一種診斷宮頸癌的miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種診斷宮頸癌的miRNA標(biāo)志物 及其應(yīng)用，具體為一種與宮頸癌輔助早期診斷及預(yù)后評(píng)估相關(guān)的miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性健康和生命。2011年， Lancet刊出的宮頸癌最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：從1980年到2010年，全球?qū)m頸癌發(fā)病率平均W每 年0.6%的增幅遞增，僅2010年一年中，發(fā)展中國家因?qū)m頸癌死亡的女性總數(shù)就達(dá)到200， 000之多，死亡年齡也更趨于年輕化。宮頸癌流行病學(xué)研究結(jié)果所掲示的嚴(yán)峻現(xiàn)實(shí)，使得進(jìn) 一步尋找敏感特異的宮頸癌臨床診斷及預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物成為迫切需要，是實(shí)現(xiàn)宮頸 癌的早期診斷、早期干預(yù)及時(shí)合理治療的關(guān)鍵，是亟待解決的重大科學(xué)問題，對宮頸癌的早 期診斷及有效防治具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0003] MicroRNAs(即miRNAs)是近年來分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，它的成熟狀態(tài) 是一類長約19-23個(gè)核巧酸的小單鏈RNA分子，進(jìn)化上具有高度保守性。miRNA的主要功能是 調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機(jī)體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)。自從參與調(diào)控線蟲 時(shí)序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)W來，miRNA分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志 年度十大科技突破。2005年預(yù)測miRNAs至少能調(diào)控5300個(gè)人類基因，即所有基因的30%。 隨著研究的深入，越來越多的miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)。聚光燈下的miRNA已經(jīng)逐步擺脫了 DNA光 芒的掩蓋，從"配麻'變成"主麻'，并且對DNA的中屯、地位提出了新的挑戰(zhàn)。近年來，miRNA與 疾病的關(guān)系已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA通過負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)與腫瘤，糖 尿病等多種人類疾病的發(fā)病高度相關(guān)。
[0004] 研究已經(jīng)證實(shí)血清/組織中存在幾百種的miRNAs,運(yùn)些小分子RNAs性質(zhì)穩(wěn)定、含量 豐富、易于定量檢測，且存在顯著的疾病特異性?，F(xiàn)有的成熟的技術(shù)，包括定性和定量miRNA 分子的技術(shù)，表明利用miRNAs作為分子生物標(biāo)志物的方法比傳統(tǒng)的特異蛋白分子標(biāo)記方法 將更加有效，為生物標(biāo)志物開拓了新境界。
[000引miR-320是近年發(fā)現(xiàn)的一類與腫瘤發(fā)病相關(guān)的miRNA。學(xué)者們對其功能逐漸有了深 入的認(rèn)識(shí):miR-320不但可W抑制正常細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)變，而且可W抑制腫瘤細(xì)胞增殖； 在腫瘤組織如乳腺癌中可W觀察到miR-320表達(dá)明顯下調(diào)，miR-320表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤 血管生成和癌細(xì)胞侵襲。運(yùn)些研究結(jié)果均提示miR-320可能具有腫瘤抑制效應(yīng)。本課題組對 宮頸癌組織miR-320表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織miR-320表達(dá)呈明顯下調(diào)。
[0006] 然而，目前miR-320作為較為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物用于宮頸癌輔助早期診斷價(jià)值尚 未見相關(guān)報(bào)道，若能篩選miRNAs作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的輔助早期診斷試劑盒，對我 國宮頸癌的診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動(dòng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種與宮頸癌輔助早期診斷及預(yù)后評(píng) 估相關(guān)的miRNA標(biāo)志物及其引物，該標(biāo)志物及其引物可用于制備宮頸癌輔助早期診斷試劑 盒，為宮頸癌的篩查和早期診斷提供數(shù)據(jù)支持，為宮頸癌的干預(yù)提供數(shù)據(jù)支持。
[0008] 本發(fā)明具體通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 發(fā)明人通過分離和研究宮頸癌病例和健康對照組織中的miR-320,尋找與宮頸癌 發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)的高特異性和敏感性的miRNAs標(biāo)志物，并研制出可便于臨床應(yīng)用的宮頸 癌輔助早期診斷試劑盒。具體為：
[0010] -種診斷宮頸癌的miRNA標(biāo)志物，所述的miRNA標(biāo)志物為miR-320。
[0011] 所述的miRNA標(biāo)志物miR-320的引物為沈Q ID No.1和沈Q ID No.2。
[0012] 本發(fā)明提供了所述miRNA標(biāo)志物miR-320在制備宮頸癌輔助早期診斷試劑盒中的 應(yīng)用。
[0013] 所述miRNA標(biāo)志物miR-320的引物在制備宮頸癌輔助早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種宮頸癌輔助早期診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測宮頸組織中 的miR-320。
[0015] 所述的診斷試劑盒含有標(biāo)志物miR-320的引物:SEQ ID No. 1和沈Q ID No.2。
[0016] 所述診斷試劑盒還可W包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液， dNTPs，MgCl2,肥PC水和化q酶等;還可W含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0017] 本發(fā)明的有益效果為：
[0018]本發(fā)明提供的微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)標(biāo)志物作為宮頸癌早期診斷的 標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：
[0019] DmiRNAs是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于 檢測，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類小分子RNA生物標(biāo)志物的 成功開發(fā)將為宮頸癌的早期診斷開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。
[0020] 2)miRNAs試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷和監(jiān)測試劑盒，可用于宮頸癌的早期診 斷，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確預(yù)測宮頸癌結(jié)局、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持。
[0021] 本發(fā)明通過控制年齡等對疾病發(fā)展的影響因素，研究miRNA在宮頸癌早期診斷的 應(yīng)用前景，闡述異常表達(dá)的miR-320對于宮頸癌進(jìn)展的影響，掲示其篩查和早期診斷價(jià)值。 因此，本發(fā)明獲得了宮頸癌發(fā)病特異性miR-320標(biāo)志物;通過miRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑 盒的研制和應(yīng)用，可使得宮頸癌的早期診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者 病情，為臨床治療效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物祀標(biāo) 提供幫助。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例2宮頸癌病例組和對照組的miR-320表達(dá)的柱形圖；Normal: 正常對照組;T皿or:宮頸癌組。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，W下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述掲示 的技術(shù)內(nèi)容加 W變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對w下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0024] 本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：（1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫：W標(biāo)準(zhǔn)操 作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的組織樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。（2)宮頸 組織miR-320差異表達(dá)分析:選擇宮頸癌病例、與宮頸癌病例年齡匹配的子宮肌瘤女性為對 照，檢測病例及對照宮頸組織中miR-320表達(dá)量，分析宮頸癌病例和對照間宮頸組織miR-320的表達(dá)差異，進(jìn)一步分析miR-320在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。（3)miR-320篩查和輔助 早期診斷試劑盒的研制:根據(jù)宮頸癌病例和對照的組織miR-320開發(fā)miR-320診斷試劑盒。
[0025] 本發(fā)明人W標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的宮頸組織樣本，系統(tǒng)收集完整的 人口學(xué)資料、臨床資料等(運(yùn)些資料可用于判斷疾病進(jìn)展，患者年齡等因素對于發(fā)病的影 響），并采用了Real-time PCR方法等。
[0026] 具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括W下幾個(gè)部分：
[0027] 1.研究樣本的選擇
[0028] (1)取宮頸癌患者手術(shù)切除或放療前活檢標(biāo)本，避開壞死和炎癥區(qū)域，所有標(biāo)本 3〇min內(nèi)置液氮保存?zhèn)溆谩Ｋ袠?biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。收集并記錄所有患者的臨床和病理 資料(年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病理分級(jí)、HPV感染等）；
[0029] (2)正常對照為同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)，術(shù)后宮頸組織病理檢查報(bào)告為 正常宮頸上皮者，無其他疾病。收集正常宮頸組織方法同上。
[0030] S.Trizol試劑（Invit;rogen,(^i;rlsbad,CA)和miRNeasy Mini Kit(QIAGEN公司）提 取組織總RNA，按常規(guī)方法操作。
[0031 ] 3.Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法
[0032] (1)取受試者的組織總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；
[0033] (2)設(shè)計(jì)引物；
[0034] (3)加入巧光探針或染料進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0035] (4)檢測并比較宮頸癌病例與健康對照組織樣本中miR-320表達(dá)量的變化。
[0036] 4.診斷試劑盒制備方法
[0037] 通過qRT-PCR技術(shù)檢測miR-320在宮頸癌病例和健康對照中表達(dá)量和差異程度，分 析miR-320與宮頸癌臨床病理特征相關(guān)性，并將其作為宮頸癌早期診斷及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。 最后將miR-320組成診斷試劑盒。診斷試劑盒