一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，制備包括以下步驟：（1）取銀雜化的NH2-MCM-48溶于磷酸鹽緩沖溶液中，超聲分散均勻，再加入前列腺特異抗原二抗，4°C震蕩，離心后除去上清液，得到二抗標(biāo)記物Ag@NH2-MCM-48/Ab2；（2）以玻碳電極為工作電極，先用氨基化石墨烯—二茂鐵甲醛復(fù)合材料水溶液修飾玻碳電極表面，后修飾上戊二醛，再用前列腺特異抗原一抗溶液進(jìn)行修飾，再滴涂牛血清白蛋白溶液后，繼續(xù)修飾前列腺特異抗原，最后修飾Ag@NH2-MCM-48/Ab2后，即得前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器。本發(fā)明制備的傳感器應(yīng)用于前列腺特異抗原的測定，靈敏度高，特異性好。
【專利說明】一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于新型納米功能材料和生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤(tumor)是人體組織細(xì)胞由于內(nèi)在和外界致病因素長時間的作用，導(dǎo)致細(xì)胞的遺傳物質(zhì)一脫氧核糖核酸(DNA)產(chǎn)生突變，使細(xì)胞的生長和分裂失去控制，從而發(fā)生異常增生和功能失調(diào)。腫瘤嚴(yán)重威脅人民健康，是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中備受重視的重大研究課題。
[0003]腫瘤標(biāo)志物(tumor marker)是指腫瘤組織及細(xì)胞所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的異常表達(dá)，腫瘤標(biāo)志物在正常組織或良性疾病不產(chǎn)生或產(chǎn)量甚微，而腫瘤病人的組織、體液及排泄物中則有大量分泌，測得值異常升高。腫瘤標(biāo)志物在腫瘤普查、診斷、治療、病情監(jiān)測、判斷愈后、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有很大的實用價值。
[0004]前列腺癌列男性惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，2102年我國腫瘤登記地區(qū)前列腺癌發(fā)病率為9.92/10萬，嚴(yán)重影響了廣大男性的健康，引起了社會各界和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。
[0005]前列腺特異抗原(PSA)是由前列腺腺泡和導(dǎo)管的上皮細(xì)胞分泌的一種單鏈糖蛋白，在功能上屬于類激肽釋放酶的一種絲氨酸蛋白酶，是臨床常規(guī)用于前列腺良性與惡性疾病診斷與鑒別診斷及前列腺癌患者術(shù)后隨訪的重要指標(biāo)，對臨床及病情監(jiān)測有重要參考價值。
[0006]腫瘤標(biāo)志物的檢測方法有許多。其中，具有推廣應(yīng)用價值或已被廣泛應(yīng)用的主要有:放射免疫分析法(RIA)、酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)(EIA)、免疫放射分析法(IRMA)、免疫化學(xué)發(fā)光分析(CLIA)、時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TrFLA)、液體芯片檢測技術(shù)和SELD1-TOF-MS等。但這些技術(shù)一般需要復(fù)雜的監(jiān)測儀器，檢測時間長，普及性差，且有些試劑具有放射性，對人體有一定的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種能克服上述缺陷、高靈敏的、特異性好和相對簡單的一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。其技術(shù)方案為:
[0008]一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0009](I) 二抗標(biāo)記物 Ag_H2-MCM-48/Ab2 的制備，取 0.5 ?1.5mg 銀雜化的 NH2_MCM_48介孔材料溶于lmL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，超聲I?3h使其分散均勻，再加入I?3mL、10?20 μ g/mL的前列腺特異抗原二抗，4° C震蕩12?24h，離心后除去上清液，得到二抗標(biāo)記物 Ag_H2-MCM-48/Ab2 ；
[0010](2)免疫傳感器的制備，以玻碳電極為工作電極，先用氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料水溶液修飾玻碳電極表面，后修飾上戊二醛，再用前列腺特異抗原一抗溶液進(jìn)行修飾，再滴涂牛血清白蛋白溶液后，繼續(xù)修飾前列腺特異抗原，最后修飾Ag_H2-MCM-48/Ab2后，即得前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器。[0011]所述的一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，步驟(2)中氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料的制備步驟如下:
[0012]I)室溫下,將100?150mg氧化石墨烯分散在40?60mL乙二醇中，超聲分散均勻，攪拌下滴加濃氨水1.0?1.5mL，得到黑棕色溶液，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓釜，150?180° C反應(yīng)6?10h，冷卻后離心，去掉上清液，用超純水洗滌3次后，再在65° C干燥箱內(nèi)干燥，得到氨基化石墨烯；
[0013]2)將0.8?1.2mg氨基化石墨烯和1.0?1.5mg 二茂鐵甲醒分散于lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%?1.0%的羧甲基殼聚糖溶液中，震蕩12h?24h，即得氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料。
[0014]所述的一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，步驟(I)中銀雜化的NH2-MCM-48介孔材料的制備步驟如下:
[0015]I)將1.0?1.5g正娃酸四乙酯加入錐形瓶中，加超純水62?95mL攪拌IOmin后，加入氫氧化鉀0.5?1.0g,再一次性加入十六燒三甲基溴化銨0.65?1.5g,攪拌30?40min后轉(zhuǎn)入高壓釜，120° C水熱晶化62?72h，所得白色粉末依次用超純水和乙醇分別徹底清洗后，室溫干燥，然后在馬弗爐中以1° C/min的速度程序升溫至550° C，保溫6?8h,即得到 MCM-48 ；
[0016]2)取1.0g MCM-48和lmL3_氨丙基三乙氧基娃燒溶于80?90mL無水甲苯中，70° C回流1.5?2h，離心后于110° C干燥I?2h，得到粉末狀的NH2_MCM_48 ；
[0017]3)在錐形瓶加入48mL超純水，在攪拌下加入ImL濃度為50mmol/L硝酸銀溶液和ImL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5?8%的檸檬酸鈉溶液，再加入5?IOmg硼氫化鈉固體持續(xù)攪拌lOmin，
直至顏色不再變化。
[0018]4)將20mg NH2-MCM_48加入到上述溶液中，離心，除去上清液，再在35° C真空干燥，制得銀雜化的NH2-MCM-48介孔材料。
[0019]所述的一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于前列腺特異抗原的檢測。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點在于:
[0021]I)本發(fā)明首次將銀雜化的NH2-MCM_48用于電化學(xué)免疫傳感器的制備，結(jié)合氨基化石墨烯、二茂鐵甲醛等，可顯著提高電化學(xué)信號，從而提高了本發(fā)明傳感器的靈敏度。
[0022]2)本發(fā)明傳感器的制備過程中，通過滴涂法將氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛、前列腺特異抗原一抗和Ag@NH2-MCM-48/Ab2修飾在玻碳電極表面，使制備的免疫傳感器在后續(xù)的檢測使用時，克服了現(xiàn)有檢測方法中存在的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣及普及性差等缺點，操作簡便。
【具體實施方式】
[0023]現(xiàn)將本發(fā)明通過【具體實施方式】進(jìn)一步說明，但不限于此。
[0024]實施例1，采用以下步驟:
[0025]步驟I銀雜化的NH2-MCM_48介孔材料的制備，具體采用以下工序:1)將1.0g正娃酸四乙酯加入錐形瓶中，加超純水62mL,攪拌IOmin后,加入0.5g氫氧化鉀,再一次性加入十六烷三甲基溴化銨0.65g，攪拌30min后轉(zhuǎn)入高壓釜，120° C水熱晶化62h，所得白色粉末依次用超純水和乙醇分別徹底清洗后，室溫干燥，然后在馬弗爐中以1° c/min的速度程序升溫至550° C，保溫6h，即得到MCM-48 ；2)取1.0g MCM-48和lmL3_氨丙基三乙氧基硅烷溶于80mL無水甲苯中，70° C回流1.5h，離心后于110° C干燥lh，得到粉末狀的NH2-MCM-48 ；3)在錐形瓶加入48mL超純水，在攪拌下加入ImL濃度為50mmol/L硝酸銀溶液和ImL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的檸檬酸鈉溶液，再加入5mg硼氫化鈉固體持續(xù)攪拌lOmin，直至顏色不再變化；4)將20mg NH2-MCM-48加入到上述溶液中，離心，除去上清液，再在35° C真空干燥，制得銀雜化的NH2-MCM-48介孔材料。
[0026]步驟2 二抗標(biāo)記物Ag_H2-MCM-48/Ab2的制備:取0.5mg銀雜化的NH2_MCM_48介孔材料溶于lmL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，超聲Ih使其分散均勻，再加入lmL、10 μ g/mL的前列腺特異抗原二抗，4° C震蕩12h，離心后除去上清液，得到二抗標(biāo)記物Ag@NH2-MCM-48/Ab2 ；
[0027]步驟3氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料的制備，具體采用以下工序:1)20° C，將IOOmg氧化石墨烯分散在40mL乙二醇中，超聲分散均勻，攪拌下滴加濃氨水1.0mL，得到黑棕色溶液，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓釜，150° C反應(yīng)10h，冷卻后離心，去掉上清液，用超純水洗滌3次后，再在65° C干燥箱內(nèi)干燥，得到氨基化石墨烯；2)將0.8mg氨基化石墨烯和1.0mg二茂鐵甲醛分散于lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的羧甲基殼聚糖溶液中，震蕩12h，即得氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛溶液。
[0028]步驟4傳感器的制備，具體采用以下工序:1)玻碳電極的處理，將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m和0.05 μ m的三氧化二招拋光粉分別拋光處理后,用乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6V電位下掃描，使峰電位差小于IOOmV ；2)先將6μ L已制得的氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛溶液修飾于玻碳電極表面，20° C干燥；3)再將3 μ L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛滴涂到工序2)修飾的玻碳電極表面，20° C干燥；4)將6μ L、濃度為10 μ g/mL的前列腺特異抗原一抗滴涂到工序3)修飾的電極表面，放于4° C冰箱中，晾干；5)用超純水清洗掉未結(jié)合的前列腺特異抗原一抗后，4° C晾干，將3μ L濃度為100 μ g/mL的牛血清白蛋白滴涂到工序4)修飾的玻碳電極表面，放于4° C冰箱中，晾干；6)用超純水清洗掉未結(jié)合的牛血清白蛋白，放于4° C冰箱中，晾干，將前列腺特異抗原滴涂在工序5)修飾的玻碳電極表面，20° C孵化Ih后，用超純水清洗掉沒有特異性結(jié)合的前列腺特異抗原，放于4° C冰箱中，晾干；7)將二抗標(biāo)記物Ag@NH2-MCM-48/Ab2滴涂在工序6)修飾的玻碳電極表面，20° C孵化lh，用超純水徹底清洗后，放于4° C冰箱中晾干，即得前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，放于4° C冰箱中保存使用。
[0029]實施例2，采用以下步驟:
[0030]步驟I銀雜化的NH2-MCM_48介孔材料的制備，具體采用以下工序:I)將1.2g正硅酸四乙酯加入錐形瓶中，加超純水80mL，攪拌IOmin后，加入1.0g氫氧化鉀，再一次性加入十六烷三甲基溴化銨1.0g，攪拌35min后轉(zhuǎn)入高壓釜，120° C水熱晶化67h，所得白色粉末依次用超純水和乙醇分別徹底清洗后，室溫干燥，然后在馬弗爐中以1° C/min的速度程序升溫至550° C，保溫7h，即得到MCM-48 ;2)取1.0g MCM-48和lmL3_氨丙基三乙氧基硅烷溶于85mL無水甲苯中，70° C回流2h，離心后于110° C干燥1.5h，得到粉末狀的NH2-化MCM-48 ；3)在錐形瓶加入48mL超純水，在攪拌下加入ImL濃度為50mmol/L硝酸銀溶液和ImL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5%的檸檬酸鈉溶液，再加入7.5mg硼氫化鈉固體持續(xù)攪拌lOmin，直至顏色不再變化；4)將20mg NH2-MCM-48加入到上述溶液中，離心，除去上清液，再在35° C真空干燥，制得銀雜化的NH2-MCM-48介孔材料。
[0031 ] 步驟2 二抗標(biāo)記物Ag_H2-MCM-48/Ab2的制備:取1.0mg銀雜化的NH2_MCM_48介孔材料溶于lmL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，超聲2h使其分散均勻，再加入lmL、15 μ g/mL的前列腺特異抗原二抗，4° C震蕩18h，離心后除去上清液，得到二抗標(biāo)記物Ag@NH2-MCM-48/Ab2 ；
[0032]步驟3氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料的制備，具體采用以下工序:1)20° C，將125mg氧化石墨烯分散在50mL乙二醇中，超聲分散均勻，攪拌下滴加濃氨水1.0mL，得到黑棕色溶液，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓釜，170° C反應(yīng)8h，冷卻后離心，去掉上清液，用超純水洗滌3次后，再在65° C干燥箱內(nèi)干燥，得到氨基化石墨烯；2)將1.0mg氨基化石墨烯和1.0mg 二茂鐵甲醛分散于lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的羧甲基殼聚糖溶液中，震蕩18h，即得氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛溶液。
[0033]步驟4傳感器的制備，具體技術(shù)內(nèi)容同實施例1中的步驟4。
[0034]實施例3，采用以下步驟:
[0035]步驟I銀雜化的NH2-MCM_48介孔材料的制備，具體采用以下工序:I)將1.5g正硅酸四乙酯加入錐形瓶中，加超純水95mL，攪拌IOmin后，加入1.0g氫氧化鉀，再一次性加入十六烷三甲基溴化銨1.5g，攪拌40min后轉(zhuǎn)入高壓釜，120° C水熱晶化72h，所得白色粉末依次用超純水和乙醇分別徹底清洗后，室溫干燥，然后在馬弗爐中以1° C/min的速度程序升溫至550° C，保溫8h，即得到MCM-48 ;2)取1.0g MCM-48和lmL3_氨丙基三乙氧基硅烷溶于90mL無水甲苯中，70° C回流2h，離心后于110° C干燥2h，得到粉末狀的NH2_MCM_48 ；
3)在錐形瓶加入48mL超純水，在攪拌下加入ImL濃度為50mmol/L硝酸銀溶液和ImL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的檸檬酸鈉溶液，再加入IOmg硼氫化鈉固體持續(xù)攪拌lOmin，直至顏色不再變化；
4)將20mgNH2-MCM-48加入到上述溶液中，離心，除去上清液，再在35° C真空干燥，制得銀雜化的NH2-MCM-48介孔材料。
[0036]步驟2 二抗標(biāo)記物Ag_H2-MCM-48/Ab2的制備:取1.5mg銀雜化的NH2_MCM_48介孔材料溶于lmL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，超聲3h使其分散均勻，再加入lmL、20 μ g/mL的前列腺特異抗原二抗，4° C震蕩24h，離心后除去上清液，得到二抗標(biāo)記物Ag@NH2-MCM-48/Ab2 ；
[0037]步驟3氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料的制備，具體采用以下工序:1)20° C，將150mg氧化石墨烯分散在60mL乙二醇中，超聲分散均勻，攪拌下滴加濃氨水
1.5mL，得到黑棕色溶液，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓釜，180° C反應(yīng)6h，冷卻后離心，去掉上清液，用超純水洗滌3次后，再在65° C干燥箱內(nèi)干燥，得到氨基化石墨烯；2)將1.2mg氨基化石墨烯和1.5mg 二茂鐵甲醛分散于lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的羧甲基殼聚糖溶液中，震蕩24h，即得氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛溶液。
[0038]步驟4傳感器的制備，具體技術(shù)內(nèi)容同實施例1中的步驟4。
[0039]實施例4:實施例1?3制備的傳感器在前列腺特異抗原檢測中的應(yīng)用，具體步驟如下:
[0040](I)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為濃度為0.067mol/LpH7.4的磷酸鹽緩沖溶液；
[0041](2)工作電極修飾:將實施例1~3制備的傳感器作為工作電極，將步驟(1)中配制的不同濃度的前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到工作電極表面，4° C冰箱中保存；
[0042](3)工作曲線繪制:將飽和甘汞電極作為參比電極，鉬絲電極作為輔助電極，與步驟(2)所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接電化學(xué)工作站，采用時間-電流方法，記錄電流變化；根據(jù)所得電流差值Λ I與前列腺特異抗原的濃度呈線性關(guān)系，繪制Λ I — C工作曲線；
[0043](4)前列腺特異抗原的檢測:用待測樣品代替步驟(1)中的前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟(2)和步驟(3)中的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值A(chǔ)l和工作曲線，得到待測樣品中前列腺腫瘤標(biāo)志物即前列腺特異抗原的含量。
[0044]測定結(jié)果如表1所示:
[0045]表1人血清中前列腺特異抗原的測定
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)二抗標(biāo)記物Ag_H2-MCM-48/Ab2的制備，取0.5?1.5mg銀雜化的NH2_MCM_48介孔材料溶于lmL、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，超聲I?3h使其分散均勻，再加入I?3mL、10?20μ g/mL的前列腺特異抗原二抗，4° C震蕩12?24h，離心后除去上清液，得到二抗標(biāo)記物 Ag_H2-MCM-48/Ab2 ； (2)免疫傳感器的制備，以玻碳電極為工作電極，先用氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料水溶液修飾玻碳電極表面，后修飾上戊二醛，再用前列腺特異抗原一抗溶液進(jìn)行修飾，再滴涂牛血清白蛋白溶液后，繼續(xù)修飾前列腺特異抗原，最后修飾Ag@NH2-MCM-48/Ab2后，即得前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(2)中氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料的制備步驟如下: 1)室溫下，將100?150mg氧化石墨烯分散在40?60mL乙二醇中，超聲分散均勻,攪拌下滴加濃氨水1.0?1.5mL，得到黑棕色溶液，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓釜，150?180° C反應(yīng)6?10h，冷卻后離心，去掉上清液，用超純水洗滌3次后，再在65° C干燥箱內(nèi)干燥，得到氣基化石墨稀； 2)將0.8?L2mg氨基化石墨烯和1.0?L 5mg 二茂鐵甲醛分散于lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%?1.0%的羧甲基殼聚糖溶液中，震蕩12h?24h，即得氨基化石墨烯一二茂鐵甲醛復(fù)合材料。
3.如權(quán)利要求1所述的一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于:步驟(I)中銀雜化的NH2-MCM-48介孔材料的制備步驟如下: 1)將1.0?1.5g正娃酸四乙酯加入錐形瓶中，加超純水62?95mL攪拌IOmin后,力口入氫氧化鉀0.5?1.0g,再一次性加入十六燒三甲基溴化銨0.65?1.5g,攪拌30?40min后轉(zhuǎn)入高壓釜，120° C水熱晶化62?72h，所得白色粉末依次用超純水和乙醇分別徹底清洗后，室溫干燥，然后在馬弗爐中以1° C/min的速度程序升溫至550° C，保溫6?8h，SP得到 MCM-48 ； 2)取1.0g MCM-48和lmL3-氨丙基三乙氧基硅烷溶于80?90mL無水甲苯中，70° C回流1.5?2h，離心后于110° C干燥I?2h，得到粉末狀的NH2-MCM-48 ； 3)在錐形瓶加入48mL超純水，在攪拌下加入ImL濃度為50mmol/L硝酸銀溶液和ImL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5?8%的檸檬酸鈉溶液，再加入5?IOmg硼氫化鈉固體持續(xù)攪拌lOmin，直至顏色不再變化。 4)將20mgNH2-MCM-48加入到上述溶液中，離心，除去上清液，再在35° C真空干燥，制得銀雜化的NH2-MCM-48介孔材料。
4.如權(quán)利要求1所述的一種前列腺腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于前列腺特異抗原的檢測。
【文檔編號】G01N33/531GK103675279SQ201310713154
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李月云, 韓健, 魏琴, 董云會, 任祥, 陳潤海 申請人:山東理工大學(xué)