包括miR-320的引物，探針，W及化q酶、dNTP等 試劑。
[003引5.統(tǒng)計分析方法
[0039] 運用X2檢驗（用于分類變量)或者student t檢驗（用于連續(xù)性變量）比較人口學(xué)特 征，宮頸癌病理分級、臨床分期、淋己結(jié)轉(zhuǎn)移等和miR-320表達水平在研究對象組間分布的 差異。
[0040] 研究對象中miR-320的不同表達水平表示，其中Act = CT樣本-CT內(nèi)參，我 們WU6作為參照，計算相對表達量。
[0041] 統(tǒng)計學(xué)分析均通過?？诘慕y(tǒng)計學(xué)分析軟件完成（SAS，v.9.1.3)。統(tǒng)計學(xué)顯著性水 平P值設(shè)為0.05，所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗。
[0042] 實施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0043] 發(fā)明人于2010年開始至今從無錫市婦幼保健院收集了宮頸癌患者及正常對照宮 頸組織（用于研究的樣本為同期收取，采樣、分裝、保存條件均一），所有患者均經(jīng)病理檢查 確診且不合并其他炎癥性疾病及免疫相關(guān)性疾病，正常對照均為同期因子宮肌瘤行全子宮 切除術(shù)，術(shù)后宮頸組織病理檢查報告為正常宮頸上皮者，無其他疾病。并系統(tǒng)采集了運些樣 本的人口學(xué)資料、臨床資料等情況。本研究共采用75例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進行研究。
[0044] 實施例2組織中miR-320檢測
[004引將上述符合條件的45例宮頸癌病例和30例健康對照經(jīng)PCR檢測獲得相關(guān)結(jié)果。具 體步驟為：
[0046] 1、分別取"宮頸癌病例"組和"健康對腮'組患者的組織，加入3倍體積的Trizol試 劑，超聲勻漿儀粉碎組織；
[0047] 2、相分離：室溫放置15min，然后加入等體積的氯仿，震蕩50s，室溫15min，14, 000巧 m,4°C，離屯、15min;
[0048] 3、RNA沉淀:將水相轉(zhuǎn)移到新的15ml的離屯、管，加入1.5倍水相體積的無水乙醇，充 分混勻；
[0049] 4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA:每次吸取700ul樣本至離屯、柱中，14,000rpm 離屯、15s，棄去收集管中濾液，重復(fù)至樣本均過柱;加入700ul洗液1，14，OOOrpm離屯、15s，棄 收集管中濾液;加入500ul洗液2，14，000巧m離屯、15s，棄收集管中濾液;再加入500ul洗液2， 14,0(K)rpm離屯、2min，棄收集管中濾液;將離屯、柱放回空的收集管中，14,0(Κ)巧m離屯、2minW 干燥離屯、管；將離屯、管放入新的1.5ml管中，加入50ul無核酸酶水，10，00化pm離屯、Imin;將 管中的液體倒回離屯、柱中，14，000巧m離屯、Imin，棄離屯、柱；
[0050] 5、測量濃度:經(jīng)1 %甲醒變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并應(yīng)用Bio-Rad檢測 RNA濃度及純度，選用電泳條帶清晰(28S，18S，5S)，A260/A280為1.8-2.0者用于后續(xù)實驗； [0051 ] 6、應(yīng)用microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems USA)進行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系 為20ul，包括：10XRT buffer 1.5ul、100mmol/L dNTPs 0.1 加 l、50U/ul MultiScribe? Reverse Transcriptasel .0ul、20U/ul RNA酶抑制劑0.19ul、lumol/L逆轉(zhuǎn)錄特異性引物 3ul、RNA 模板 lul、DEPC 水補足 20ul。反應(yīng)條件：16°C，30min; 42°C，30min; 85°C，5sec;產(chǎn)物-20°C凍存?zhèn)溆?。miR-320逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5 ' -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTT GAG TCGCCCTC-3'。
[0052] 7、Taqman real-Time PCR:應(yīng)用microRNA Real-Time RCR試劑盒（Applied Biosystems USA)進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為20ul，包括：TaqMan GEx MASTER Mix lOul、RT產(chǎn)物lul、re al time特異性引物lul、雙蒸水補足20ul。反應(yīng)條件:95°C，lOmin; 95 °C15sec、60°Clmin，共40個循環(huán)。miR-320特異性PCR引物序列：正向：5'-ACACTCCAGCTGGG AAAAGCTGGGTT GAGA-3'，反向：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3dU6 引物序列：正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 '，反向 5 ' -AACG CTTCACGAATTTGCGT-3 '。
[0053] 8、數(shù)據(jù)分析與處理:miR-320表達水平的計算方法:在目的基因與內(nèi)參照基因擴增 效率相同的情況下，WU6為內(nèi)參照，測定循環(huán)闊值(Ct值），計算Act值，ACt = miR-320Ct 值一U6Ct值，表示miR-320的相對表達水平。
[0054] 在上述45例符合條件的宮頸癌病例及30例健康對照中，我們應(yīng)用PCR方法對宮頸 癌組織和正常宮頸組織中miR-320的表達水平進行了檢測，結(jié)果如表1所示，宮頸癌組織中 miR-320的表達水平顯著低于正常宮頸組織（0.67±0.31vs 1.02±0.23)，miR-320在"宮頸 癌病例"組和"健康對照"組中的表達情況存在顯著性差異(P = 〇.002)具體結(jié)果見附圖1。
[0055] 為了進一步評估m(xù)iR-320在宮頸癌臨床診斷及預(yù)后評估中的應(yīng)用，我們將miR-320 表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征進行了相關(guān)分析，結(jié)果如表1，表明FIG0分期I-II宮 頸癌患者11111?-320表達水平顯著低于。160分期111-1￥的患者（46.67%￥3 86.67%，口 = 0.012)。我們還發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者miR-320的表達水平與淋己結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P = 0.006)。
[0056] 表1 :miR-320及Mcl-l表達與宮頸癌臨床病理特征的相關(guān)性
[0057]
[0058] 根據(jù)上述結(jié)果，我們將運個與宮頸癌發(fā)病相關(guān)的miR-320在另外15例宮頸癌病例 和與其年齡等匹配的15例對照進行進一步驗證。我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織低表達miR-320與宮 頸癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)，結(jié)果一致。
[0059] 實施例3于宮頸癌輔助早期診斷的miR-320試劑盒的制作
[0060] miR-320試劑盒的制作和操作流程是基于RT-PCR和real-time P CR等技術(shù)。試劑 盒包括miR-320引物(miR-320的引物為沈Q ID N 0.1和SEQ ID齡.2)，還可^有相應(yīng)口0?反 應(yīng)所需的常用酶和/或試劑，如：逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCb，去核酸酶水，巧光探針、 等，可根據(jù)具體采用的實驗方法選用，運些常用酶和/或試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另 外還可W有標(biāo)準(zhǔn)品和對照(如定量標(biāo)化的線蟲miR-39樣本等)及正常參考值。
[0061]此試劑盒的價值在于只需微量組織樣品，通過最精簡的巧光探針法檢測miR-320 的變化趨勢，再通過該趨勢輔助早期診斷宮頸癌，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且定量精確，大大提 高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可W幫助指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確做出診 斷。
【主權(quán)項】
1. 一種診斷宮頸癌的miRNA標(biāo)志物，其特征在于:所述的miRNA標(biāo)志物為miR-320。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種診斷宮頸癌的miRNA標(biāo)志物，其特征在于:所述的miRNA標(biāo) 志物miR-320的引物為SEQ ID No. 1 和SEQ ID No.2。3. 權(quán)利要求1所述miRNA標(biāo)志物miR-320在制備宮頸癌輔助早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求2所述miRNA標(biāo)志物miR-320的引物在制備宮頸癌輔助早期診斷試劑盒中的 應(yīng)用。5. -種宮頸癌輔助早期診斷試劑盒，其特征在于：該試劑盒用于檢測組織中的miR-320。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種宮頸癌輔助早期診斷試劑盒，其特征在于:所述的診斷試 劑盒含有標(biāo)志物miR-320的引物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種宮頸癌輔助早期診斷試劑盒，其特征在于:所述的標(biāo)志物 miR-320的引物為SEQ ID No. 1 和SEQ ID No.2。8. 根據(jù)權(quán)利要求5~7中任一項所述的一種宮頸癌輔助早期診斷試劑盒，其特征在于： 所述診斷試劑盒包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種診斷宮頸癌的miRNA標(biāo)志物，屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，所述的miRNA標(biāo)志物為miR-320，其引物為SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2。該標(biāo)志物及其引物可用于可用于制備宮頸癌輔助早期診斷試劑盒，用于宮頸癌的早期輔助診斷及預(yù)后評估。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105506076
【申請?zhí)枴緾N201510934751
【發(fā)明人】張婷, 陳道楨, 鄒萍, 陳鈺, 蔣潔
【申請人】無錫市婦幼保健院
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月15日