暈厥選自因心律失常引起的心源性暈厥和因結構性疾病引起的心源性暈厥。
11. 前述權利要求的任一項的方法，其中所述樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊髓液樣品、唾液樣品和尿樣品或前述樣品任一種的提取物。
12. 前述權利要求的任一項的方法，其中測定選自MR-proADM、NT-proBNP、BNP、 MR-proANP、肽素、CT-proET-l、PCT 1-116、PCT 2-116 或 PCT 3-116 的前體片段的水平。
13. 前述權利要求的任一項的方法，其中當所述測定的基線CT-proET-1水平低于預定閾值水平時，所述患者被診斷為未患有直立性低血壓。
14. 前述權利要求的任一項的方法，其中當所述測定的基線MR-proANP水平高于預定閾值水平時，所述患者被診斷為未患有CSH。
15. 前述權利要求的任一項的方法，其中當所述測定的基線CT-proET-Ι水平高于預定閾值水平時，所述患者被診斷為未患有心動抑制反射。
16. 前述權利要求的任一項的方法，其中當所述測定的基線CT-proAVP水平高于預定閾值水平時，所述患者被診斷為未患有初始性0H。
17. 前述權利要求的任一項的方法，其中當所述測定的基線MR-proANP水平高于預定閾值水平時，所述患者被診斷為未患有血管迷走神經(jīng)性暈厥。
18. 前述權利要求的任一項的方法，其中使用針對包含人pr印roADM序列（SEQ ID NO: 5)的氨基酸68至86的肽的第一抗體和針對包含人preproADM序列（SEQ ID N0:5)的氨基酸83至94的肽的第二抗體，通過夾心免疫測定法來檢測MR-proADM。
19. 前述權利要求的任一項的方法，其中使用針對包含人pr〇ET-l序列（SEQ ID NO: 18)的氨基酸167至183的肽的第一抗體和針對包含人proET-1序列（SEQ ID NO :18)的氨基酸183至195的肽的第二抗體，通過夾心免疫測定法來檢測CT-proET-1。
20. 前述權利要求的任一項的方法，其中就治療性治療，優(yōu)選身體抗壓動作，特別優(yōu) 選腿或手臂的等長PCM，如腿交叉或手緊握和手臂繃緊，和傾斜訓練以及藥物治療，優(yōu)選 α -拮抗劑例如米多君的施用，和心臟起搏法對患者進行分層。
21. 權利要求20的方法，其中通過測定CT-proET-Ι的水平根據(jù)他們對心臟起搏器的需要來對患者進行分層，其中低于預定閾值水平的水平表示不需要心臟起搏器的患有直立性低血壓的患者，以及其中高于預定閾值水平的水平表示需要心臟起搏器的患有心動抑制反射的患者。
22. 選擇自 proADM、proANP、proBNP、proAVP、proET-Ι 和 PCT 或其至少 12 個氨基酸的片段的一個或多個生物標志物的用途，其用于暈厥的診斷和/或預后和/或評估和/或治療分層。
【文檔編號】G01N33/68GK104115012SQ201380009967
【公開日】2014年10月22日申請日期:2013年4月12日優(yōu)先權日:2012年4月26日
【發(fā)明者】J·施特魯克, O·梅蘭德, A·費多羅夫斯基申請人:B.R.A.H.M.S有限公司

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