一種血小板標(biāo)記物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血小板標(biāo)記物，它是連接有血小板特異性抗體和熒光分子的2～6G?PAMAM。本發(fā)明還提供了前述血小板標(biāo)記物的制備方法。本發(fā)明血小板標(biāo)記物制備方法簡(jiǎn)單，可有效地標(biāo)記血小板，應(yīng)用前景良好。
【專利說明】一種血小板標(biāo)記物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種血小板標(biāo)記物及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]血小板是體內(nèi)血栓形成的關(guān)鍵成分之一，在心血管疾病(增殖、血栓形成和血栓栓塞)、炎癥和部分腫瘤等多種病理生理進(jìn)程中扮演重要角色。
[0003]然而，長(zhǎng)期以來一直缺乏血小板的標(biāo)記物，導(dǎo)致臨床上難以直接有效檢測(cè)血小板的聚集部位和聚集程度，使得血栓類疾病的研究停滯不前，因此，急需尋找一種血小板的標(biāo)記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種血小板標(biāo)記物及其制備方法。
[0005]本發(fā)明血小板標(biāo)記物，它是連接有血小板特異性抗體和熒光分子的2?6GPAMAM0
[0006]PAMAM:聚酰胺-胺型樹枝狀高分子，是一種高度枝化的球狀單分散大分子，其分子結(jié)構(gòu)中心由中心核、重復(fù)單元以及末端基團(tuán)構(gòu)成，具有高度的幾何對(duì)稱性，其中心核為乙二胺結(jié)構(gòu)，以中心核為起始中心，由丙烯酸甲酯等原料在外面接枝，每完成反應(yīng)增長(zhǎng)一代(Generation,簡(jiǎn)稱G),每增長(zhǎng)一代末端氨基數(shù)目增長(zhǎng)一倍，2?6G PAMAM表不第二代?第六代聚酰胺-胺型樹枝狀高分子。
[0007]本發(fā)明制備前述血小板標(biāo)記物的方法，具體步驟為:將2?6G PAMAM和血小板特異性抗體連接，再用熒光分子標(biāo)記，即得連接了血小板特異性抗體和熒光分子的2?6GPAMAM0
[0008]所述2?6GPAMAM是由下述方法制備的:取PAMAM，溶于甲醇中，加入甲醇鈉，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐滴加入丙烯酸甲酯，攪拌60?80h，蒸去甲醇和過量的丙烯酸甲酯，得到黃色油狀液體，即為2?6G PAMAM ;其中，甲醇的用量為PAMAM的40?60倍(v/w)，甲醇鈉用量為PAMAM的0.06?0.08倍(v/w);丙烯酸甲酯的總用量為PAMAM的2?2.3倍(v/w)。
[0009]優(yōu)選地，所述甲醇的用量為PAMAM的50倍(v/w)，甲醇鈉用量為PAMAM的0.07倍(v/w);丙烯酸甲酯的總用量為PAMAM的2.14倍(v/w)。
[0010]所述的血小板特異性抗體為抗⑶41抗體。優(yōu)選地，所述的抗⑶41抗體為抗⑶41
單克隆抗體。
[0011]2?6G PAMAM與血小板特異性抗體連接的方法為:取2?6G PAMAM,在室溫下，力口Λ(4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)、血小板特異性抗體，反應(yīng)1.5?2.5小時(shí)，去除剩余試劑，再加入N-乙基順丁烯二酰亞胺，反應(yīng)0.5?1.5h，超過濾凈化，即可；其中，2?6G PAMAM、(4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)、血小板特異性抗體、N-乙基順丁烯二酰亞胺與的用量比(v/w/w/w)為(30 ?50): (0.18 ?0.20): (0.003 ?0.005): (0.18 ?0.20)。[0012]優(yōu)選地，所述2?6G PAMAM、4-(N_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)與血小板特異性抗體的反應(yīng)時(shí)間是2小時(shí)，加入N-乙基順丁烯二酰亞胺后的反應(yīng)時(shí)間是Ih;所述2?6G PAMAM、(4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)、血小板特異性抗體、N-乙基順丁烯二酰亞胺與的用量比(v/w/w/w)為40:0.192:0.004:0.192。
[0013]所述突光分子是波長(zhǎng)為680nm的近紅外光染料。
[0014]所述熒光分子標(biāo)記的方法為:在2?6G PAMAM和血小板特異性抗體連接產(chǎn)物中，加入0.0005?0.0015倍重量(w/v)的熒光分子，暗光孵化0.5?1.5h，即可。優(yōu)選地，所述熒光分子的用量為2?6G PAMAM和血小板特異性抗體連接產(chǎn)物的0.001倍(w/v);所述暗光孵化時(shí)間為Ih。
[0015]本發(fā)明血小板標(biāo)記物的標(biāo)記效果優(yōu)良，可直接有效地鑒定血小板的聚集部位和聚集程度，進(jìn)而檢測(cè)臨床血栓類疾病，同時(shí)，標(biāo)記物的制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。
[0016]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0017]以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0018]說明書附圖
[0019]圖1熒光顯微鏡顯示標(biāo)記的血小板，紅色為本發(fā)明標(biāo)記物標(biāo)記的血小板
【具體實(shí)施方式】
[0020]名詞解釋:
[0021]sulfo-SMCC:(4_ (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)；N-ethylmaleimide:N-乙基順丁烯二酰亞胺
[0022]PAMAM:聚酰胺-胺型樹枝狀高分子
[0023]實(shí)驗(yàn)材料:
[0024]PAMAM、甲醇、甲醇鈉、丙烯酸甲酯、sulfo-SMCC、抗CD41單克隆抗體、N-ethylmaleimide、波長(zhǎng)為680nm的近紅外光染料均為市售品。
[0025]實(shí)施例1本發(fā)明血小板標(biāo)記物的制備
[0026](I) 2G ?6G PAMAM 的合成:
[0027]取1.4g PAMAM溶于70ml甲醇，加入IOOul甲醇鈉，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐滴加入3ml丙烯酸甲酯。攪拌72小時(shí)，蒸去甲醇和過量的丙烯酸甲酯，得到黃色油狀液體，即為2G?6GPAMAM0
[0028](2) 2G?6G PAMAM與抗⑶41單克隆抗體的結(jié)合:
[0029]取步驟(I)制得的2G ?6G PAMAM40ul，在室溫下，加入 sulfo_SMCC40ul (4.8mg/mL)、抗⑶41單克隆抗體20ul (200 μ g/ml),反應(yīng)2小時(shí)，剩余試劑通過凝膠過濾去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul (4.8mg/mL),反應(yīng)lh,得到反應(yīng)混合物；超過濾(MWC0100, 000)凈化，PBS洗滌后，即得連接了抗⑶41單克隆抗體的2G?6G PAMAM。[0030](3)取步驟(2)得到的連接了抗⑶41單克隆抗體的2?6GPAMAM20 μ L，加入20 μ I與波長(zhǎng)為680nm的近紅外光染料(50 μ g/ml, Invitrogen),暗光孵化I小時(shí)，即得本發(fā)明血小板標(biāo)記物。
[0031]實(shí)施例2本發(fā)明血小板標(biāo)記物的制備
[0032](I) 2G ?6G PAMAM 的合成:
[0033]取1.4g PAMAM溶于56ml甲醇，加入84ul甲醇鈉，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐滴加入2.8ml丙烯酸甲酯。攪拌60小時(shí)，蒸去甲醇和過量的丙烯酸甲酯，得到黃色油狀液體，即為2G?6G PAMAM0
[0034](2) 2G?6G PAMAM與抗⑶41單克隆抗體的結(jié)合:
[0035]取步驟(I)制得的2G ?6G PAMAM:30ul，在室溫下，加入 sulfo_SMCC40ul (4.5mg/mL)、抗CD41單克隆抗體20ul (150 μ g/ml)，反應(yīng)1.5小時(shí),剩余試劑通過凝膠過濾去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul (5.0mg/mL),反應(yīng)0.5h,得到反應(yīng)混合物；超過濾(MWC0100, 000)凈化，PBS洗滌后，即得連接了抗⑶41單克隆抗體的2G?6G PAMAM。
[0036](3)取步驟(2)得到的連接了抗⑶41單克隆抗體的2G?6G PAMAM20yL，加入20 μ I與波長(zhǎng)為680nm的近紅外光染料(25 μ g/ml, Invitrogen)，暗光孵化0.5小時(shí)，即得本發(fā)明血小板標(biāo)記物。
[0037]實(shí)施例3本發(fā)明血小板標(biāo)記物的制備
[0038](I) 2G ?6G PAMAM 的合成:
[0039]取1.4g PAMAM溶于84ml甲醇，加入112ul甲醇鈉，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐滴加入3.22ml丙烯酸甲酯。攪拌60小時(shí)，蒸去甲醇和過量的丙烯酸甲酯，得到黃色油狀液體，即為2G?6G PAMAM0
[0040](2) 2G?6G PAMAM與抗⑶41單克隆抗體的結(jié)合:
[0041]取步驟(I)制得的2G ?6G ΡΑΜΑΜδΟιιΙ，在室溫下，加入 sulfo_SMCC40ul (5.0mg/mL)、抗CD41單克隆抗體20ul (250 μ g/ml)，反應(yīng)2.5小時(shí)，剩余試劑通過凝膠過濾去除；在2h以后，加入N-ethylmaleimide40ul (5.0mg/mL),反應(yīng)2h,得到反應(yīng)混合物；超過濾(MWC0100, 000)凈化，PBS洗滌后，即得連接了抗⑶41單克隆抗體的2G?6G PAMAM。
[0042](3)取步驟(2)得到的連接了抗⑶41單克隆抗體的2G?6G PAMAM20yL，加入20 μ I與波長(zhǎng)為680nm的近紅外光染料(75 μ g/ml, Invitrogen)，暗光孵化1.5小時(shí)，即得本發(fā)明血小板標(biāo)記物。
[0043]以下根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)來說明本發(fā)明的有益效果:
[0044]實(shí)驗(yàn)例I本發(fā)明管腔內(nèi)激活的血小板標(biāo)記物對(duì)小鼠血小板的標(biāo)記
[0045]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0046]1.1小鼠血小板的分離
[0047]取小鼠靜脈血，置于抗凝離心管中，靜置30min后離心，800rpm李欣lOmin，上清液極為富含血小板的血漿。吸出上清液，置于干凈試管中，3500rpm離心lOmin，棄去上清液，管底沉淀物為血小板，向試管中滴加50?100 μ I質(zhì)量濃度為1%草酸銨溶液，以玻璃棒輕輕攪拌，再加入質(zhì)量濃度為1%草酸銨溶液2?3ml，靜置5min，使紅細(xì)胞溶解。3500rpm離心IOmin,棄去傷情,加入血小板洗漆液(130mM NaCl, 6mM葡萄糖,9mM NaHCO3, IOmM朽1檬酸鈉，IOmM Tris，3mM氯化鉀，0.8mM磷酸二氫鉀，0.9mM MgCl)并反復(fù)吹打，是成為血小板混懸液，3300rpm離心lOmin，棄去上清，加入少量血小板洗滌液并反復(fù)吹打使之成為混懸液。
[0048]將上述混懸液，用3.7%多聚甲醛固定在載玻片上，固定時(shí)間為30min。
[0049]1.2小鼠血小板的標(biāo)記
[0050]取經(jīng)多聚甲醛固定的血小板，在含lmg/ml BSA的PBS溶液中孵育30mins，PBS連續(xù)洗滌3次，在黑暗加入含20 μ I實(shí)施例1制備的本發(fā)明血小板標(biāo)記物，孵化I小時(shí)。
[0051]1.3標(biāo)記結(jié)果的觀察
[0052]使用Leica DM750熒光倒置顯微鏡觀察，所有圖象在256X256像素和200毫秒的曝光時(shí)間條件下獲得。圖象使用Image J.軟件分析。
[0053]2、結(jié)果
[0054]如圖1所示，熒光倒置顯微鏡觀察標(biāo)記后的小鼠血小板呈紅色，說明血小板被本發(fā)明血小板標(biāo)記物標(biāo)記。
[0055]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明血小板標(biāo)記物可以有效標(biāo)記血小板。
[0056]綜上，本發(fā)明制備得到了能夠有效標(biāo)記血小板的標(biāo)記物，可直接有效地鑒定血小板的聚集部位和聚集程度，進(jìn)而檢測(cè)臨床血栓類疾病，同時(shí)，標(biāo)記物的制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉。
【權(quán)利要求】
1.一種血小板標(biāo)記物，其特征在于:它是連接有血小板特異性抗體和熒光分子的2~6G PAMAM0
2.一種制備權(quán)利要求1所述血小板標(biāo)記物的方法，其特征在于:其步驟如下:將2~6GPAMAM和血小板特異性抗體連接，再用熒光分子標(biāo)記，即得連接了血小板特異性抗體和熒光分子的2~6G PAMAM。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述2~6GPAMAM由下述方法制備: 將PAMAM溶于甲醇中，加入甲醇鈉，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐滴加入丙烯酸甲酯，攪拌60~80h，蒸去甲醇和過量的丙烯酸甲酯，得到黃色油狀液體，即為2~6G PAMAM ； 其中，甲醇的用量為PAMAM的40~60倍(v/w)，甲醇鈉用量為PAMAM的0.06~0.08倍(v/w);丙烯酸甲酯的總用量為PAMAM的2~2.3倍(v/w)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述甲醇的用量為PAMAM的50倍(v/w)，甲醇鈉的用量為PAMAM的0.07倍(v/w);丙烯酸甲酯的總用量為PAMAM的2.14倍(v/w)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述的血小板特異性抗體為抗CD41抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述抗CD41抗體為抗CD41單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述 的方法，其特征在于:所述2~6GPAMAM與血小板特異性抗體連接的方法為: 取2~6G ?4獻(xiàn)11，加入(4-0-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)、血小板特異性抗體，反應(yīng)1.5~2.5小時(shí)，去除剩余試劑，再加入N-乙基順丁烯二酰亞胺，反應(yīng)0.5~1.5h，超過濾凈化，即可； 其中，2~6G PAMAM、(4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)、血小板特異性抗體、N-乙基順丁烯二酰亞胺與的用量比(v/w/w/w)為(30~50):(0.18 ~0.20): (0.003 ~0.005): (0.18 ~0.20)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 所述2~6G PAMAM、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)與血小板特異性抗體的反應(yīng)時(shí)間是2小時(shí)，加入N-乙基順丁烯二酰亞胺后的反應(yīng)時(shí)間是Ih ； 所述2~6G PAMAM、(4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷_1_羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽)、血小板特異性抗體、N-乙基順丁烯二酰亞胺與的用量比(v/w/w/w)為40:0.192:0.004:0.192。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述熒光分子是波長(zhǎng)680nm的近紅外光染料。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述熒光分子標(biāo)記的方法為:在2~6GPAMAM和血小板特異性抗體連接產(chǎn)物中，加入0.0005~0.0015倍重量(w/v)的熒光分子，暗光孵化0.5~1.5h，即可； 優(yōu)選地，所述熒光分子的用量為2~6G PAMAM和血小板特異性抗體連接產(chǎn)物的0.001倍(w/V);所述暗光孵化時(shí)間為lh。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103675288SQ201310731775
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】吳劍波, 羅茂, 李蓉 申請(qǐng)人:瀘州醫(yī)學(xué)院