一種熒光藥物分子復(fù)合納米粒子、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光藥物分子復(fù)合納米粒子、其制備方法和應(yīng)用。所述復(fù)合納米粒子包括自聚發(fā)光分子通過(guò)環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵與熒光藥物分子連接形成的熒光藥物分子復(fù)合物。本發(fā)明的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子中環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵隨環(huán)境條件的改變而被打開(kāi)，自聚發(fā)光分子與熒光藥物分子分離，分別產(chǎn)生發(fā)熒光現(xiàn)象，通過(guò)熒光現(xiàn)象的變化對(duì)藥物在空間上的釋放過(guò)程進(jìn)行熒光可視化監(jiān)測(cè)。因此，本發(fā)明的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子作為具有熒光自定位功能的藥物遞送系統(tǒng)，能夠示蹤藥物載體和藥物在生物體內(nèi)的真正位置。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種熒光藥物分子復(fù)合納米粒子、其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物劑型【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種熒光藥物分子復(fù)合納米粒子、其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]納米材料因其形貌大小可控、易于修飾、多功能化和高載藥量等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于分子診療、腫瘤成像和藥物遞送等前沿領(lǐng)域。尤其在藥物遞送方面，各種各樣的納米材料被用于載運(yùn)藥物達(dá)到靶向性地治療各種疾病的目的。這些納米材料包括無(wú)機(jī)納米粒子，如金納米粒、氧化娃納米粒和碳納米材料等，以及有機(jī)納米材料，如膠束、脂質(zhì)體和樹(shù)狀分子等。揭示這些納米材料在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)單元上的行為對(duì)于設(shè)計(jì)新型的納米藥物遞送系統(tǒng)有著重要的意義。然而，大多數(shù)藥物遞送系統(tǒng)不具有可示蹤性，其進(jìn)入細(xì)胞后，很難確定其在細(xì)胞內(nèi)的真正位置。
[0003]目前，最常用的示蹤方法是對(duì)這些遞送系統(tǒng)進(jìn)行熒光標(biāo)記，然而熒光標(biāo)記的方法有許多不足:(1)當(dāng)藥物遞送系統(tǒng)被熒光分子化學(xué)標(biāo)記后，其物理化學(xué)性質(zhì)有可能發(fā)生改變；(2)這些被熒光分子標(biāo)記后的藥物遞送系統(tǒng)有可能具有與原來(lái)遞送系統(tǒng)不同的細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制；(3)被標(biāo)記的熒光分子有可能在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境中被水解下來(lái)而“遺落”在生物體內(nèi)的其它位置，而不代表藥物遞送系統(tǒng)存在的真正位置。因此，本領(lǐng)域需要發(fā)展一種具有熒光自定位功能的藥 物遞送系統(tǒng)，示蹤其在生物體內(nèi)的真正位置。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明提供一種熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，其作為藥物遞送系統(tǒng)，通過(guò)載體與藥物分子之間的熒光變化對(duì)藥物在空間上的釋放過(guò)程進(jìn)行熒光可視化監(jiān)測(cè)，克服了目前熒光標(biāo)記的藥物遞送系統(tǒng)的缺陷。
[0005]本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0006]在第一方面，本發(fā)明提供一種熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，包括自聚發(fā)光分子通過(guò)環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵與熒光藥物分子連接形成的熒光藥物分子復(fù)合物。
[0007]優(yōu)選地，所述熒光藥物分子復(fù)合納米粒子是自聚發(fā)光分子通過(guò)環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵與熒光藥物分子連接形成的熒光藥物分子復(fù)合物自組裝形成的。
[0008]優(yōu)選地，所述自聚發(fā)光分子帶有活性官能團(tuán)。
[0009]優(yōu)選地，所述活性官能團(tuán)選自氨基、羧基、羥基、巰基和疊氮。
[0010]優(yōu)選地，所述自聚發(fā)光分子選自四苯基乙烯和硅雜環(huán)戊二烯。
[0011]優(yōu)選地，所述環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵選自酶敏感的脂鍵，pH敏感的腙鍵、脲鍵和希夫堿，氧化還原敏感的二硫鍵和葡萄糖敏感的硼酸鍵。
[0012]優(yōu)選地，所述熒光藥物分子選自阿霉素、姜黃素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星。
[0013]本發(fā)明中，熒光藥物分子復(fù)合納米粒子可以作為藥物遞送系統(tǒng)，因此本文中二者的含義相同，可以替換。[0014] 自聚發(fā)光分子是2001年唐本忠教授等報(bào)道的一種在聚集狀態(tài)下誘導(dǎo)發(fā)光的分子，因此自聚發(fā)光分子又稱(chēng)為聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-1nduced emission, AIE)分子，是指在分離情況下不發(fā)光，而在聚集狀態(tài)下誘導(dǎo)發(fā)出熒光現(xiàn)象的分子。本發(fā)明的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子中，自聚發(fā)光分子通過(guò)環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵與熒光藥物分子連接形成熒光藥物分子復(fù)合物，自聚發(fā)光分子通過(guò)熒光能量共振轉(zhuǎn)移將能量轉(zhuǎn)給熒光藥物分子，熒光藥物分子通過(guò)聚集誘導(dǎo)淬滅機(jī)制發(fā)生熒光淬滅，因此熒光藥物分子復(fù)合納米粒子沒(méi)有明顯的發(fā)熒光現(xiàn)象。當(dāng)熒光藥物分子復(fù)合納米粒子的環(huán)境條件(比如PH環(huán)境、氧化還原環(huán)境或酶環(huán)境等)改變時(shí)，環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵被打開(kāi)，自聚發(fā)光分子與熒光藥物分子分離，然后自聚發(fā)光分子發(fā)生聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象，熒光藥物分子的熒光淬滅機(jī)制消失，發(fā)出熒光。通過(guò)上述熒光現(xiàn)象的變化對(duì)藥物在空間上的釋放過(guò)程進(jìn)行熒光可視化監(jiān)測(cè)。
[0015]在第二方面，本發(fā)明提供一種制備如第一方面所述的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子的方法，包括:
[0016](I)使自聚發(fā)光分子與熒光藥物分子接觸，形成環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵，得到熒光藥物分子復(fù)合物；
[0017](2)將所述熒光藥物分子復(fù)合物溶于可與水互溶的有機(jī)溶劑配成懸浮液，然后將所述懸浮液在超聲條件下滴加到水中，制得所述熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0018]目前已經(jīng)有很多類(lèi)型的自聚發(fā)光分子報(bào)道，比如中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào) CN102153748A、 CN102279270A、 CN102250015A、 CN102313726A、 CN 102702096A、CN103194213A.CN103194215A和CN102219723A均公開(kāi)了相應(yīng)的自聚發(fā)光分子，理論上說(shuō)這些類(lèi)型的自聚發(fā)光分子，只要能夠與熒光藥物分子形成環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵連接，就能應(yīng)用于本發(fā)明。雖然如此，本發(fā)明特別優(yōu)選的自聚發(fā)光分子是帶有氨基、羧基、羥基、巰基或疊氮等活性官能團(tuán)的自聚發(fā)光分子，以便與熒光藥物分子形成環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵連接。本發(fā)明中，自聚發(fā)光分子最優(yōu)選四苯基乙烯(Tetraphenylethylene,TPE)和娃雜環(huán)戍二烯。其中，硅雜環(huán)戊二烯即噻咯(silole)。
[0019]本發(fā)明中，環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵是指其穩(wěn)定性隨環(huán)境條件改變的化學(xué)鍵，具體可以是酶敏感的脂鍵，PH敏感的腙鍵、脲鍵和希夫堿，氧化還原敏感的二硫鍵和葡萄糖敏感的硼酸鍵。
[0020]本發(fā)明中，所述熒光藥物分子沒(méi)有特別限定，任何能夠發(fā)熒光并能與自聚發(fā)光分子通過(guò)環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵連接并產(chǎn)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移的藥物分子均可用于本發(fā)明，優(yōu)選阿霉素、姜黃素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星等。
[0021]本發(fā)明中，有機(jī)溶劑是可與水互溶的有機(jī)溶劑，任何這類(lèi)有機(jī)溶劑均可用于本發(fā)明，優(yōu)選二甲基亞諷(Dimethyl sulfoxide, DMS0)、四氫呋喃(Tetrahydrofuran, THF)>N，N- 二甲基甲酸胺(N，N-Dimethylformamide, DMF)和甲醇(Methanol)等。具體實(shí)施中，可以?xún)H用一種有機(jī)溶劑，也可以使用兩種以上上述有機(jī)溶劑的混合物。
[0022]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案，所述方法包括:
[0023](I)將自聚發(fā)光分子溶于有機(jī)溶劑中，配成濃度為0.001-0.05M的溶液，按有機(jī)溶劑的10_4至10_3體積加入酸進(jìn)行催化，然后按自聚發(fā)光分子摩爾量的1-3倍加入熒光藥物分子，50-70°C攪拌加熱反應(yīng)12-48小時(shí)，得到熒光藥物分子復(fù)合物；
[0024](2)將所述熒光藥物分子復(fù)合物溶于可與水互溶的有機(jī)溶劑中，配成濃度為10-500mM的懸乳液，在超聲條件下，按懸乳液與水的體積比為10_4至10_2的比例滴加到水中，制得熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0025]其中，步驟(1)中的有機(jī)溶劑可以是甲醇、二甲基亞砜、四氫呋喃和N，N-二甲基甲酰胺等；酸可以是三氟乙酸、醋酸或鹽酸等有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸；加入酸的體積可以是有機(jī)溶劑體積的10-4、2\10-4、5\10-4、8父10-4或10-3體積等；熒光藥物分子可以是阿霉素、姜黃素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星等可以與自聚發(fā)光分子發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移的藥物分子；自聚發(fā)光分子溶液的濃度可以是0.001M、0.002M、0.005M、0.008M、0.01M、0.02M、
0.03M、0.04M、0.045或0.048等；加入的熒光藥物分子可以是自聚發(fā)光分子摩爾量的1.0倍、1.2 倍、1.4 倍、1.6 倍、1.8 倍、2.0 倍、2.2 倍、2.4 倍、2.5 倍、2.7 倍、2.8 倍或 3.0 倍等；加熱反應(yīng)的溫度可以是50°C、52°C、55°C、58°C、60°C、62°C、65°C、68°C或69°C等；加熱反應(yīng)的時(shí)間可以是12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)、28小時(shí)、32小時(shí)、36小時(shí)、40小時(shí)、44小時(shí)或46小時(shí)等。
[0026]其中，步驟(2)中可與水互溶的有機(jī)溶劑可以是甲醇、二甲基亞砜、四氫呋喃和N，N-二甲基甲酰胺等；熒光藥物分子復(fù)合物懸乳液濃度可以是20禮、501111、1001111、1501111、200mM、300mM,400mM或480mM等；超聲條件可以是超聲頻率為20_40KHz，超聲時(shí)間為5-10min,比如 20KHz 超聲 10min、24KHz 超聲 9min、28KHz 超聲 8min、32KHz 超聲 7min、36KHz超聲6min或40KHz超聲5min等,優(yōu)選40KHz超聲5min ;懸乳液與水的體積比可以是10'2 X 10' 5 X 10'8 X 10' 10' 2 X 10' 5 X 10'8 X KT3 或 KT2 等。
[0027]在第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的方法制備的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0028]優(yōu)選地，所述熒光藥物分子復(fù)合納米粒子的平均粒徑為80-200nm，例如80nm、90nm、lOOnm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm 或 200nmo
[0029]在第四方面，本發(fā)明提供一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)藥物的空間釋放進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)的方法，包括:
[0030](a)將上述的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子溶解于待監(jiān)測(cè)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，得到分散液；
[0031](b)將所述分散液與待監(jiān)測(cè)細(xì)胞接觸，然后洗去未進(jìn)入細(xì)胞的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子；
[0032]優(yōu)選地，采用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液洗去未進(jìn)入細(xì)胞的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子；
[0033](c)將步驟(b)得到的細(xì)胞在緩沖液中孵育，然后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察；
[0034]優(yōu)選地，所述緩沖液為pH為7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0035]在第五方面，本發(fā)明提供一種上述的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子在對(duì)細(xì)胞內(nèi)藥物的空間釋放進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，包括自聚發(fā)光分子通過(guò)環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵與熒光藥物分子連接形成的熒光藥物分子復(fù)合物，所述環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵隨環(huán)境條件的改變而被打開(kāi)，自聚發(fā)光分子與突光藥物分子分離，自聚發(fā)光分子和熒光藥物分子分別產(chǎn)生發(fā)熒光現(xiàn)象，通過(guò)熒光現(xiàn)象的變化對(duì)藥物在空間上的釋放過(guò)程進(jìn)行熒光可視化監(jiān)測(cè)。因此，本發(fā)明的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子作為具有熒光自定位功能的藥物遞送系統(tǒng)，能夠示蹤藥物在生物體內(nèi)的真正位置。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制備的藥物遞送系統(tǒng)的透射電鏡(TEM)圖。
[0038]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1制備的藥物遞送系統(tǒng)的粒徑分布圖。
[0039]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1制備的藥物遞送系統(tǒng)的表面電位分布圖。
[0040]圖4是本發(fā)明實(shí)施例2制備的復(fù)合熒光藥物分子的質(zhì)譜圖。 [0041]圖5是本發(fā)明實(shí)施例3制備的藥物遞送系統(tǒng)的透射電鏡(TEM)圖。
[0042]圖6是本發(fā)明實(shí)施例1制備的藥物遞送系統(tǒng)在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中藥物空
[0043]間釋放的熒光共聚焦顯微鏡圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑廠(chǎng)商購(gòu)買(mǎi)得到的。
[0045]實(shí)施例1:pH敏感的腙鍵連接四苯基乙烯和藥物阿霉素制備的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子
[0046]本實(shí)施例通過(guò)如下步驟制備熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，即藥物遞送系統(tǒng)。
[0047]在三口燒瓶中，將40.6mg(0.1mmol)自聚發(fā)光分子四苯基乙烯的羧基化合物(合成所得，參照文獻(xiàn):Adv.Mater.，do1: 10.1002/adma.201302365)溶解到含有 150mg (0.4mmol)2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):xw020053)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):C348435000)溶液中，然后再加入34.7iiL (0.2mmol)的N，N-二異丙基乙胺(DIEA，購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào):3087649)，使四苯基乙烯上的羧基基團(tuán)活化，然后再向反應(yīng)體系中加入50.8mg (0.2mmol)的9-荷基甲基肼基甲酸酯(Fmoc-肼,購(gòu)自北京博邁杰科技有限公司，貨號(hào):20110225)。室溫劇烈攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完成后，向反應(yīng)體系中加入相當(dāng)于反應(yīng)體系20%的哌啶(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):80104216)，以脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，使四苯基乙烯帶有一個(gè)氨基的活性基團(tuán)。
[0048]取20.3mg (0.05mmol)的以上制得的帶有氨基的四苯基乙烯溶解到IOmL甲醇中，并加入IOiiL三氟乙酸(購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào):302031 )，然后再加入58mg (0.1mmol)的鹽酸阿霉素(購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號(hào):MB1087)熒光藥物分子，于三口燒瓶中60°C劇烈攪拌加熱反應(yīng)24小時(shí)，得到腙鍵連接的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子。
[0049]取9.46mg四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子溶解到100 y L的DMS0(購(gòu)自美國(guó)AMRESC0公司，貨號(hào):0231)溶液中，得到IOOmM的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子溶液。然后在超聲條件下，將I U L的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子DMSO溶液滴加到ImL超純水中(美國(guó)Millipore公司純水儀制備)，制得四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)，即熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0050]實(shí)施例2:pH敏感的腙鍵連接四苯基乙烯和藥物阿霉素制備的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子
[0051]本實(shí)施例通過(guò)如下步驟制備熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，即藥物遞送系統(tǒng)。
[0052]在三口燒瓶中，將40.6mg (0.lmmol)自聚發(fā)光分子四苯基乙烯的羧基化合物(合成所得，參照文獻(xiàn):Adv.Mater.，do1:10.1002/adma.201302365)溶解到含有20mL乙醇(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):10009218)中，于70°C加熱攪拌，得酯化后的四苯基乙烯，然后再加入7.5mg (0.2mmol)的水合肼(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):80070418)，于IOmL 二氯甲烷(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):80047318)溶劑中攪拌反應(yīng)24小時(shí)，得到帶有活性氨基的四苯基乙烯。
[0053]取20.3mg (0.05mmol)的以上制得的帶有氨基的四苯基乙烯溶解到IOmL甲醇(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):40064260)中，并加入20 ii L三氟乙酸，然后再加入58mg (0.lmmol)的鹽酸阿霉素?zé)晒馑幬锓肿樱谌跓恐?0°C劇烈攪拌反應(yīng)24小時(shí)，得到腙鍵連接的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子。
[0054]取9.46mg四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子溶解到100 y L的DMSO溶液中，得到IOOmM的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子溶液。然后在超聲條件下，將I U L的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子DMSO溶液滴加到超純水中，制得四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)，即熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0055]實(shí)施例3:pH敏感的腙鍵連接硅雜環(huán)戊二烯和藥物阿霉素制備的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子
[0056]本實(shí)施例通過(guò)如下步驟制備熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，即藥物遞送系統(tǒng)。
[0057]在三口燒瓶中，將50.6mg (0.lmmol)自聚發(fā)光分子娃雜環(huán)戍二烯的羧基化合物(合成所得，參照文獻(xiàn):Chem.Mater.，2003，15，1535-1546.)溶解到含有 150mg (0.4mmol)2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，然后再加入34.7 ii L (0.2mmol)的N，N- 二異丙基乙胺(DIEA)，使硅雜環(huán)戊二烯上的羧基基團(tuán)活化，然后再向反應(yīng)體系中加入50.8mg (0.2mmol)的9-芴基甲基肼基甲酸酯(Fmoc-肼)。室溫劇烈攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完成后，向反應(yīng)體系中加入相當(dāng)于反應(yīng)體系20%的哌啶，以脫去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，使硅雜環(huán)戊二烯帶有一個(gè)氨基的活性基團(tuán)。
[0058]取26mg (0.05mmol)的以上制得的帶有氨基的娃雜環(huán)戍二烯溶解到IOmL甲醇中，并加入20iiL三氟乙酸，然后再加入58mg (0.lmmol)的鹽酸阿霉素?zé)晒馑幬锓肿?，于三口燒瓶?0°C劇烈攪拌反應(yīng)24小時(shí)，得到腙鍵連接的硅雜環(huán)戊二烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子。
[0059]取10.45mg硅雜環(huán)戊二烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子溶解到100 y L的DMSO溶液中，得到IOOmM的硅雜環(huán)戊二烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子溶液。然后在超聲條件下，將I U L的硅雜環(huán)戊二烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子DMSO溶液滴加到超純水中，制得硅雜環(huán)戊二烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)，即熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0060]實(shí)施例4:通過(guò)水解酶敏感的脂鍵連接自聚發(fā)光熒光分子硅雜環(huán)戊二烯和藥物姜黃素制備的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子
[0061]本實(shí)施例通過(guò)如下步驟制備熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，即藥物遞送系統(tǒng)。[0062]在三口燒瓶中，將50.6mg (0.lmmol)自聚發(fā)光熒光分子硅雜環(huán)戊二烯的羧基化合物(合成所得，參照文獻(xiàn):Chem.Mater.，2003，15，1535-1546.)溶解到含有24.72mg(0.12mmol)的N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):30056326)的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，于冰浴中攪拌0.5h，再加入1.22mg(0.01mmol)的二甲基氨基吡啶(DMAP，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):30198415)和73.6mg (0.2mmol)的姜黃素(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):71012660)于室溫下攪拌24h，得到脂鍵連接的硅雜環(huán)戊二烯-姜黃素復(fù)合熒光藥物分子。
[0063]取85.6mg的硅雜環(huán)戊二烯-姜黃素復(fù)合熒光藥物分子溶解到100 y L的DMSO溶液中，得到IOOmM的硅雜環(huán)戊二烯-姜黃素復(fù)合熒光藥物分子溶液。然后在超聲條件下，將I U L的硅雜環(huán)戊二烯-姜黃素復(fù)合熒光藥物分子DMSO溶液滴加到超純水中，制得硅雜環(huán)戊二烯-姜黃素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)，即熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0064]實(shí)施例5:氧化還原敏感的二硫鍵連接四苯基乙烯和藥物表柔比星制備的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子
[0065]本實(shí)施例通過(guò)如下步驟制備熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，即藥物遞送系統(tǒng)。
[0066]在三口燒瓶中，將40.6mg (0.lmmol)自聚發(fā)光分子四苯基乙烯的羧基化合物溶解到含有24.72mg (0.12mmol)的N，N’- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，于冰浴中攪拌0.5h，再加入1.22mg (0.01mmol)的二甲基氨基吡啶(DMAP)和15.7mg (0.2mmol)的巰基乙醇(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):80076928)于室溫下攪拌24h，反應(yīng)完成后，得到末端帶有巰基的自聚發(fā)光分子四苯基乙烯。
[0067]取23.3mg (0.05mmol)的以上制得的帶有巰基的自聚發(fā)光分子四苯基乙烯溶解到IOmLDMF中，并加入0.1mmol的2-吡啶基二硫基乙基胺(購(gòu)自南京精瑞久安生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào):JRS_0052)，于三`口燒瓶中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)，得到末端帶有氨基的自聚發(fā)光分子四苯基乙烯。
[0068]取5.41mg (0.01mmol)以上制得的末端帶有氨基的自聚發(fā)光分子四苯基乙烯與10.86mg (0.02mmol)的表柔比星與含有乙酸(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):10000208)的DMSO中，于70°C攪拌反應(yīng)2h后加入0.04mmol的氰基硼氫化鈉(購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào):156159)繼續(xù)反應(yīng)2h后，制得四苯基乙烯-表柔比星復(fù)合熒光藥物分子。
[0069]取10.52mg以上制得的四苯基乙烯-表柔比星復(fù)合熒光藥物分子溶解到100 y L的DMSO溶液中，得到IOOmM的四苯基乙烯-表柔比星復(fù)合熒光藥物分子溶液。然后在超聲條件下，將I U L的四苯基乙烯-表柔比星復(fù)合熒光藥物分子DMSO溶液滴加到超純水中，制得四苯基乙烯-表柔比星復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)，即熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0070]實(shí)施例6:葡萄糖敏感硼酸鍵連接四苯基乙烯和藥物佐柔比星制備的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子
[0071]本實(shí)施例通過(guò)如下步驟制備熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，即藥物遞送系統(tǒng)。
[0072]在三口燒瓶中，將40.6mg (0.lmmol)的自聚發(fā)光突光分子四苯基乙烯的羧基化合物溶解到含有150mg (0.4mmol)2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，然后再加入34.7 y L (0.2mmol)的N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，使四苯基乙烯上的羧基基團(tuán)活化，然后再向反應(yīng)體系中加入3Img (0.2mmol)的3-氨基苯硼酸(購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào):287512)。室溫劇烈攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完成后，得到末端帶有苯硼酸基團(tuán)的自聚發(fā)光分子四苯基乙烯。
[0073]將31mg (0.2臟01)的2，3-二羥基苯甲酸(購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào):126209)溶解到含有300mg (0.8mmol)2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，然后再加入69.4iiL (0.4mmol)的N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，使2，3- 二羥基苯甲酸上的羧基基團(tuán)活化，然后再向反應(yīng)體系中加入258.4mg(0.4mmol)的佐柔比星。室溫劇烈攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完成后，得到末端帶有2，3-二羥基苯甲酸的佐柔比星。
[0074]然后，取0.05mmol的末端帶有苯硼酸基團(tuán)的自聚發(fā)光分子四苯基乙烯與
0.05mmol的末端帶有2，3- 二羥基苯甲酸的佐柔比星于三蒸水中混合，得到葡萄糖敏感硼酸鍵連接的四苯基乙烯-藥物佐柔比星熒光藥物分子復(fù)合物。
[0075]取12.88mg以上制得的四苯基乙烯-藥物佐柔比星熒光藥物分子復(fù)合物溶解到IOOii L的DMSO溶液中，得到IOOmM的四苯基乙烯-藥物佐柔比星熒光藥物分子溶液。然后在超聲條件下，將I U L的四苯基乙烯-藥物佐柔比星熒光藥物分子的DMSO溶液滴加到超純水中，制得四苯基乙烯-藥物佐柔比星熒光藥物分子復(fù)合的熒光藥物遞送系統(tǒng)，即熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
[0076]測(cè)試實(shí)施例1
[0077]通過(guò)Hitachi公司的透射電鏡(型號(hào):HT7700)按照其說(shuō)明書(shū)中方法，對(duì)實(shí)施例1中制得的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行了納米形貌的觀(guān)察。 [0078]將上述10 L (100 M)四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)滴到銅網(wǎng)上，待其干燥后，進(jìn)行透射電鏡測(cè)定。觀(guān)察得實(shí)施例1中所制備的熒光藥物遞送系統(tǒng)的形貌為圓球狀，粒徑約為134nm。具有如圖1所示的形貌以及大小。圖1的結(jié)果說(shuō)明實(shí)施例1中制備的納米藥物遞送系統(tǒng)具有良好的形貌以及納米尺度。
[0079]通過(guò)Malvern公司的動(dòng)態(tài)光散射儀，并按照其說(shuō)明書(shū)中方法，對(duì)實(shí)施例1中制備的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射(Zetasizer NanoZS)測(cè)定，測(cè)得實(shí)施例1中制備的納米藥物遞送系統(tǒng)具有如圖2所示的粒徑分布。圖2的結(jié)果說(shuō)明所制備的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)粒徑分布較為均一。
[0080]通過(guò)Malvern公司的動(dòng)態(tài)光散射儀，并按照其說(shuō)明書(shū)中方法，對(duì)實(shí)施例1中制備的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行了表面電位的測(cè)定，測(cè)得實(shí)施例1中所制備的納米藥物遞送系統(tǒng)的表面電位為42.7mV。具有如圖3所示的表面電位分布。圖3的結(jié)果表明納米藥物遞送系統(tǒng)表面由于氨基的存在，具有較強(qiáng)的正電荷。
[0081]對(duì)實(shí)施例2-6制備的藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行如上相同測(cè)試，得到與實(shí)施例1中制備的藥物遞送系統(tǒng)基本相同的檢測(cè)結(jié)果，在此不再贅述。
[0082]測(cè)試實(shí)施例2
[0083]通過(guò)Bruker公司的質(zhì)譜儀(型號(hào):Microflex LRF),并按照其說(shuō)明書(shū)中方法,對(duì)實(shí)施例2中制得的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子進(jìn)行了分子量測(cè)定。
[0084]將上述0.1mg四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物分子溶解到ImL甲醇中，然后吸取I UL樣品與IiiL的2，5-二羥基苯甲酸(購(gòu)自Bruker公司，貨號(hào):205931)混合后滴到質(zhì)譜的載樣板上，待其干燥后，進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。測(cè)定得實(shí)施例2中所制備的熒光藥物復(fù)合分子的分子量為946.1Da，具有如圖4所示的分子量分布。圖4的結(jié)果說(shuō)明熒光藥物分子是由四苯基乙烯和熒光藥物分子阿霉素組成。
[0085]對(duì)實(shí)施例1和3-6制備的藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行如上相同測(cè)試，得到與實(shí)施例2中制備的藥物遞送系統(tǒng)基本相同的檢測(cè)結(jié)果，在此不再贅述。
[0086]測(cè)試實(shí)施例3
[0087]通過(guò)Hitachi公司的透射電鏡(型號(hào):HT7700)按照其說(shuō)明書(shū)中方法，對(duì)實(shí)施例3中制得的硅雜環(huán)戊二烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行了納米形貌的觀(guān)察。 [0088]將上述10 L (100 M)硅雜環(huán)戊二烯-阿霉素復(fù)合熒光納米藥物遞送系統(tǒng)滴到銅網(wǎng)上，待其干燥后，進(jìn)行透射電鏡測(cè)定。觀(guān)察得實(shí)施例3中所制備的熒光藥物遞送系統(tǒng)的形貌為圓球狀，粒徑約為200nm。具有如圖5所示的形貌以及大小。圖5的結(jié)果說(shuō)明實(shí)施例3中制備的納米藥物遞送系統(tǒng)具有良好的形貌以及納米尺度。
[0089]對(duì)實(shí)施例2和4-6制備的藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行如上相同測(cè)試，得到與實(shí)施例1中制備的藥物遞送系統(tǒng)基本相同的檢測(cè)結(jié)果，在此不再贅述。
[0090]測(cè)試實(shí)施例4
[0091]通過(guò)OLYMPUS公司的熒光共聚焦顯微鏡(型號(hào):FV1000)按照其說(shuō)明書(shū)中方法，對(duì)實(shí)施例1中制得的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物遞送系統(tǒng)在乳腺癌細(xì)胞中的藥物空間釋放進(jìn)行了熒光可視化分析。
[0092]取IOmM的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物納米粒子I U L，用高糖培養(yǎng)基(購(gòu)自life technology公司，貨號(hào):11965-092)稀釋至2mL,得到5 y M的四苯基乙烯-阿霉素復(fù)合熒光藥物納米粒子的培養(yǎng)基懸液2mL。然后將得到的培養(yǎng)基懸液與乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞于37°C共培養(yǎng)2h，然后再向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入2 u L綠色溶酶體定位熒光染料(購(gòu)自lifetechnology公司，貨號(hào):L_7526,用來(lái)示蹤溶酶體，以證明本發(fā)明涉及的藥物遞送系統(tǒng)在細(xì)胞中的溶酶體低PH條件下的釋放)，孵育IOmin后，將含有藥物遞送系統(tǒng)和溶酶體定位熒光染料的培養(yǎng)基吸走，再用PH7.4的磷酸緩沖液洗去未進(jìn)入細(xì)胞的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子和溶酶體定位熒光染料；然后向清洗過(guò)的細(xì)胞中加入2mL pH7.4的磷酸緩沖液，置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察；觀(guān)察得實(shí)施例1中所制備的熒光藥物遞送系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)的藥物釋放位置，以及載體在細(xì)胞中的位置和藥物的作用位置。圖6的結(jié)果說(shuō)明實(shí)施例1中制備的納米藥物遞送系統(tǒng)可以通過(guò)熒光變化揭示藥物在細(xì)胞中的空間釋放。通過(guò)PH敏感鍵連接的藥物遞送系統(tǒng)在溶酶體的低PH環(huán)境中釋放藥物阿霉素，釋放出的藥物進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮作用，自聚發(fā)光分子(四苯基乙烯)未進(jìn)入細(xì)胞核，定位在細(xì)胞質(zhì)中。
[0093]對(duì)實(shí)施例2-6制備的藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行如上相同測(cè)試，得到與實(shí)施例1中制備的藥物遞送系統(tǒng)基本相同的檢測(cè)結(jié)果，在此不再贅述。
[0094] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，包括自聚發(fā)光分子通過(guò)環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵與熒光藥物分子連接形成的熒光藥物分子復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，其特征在于，所述復(fù)合納米粒子是自聚發(fā)光分子通過(guò)環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵與熒光藥物分子連接形成的熒光藥物分子復(fù)合物自組裝形成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子，其特征在于，所述自聚發(fā)光分子帶有活性官能團(tuán)； 優(yōu)選地，所述活性官能團(tuán)選自氨基、羧基、羥基、巰基和疊氮； 優(yōu)選地，所述自聚發(fā)光分子選自四苯基乙烯和硅雜環(huán)戊二烯； 優(yōu)選地，所述環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵選自酶敏感的脂鍵，PH敏感的腙鍵、脲鍵和希夫堿，氧化還原敏感的二硫鍵和葡萄糖敏感的硼酸鍵； 優(yōu)選地，所述熒光藥物分子選自阿霉素、姜黃素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星。
4.一種制備權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子的方法，包括: (1)使自聚發(fā)光分子與熒光藥物分子接觸，形成環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵，得到熒光藥物分子復(fù)合物； (2)將所述熒光藥物分子復(fù)合物溶于可與水互溶的有機(jī)溶劑配成懸浮液，然后將所述懸浮液在超聲條件下滴加到水中，制得所述熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述自聚發(fā)光分子帶有活性官能團(tuán)； 優(yōu)選地，所述活性官能團(tuán)選自氨基、羧基、羥基、巰基和疊氮； 優(yōu)選地，所述自聚發(fā)光分子選自四苯基乙烯和硅雜環(huán)戊二烯； 優(yōu)選地，所述環(huán)境響應(yīng)性化學(xué)鍵選自酶敏感的脂鍵，PH敏感的腙鍵、脲鍵和希夫堿，氧化還原敏感的二硫鍵和葡萄糖敏感的硼酸鍵； 優(yōu)選地，所述熒光藥物分子選自阿霉素、姜黃素、阿柔比星、佐柔比星和表柔比星。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述可與水互溶的有機(jī)溶劑選自二甲基亞砜、四氫呋喃、N，N- 二甲基甲酰胺和甲醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)將自聚發(fā)光分子溶于有機(jī)溶劑中，配成濃度為0.001-0.05M的溶液，按有機(jī)溶劑的10_4至10_3體積加入酸進(jìn)行催化，然后按自聚發(fā)光分子摩爾量的1-3倍加入熒光藥物分子，50-70°C攪拌加熱反應(yīng)12-48小時(shí)，得到熒光藥物分子復(fù)合物； (2)將所述熒光藥物分子復(fù)合物溶于可與水互溶的有機(jī)溶劑中，配成濃度為10-500mM的懸乳液，在超聲條件下，按懸乳液與水的體積比為10_4至10_2的比例滴加到水中，制得熒光藥物分子復(fù)合納米粒子。
8.—種如權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的方法制備的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子； 優(yōu)選地，所述熒光藥物分子復(fù)合納米粒子的平均粒徑為80-200nm。
9.一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)藥物的空間釋放進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)的方法，包括: Ca)將如權(quán)利要求1、2、3或8所述的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子溶解于待監(jiān)測(cè)細(xì)胞的培養(yǎng)基中，得到分散液； (b)將所述分散液與待監(jiān)測(cè)細(xì)胞接觸，然后洗去未進(jìn)入細(xì)胞的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子；優(yōu)選地，采用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液洗去未進(jìn)入細(xì)胞的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子; (c)將步驟(b)得到的細(xì) 胞在緩沖液中孵育，然后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察； 優(yōu)選地，所述緩沖液為pH為7.4的磷酸鹽緩沖液。
10.如權(quán)利要求1、2、3或8所述的熒光藥物分子復(fù)合納米粒子在對(duì)細(xì)胞內(nèi)藥物的空間釋放進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103611164SQ201310625937
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】梁興杰, 薛向東, 鄒國(guó)漳, 張春秋 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心