一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于熒光成像【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法及裝置。解決了由于納米粒子熒光輻射起伏以及信號(hào)信噪比較低所造成的熒光成像模糊等技術(shù)問題。一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，包括以下步驟：向用于激發(fā)納米粒子樣品的激光加載一個(gè)強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)，將該激光入射至納米粒子樣品；采集納米粒子樣品在激光的激發(fā)下所發(fā)射的攜帶有調(diào)制信號(hào)特性的熒光信號(hào),利用相敏檢波提取納米粒子熒光的相位信息；對整個(gè)納米粒子樣品進(jìn)行兩維掃描，得到納米粒子樣品發(fā)射熒光的模擬信號(hào)成像。本發(fā)明通過提取納米粒子熒光的相位信息用于納米粒子的熒光成像，有效抑制納米粒子熒光輻射的量子起伏，實(shí)現(xiàn)高清晰度的納米粒子熒光成像。
【專利說明】一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法及裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于熒光成像【技術(shù)領(lǐng)域】，可用于利用熒光納米粒子在納米尺度環(huán)境的高清晰度熒光成像，具體為一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]上世紀(jì)九十年代熒光納米粒子技術(shù)的發(fā)展使得物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)出現(xiàn)了一次巨大的革新，人們發(fā)展各種高清晰度、高分辨率的成像技術(shù)，同時(shí)合成制備各類高亮度的納米熒光發(fā)色團(tuán)，而這些新技術(shù)和新材料被迅速地應(yīng)用到生物學(xué)中，基于熒光發(fā)色團(tuán)的各類成像技術(shù)不斷地幫助人們揭示著細(xì)胞、蛋白、DNA等生命體在納米尺度上的行為。
[0003]熒光成像技術(shù)使得人們可以觀測3D生物結(jié)構(gòu)、測量由多種發(fā)色團(tuán)共同定位的生命體的相互作用過程、記錄活體細(xì)胞內(nèi)納米尺度上的動(dòng)力學(xué)過程等?；诩す鈷呙韫簿劢钩上?、寬場成像、受激發(fā)射損耗顯微術(shù)(STED)、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)(STORM)和光活化定位顯微術(shù)(PALM)等一系列高靈敏、高分辨率的熒光成像技術(shù)快速地推動(dòng)著生命科學(xué)研究的發(fā)展。在通常的納米粒子成像中，由于納米粒子熒光的輻射起伏(取決于納米粒子受到周圍電子受體俘獲電子的能力大小的影響)、背景噪聲較大等因素使得納米粒子熒光成像較為模糊，不能實(shí)現(xiàn)高清晰的熒光成像，無法在生命過程的研究中給出生命體在納米尺度上的精確信息。這里我們將給出一種提高單粒子熒光成像清晰度的裝置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決由于納米粒子熒光輻射起伏以及信噪比較低所造成的熒光成像模糊等技術(shù)問題，而提出的一種高清晰度的納米粒子熒光成像的裝置，可用于生命科學(xué)中的熒光標(biāo)記、表征、成像等領(lǐng)域。
[0005]本發(fā)明所述的一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法是采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，包括以下步驟:(a)向用于激發(fā)納米粒子樣品的激光加載一個(gè)強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)，將加載有強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)的激光照射納米粒子樣品；
(b)收集納米粒子樣品在激光的激發(fā)下所發(fā)射的帶有調(diào)制信號(hào)特性的熒光信號(hào)，利用相敏檢波提取納米粒子熒光的相位信息；(C)對納米粒子樣品進(jìn)行掃描，根據(jù)調(diào)制信號(hào)提取納米粒子熒光的相位信息，獲得納米粒子樣品發(fā)射熒光的模擬信號(hào)成像；(d)選擇樣品中任意一個(gè)納米粒子，將該納米粒子移動(dòng)到激光的焦點(diǎn)內(nèi)，激光激發(fā)納米粒子輻射熒光，即可獲得該納米粒子的模擬信號(hào)熒光光譜。
[0006]本發(fā)明采用加載有強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)的激光掃描激發(fā)納米粒子實(shí)驗(yàn)樣品，使得納米粒子輻射出具有調(diào)制信號(hào)特性的熒光(熒光的強(qiáng)度與入射激光的強(qiáng)度成正比)，帶有強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)的熒光光子通過光電轉(zhuǎn)化為TTL電平脈沖輸出信號(hào)，這些信號(hào)在時(shí)域上都以非均勻的疏密相間的形式傳播。這些疏密相間的TTL電平脈沖輸出信號(hào)攜帶有納米粒子樣品的計(jì)數(shù)以及模擬信號(hào)信息，經(jīng)過相位信號(hào)的提取之后就可以得到清晰度非常高的納米粒子模擬信號(hào)成像。掃描整個(gè)樣品的表面就可以獲得關(guān)于樣品發(fā)射熒光的模擬信號(hào)成像；單獨(dú)鎖定某個(gè)納米粒子就可以獲得該納米粒子的模擬信號(hào)熒光光譜。
[0007]進(jìn)一步的，還包括步驟(e);對納米粒子樣品的同一區(qū)域上的納米粒子進(jìn)行多次重復(fù)掃描獲得一系列的成像，對每一幀圖像的納米粒子的熒光成像進(jìn)行高斯分析定位可獲得每一幀圖像的納米粒子的質(zhì)心坐標(biāo)，將所有幀的定位坐標(biāo)整合到一起可獲得該納米粒子質(zhì)心的定位分布，從而可獲得該該納米粒子成像的定位精度。
[0008]本發(fā)明所述的一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置是采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置，包括一個(gè)連續(xù)激光器，連續(xù)激光器的出射端順次設(shè)有位于連續(xù)激光器出射光路上的聲光強(qiáng)度調(diào)制器、λ/2玻片、λ/4玻片以及激光擴(kuò)束器；激光擴(kuò)束器的出射光路上設(shè)有倒置熒光顯微鏡，所述倒置熒光顯微鏡的入射端口位于激光擴(kuò)束器的出射光路上，經(jīng)過擴(kuò)束后的激光通過激發(fā)濾光器進(jìn)行濾波后由二向色鏡反射進(jìn)入顯微鏡物鏡；顯微鏡物鏡前端設(shè)有一個(gè)用于搭載樣品的三維納米臺(tái)；倒置熒光顯微鏡的熒光收集光路上順次設(shè)有一個(gè)陷波濾波器、一個(gè)發(fā)射濾波器、一個(gè)共焦針孔和一個(gè)單光子探測器；單光子探測器的信號(hào)輸出端分別連接有相敏檢波器以及裝有LabVIEW和MATLAB程序的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)；所述相敏檢波器的信號(hào)輸出端與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)的信號(hào)輸入端相連接；相敏檢波器的信號(hào)輸入端還通過一個(gè)延時(shí)控制器連接有一個(gè)信號(hào)發(fā)生器；所述信號(hào)發(fā)生器的另一個(gè)信號(hào)輸出端與聲光強(qiáng)度調(diào)制器的調(diào)制信號(hào)輸入端相連接；計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)的信號(hào)輸出端與三維納米臺(tái)的信號(hào)輸入端相連接。
[0009]本發(fā)明利用相敏檢波來提取納米粒子熒光的相位信息的手段來獲得高清晰度的納米粒子熒光成像。采用聲光強(qiáng)度調(diào)制器為用于激發(fā)納米粒子樣品產(chǎn)生熒光的激光引入對激光強(qiáng)度的調(diào)制；單光子探測器用于將接收到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的TTL電平脈沖輸出信號(hào)；相敏檢波器用于對攜帶有調(diào)制相位信息的納米粒子熒光信號(hào)的相位提?。挥?jì)算機(jī)數(shù)據(jù)控制與采集系統(tǒng)在相應(yīng)軟件(LabVIEW和MATLAB程序)的支持下對采集到的熒光所對應(yīng)的電信號(hào)進(jìn)行處理，得到納米粒子樣品發(fā)射熒光模擬信號(hào)成像以及單個(gè)納米粒子的模擬信號(hào)熒光光譜。計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)控制三維納米臺(tái)的移動(dòng)，便于對整個(gè)納米粒子樣品進(jìn)行掃描以及對單獨(dú)一個(gè)納米粒子的鎖定聚焦；λ /2玻片和λ /4玻片則用于調(diào)節(jié)激光的偏振方向，使其符合共聚焦顯微鏡對入射激光的要求。
[0010]本發(fā)明對比已有技術(shù)具有以下創(chuàng)新點(diǎn):
[0011]1、通過納米粒子熒光的相位信息用于納米粒子的熒光成像，這種成像方法能夠有效地抑制納米粒子熒光輻射的量子起伏，提高成像的信噪比，實(shí)現(xiàn)高清晰度的納米粒子熒光成像。
[0012]2、這種高清晰模擬信號(hào)成像能夠有效地提高納米粒子在納米尺度上的定位精度。
[0013]3、連續(xù)激光器、聲光強(qiáng)度調(diào)制器、λ /2與λ /4玻片和激光擴(kuò)束器組成熒光激發(fā)單元；三維納米臺(tái)和共聚焦顯微鏡構(gòu)成共焦顯微鏡主體；單光子探測器、相敏檢波器和延時(shí)控制器作為微弱信號(hào)檢測系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)，這四個(gè)單元化模塊整合而成，有利于熒光成像設(shè)備的集成化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述方法的裝置結(jié)構(gòu)示意圖。[0015]圖中:I )熒光激發(fā)單元；II)共焦顯微鏡主體JII)微弱信號(hào)檢測系統(tǒng)；IV)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)控制與采集系統(tǒng)。1-連續(xù)激光器，2-聲光強(qiáng)度調(diào)制器，3-三維納米臺(tái)，4-單光子探測器，5-信號(hào)發(fā)生器，6-相敏檢波器，7-計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)，8- 二向色鏡，9-顯微鏡物鏡，10-共焦針孔，a- λ /2玻片，b- λ /4玻片，c-激光擴(kuò)束器，d_激發(fā)濾波器，e_發(fā)射濾波器，f-陷波濾波器，g-延時(shí)控制器。
[0016]圖2為納米粒子熒光的光子計(jì)數(shù)成像。
[0017]圖3為納米粒子熒光的模擬信號(hào)成像。
[0018]圖4 (a)為納米粒子熒光的光子計(jì)數(shù)光譜；(b)為納米粒子的模擬信號(hào)熒光光譜。
[0019]圖5為一個(gè)納米粒子的熒光光子計(jì)數(shù)成像的三維立體圖。
[0020]圖6為一個(gè)納米粒子熒光的模擬信號(hào)成像的三維立體圖。
[0021]圖7為利用納米粒子熒光對納米粒子進(jìn)行質(zhì)心定位的方法示意圖。
[0022]圖8為對同一納米粒子的多幀光子計(jì)數(shù)成像的質(zhì)心定位分布。
[0023]圖9為對同一納米粒子的多幀模擬信號(hào)成像的質(zhì)心定位分布。
[0024]圖10為納米粒子熒光成像數(shù)據(jù)流程原理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，包括以下步驟:(a)向用于激發(fā)納米粒子樣品的激光加載一個(gè)強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)，將加載有強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)的激光照射納米粒子樣品；(b)收集納米粒子樣品在激光的激發(fā)下所發(fā)射的帶有調(diào)制信號(hào)特性的熒光信號(hào)，利用相敏檢波提取納米粒子熒光的相位信息；(C)對納米粒子樣品進(jìn)行掃描，根據(jù)調(diào)制信號(hào)提取納米粒子熒光的相位信息，獲得納米粒子樣品發(fā)射熒光的模擬信號(hào)成像；(d)選擇樣品中任意一個(gè)納米粒子，將該納米粒子移動(dòng)到激光的焦點(diǎn)內(nèi)，激光激發(fā)納米粒子輻射熒光，即可獲得該納米粒子的模擬信號(hào)熒光光譜；(e)對納米粒子的模擬信號(hào)成像進(jìn)行分析，可獲得成像的定位精度。
[0026]一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置，包括一個(gè)連續(xù)激光器1，連續(xù)激光器I的出射端順次設(shè)有位于連續(xù)激光器I出射光路上的聲光強(qiáng)度調(diào)制器2、λ /2玻片a、λ /4玻片b以及激光擴(kuò)束器c ;激光擴(kuò)束器c的出射光路上設(shè)有倒置熒光顯微鏡，所述倒置熒光顯微鏡的入射端口位于激光擴(kuò)束器c的出射光路上，經(jīng)過擴(kuò)束后的激光通過激發(fā)濾光器d進(jìn)行濾波后由二向色鏡8反射進(jìn)入顯微鏡物鏡9 ;顯微鏡物鏡9前端設(shè)有一個(gè)用于搭載樣品的三維納米臺(tái)3 ;倒置熒光顯微鏡的熒光收集光路上順次設(shè)有一個(gè)陷波濾波器e、一個(gè)發(fā)射濾波器f、一個(gè)共焦針孔10和一個(gè)單光子探測器4 ;單光子探測器4的信號(hào)輸出端分別連接有相敏檢波器6以及裝有LabVIEW和MATLAB程序的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7 ;所述相敏檢波器6的信號(hào)輸出端與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7的信號(hào)輸入端相連接；相敏檢波器6的信號(hào)輸入端還通過一個(gè)延時(shí)控制器g連接有一個(gè)信號(hào)發(fā)生器5 ;所述信號(hào)發(fā)生器5的另一個(gè)信號(hào)輸出端與聲光強(qiáng)度調(diào)制器2的調(diào)制信號(hào)輸入端相連接；計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7的信號(hào)輸出端與三維納米臺(tái)3的信號(hào)輸入端相連接。
[0027]樣品制備:首先配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的PMMA聚合物溶液其包含有?10-9摩爾的聚苯乙烯熒光納米粒子。利用旋涂的實(shí)驗(yàn)方法將包含有納米粒子的聚合物薄膜制備到已經(jīng)清潔過的玻片上，勻膠機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為2000轉(zhuǎn)/分和旋涂時(shí)間設(shè)置為60s，可制備薄膜厚度大約為300nm的包含有納米粒子的聚合物薄膜層。將制備好的樣品放入到溫度為110°C的真空烘干箱中進(jìn)行淬火處理消除殘留的溶劑，3小時(shí)之后關(guān)閉真空烘干箱電源讓其自然冷卻
至室溫溫度。
[0028]本發(fā)明所述的一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置，如圖1所示，從圖1中可以看到整個(gè)系統(tǒng)由四個(gè)單元部分組成的，分別為I)熒光激發(fā)單元，主要部件為連續(xù)激光器
1、聲光強(qiáng)度調(diào)制器2、λ /2玻片a、λ /4玻片b、激光擴(kuò)束器C等；2)共焦顯微鏡主體，主要部件為倒置顯微鏡鏡體、三維納米臺(tái)3、顯微鏡物鏡9、激發(fā)濾波器d、陷波濾波器e、發(fā)射濾波器f、二向色鏡8等；3)微弱信號(hào)檢測系統(tǒng)，主要部件為相敏檢波器6、延時(shí)控制器g等，4)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7，主要有計(jì)算機(jī)、NI儀器控制與數(shù)據(jù)采集板卡、LabVIEff程序和MATLAB程序等。
[0029]本發(fā)明可通過多種公知的儀器實(shí)現(xiàn)，具體采用的儀器有:熒光倒置顯微鏡(NIKON, TE2000-E)，連續(xù)激光器(MRL-1I1-635L)，聲光強(qiáng)度調(diào)制器(Crystal Technology,3080-122型)，三維納米臺(tái)(Tritor200/20SG)，單光子探測器(SPCM-15)，信號(hào)發(fā)生器(Agilent，33250A型)，相敏檢波器等，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)(NI6251數(shù)據(jù)采集板卡、LabVIEff程序和MATLAB程序)等。
[0030]連續(xù)激光器I與聲光強(qiáng)度調(diào)制器2相連接，信號(hào)發(fā)生器5與聲光強(qiáng)度調(diào)制器2連接。連續(xù)激光器I輸出的激光經(jīng)過聲光強(qiáng)度調(diào)制器2進(jìn)行調(diào)制后分別通過λ/2、λ/4玻片、IOX激光擴(kuò)束器和激發(fā)濾波器后，由一個(gè)二向色鏡反射后進(jìn)入顯微鏡物鏡，顯微鏡物鏡將調(diào)制的激光聚焦到納米粒子樣品上，納米粒子在激光的激發(fā)下輻射熒光信號(hào)，熒光信號(hào)由同一個(gè)顯微鏡物鏡收集后通過二向色鏡、發(fā)射濾波器、陷波濾波器、高能針孔空間濾波后由單光子探測器4進(jìn)行探測，單光子探測器4將熒光光子進(jìn)行光電轉(zhuǎn)化放大后輸出TTL電平脈沖信號(hào)，邏輯電脈沖信號(hào)進(jìn)入計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)7，由NI板卡的計(jì)數(shù)端口進(jìn)行采集，由LabVIEW程序進(jìn)行光子計(jì)數(shù)成像顯示。同時(shí)TTL邏輯電平脈沖信號(hào)進(jìn)入相敏檢波器6,相敏檢波器6來提取納米粒子的突光相位信號(hào),其輸出的模擬信號(hào)由NI板卡的模擬采樣端口進(jìn)行采集，后由LabVIEW程序進(jìn)行模擬成像顯示。光子計(jì)數(shù)成像與模擬成像由MATLAB程序?qū){米粒子成像進(jìn)行精度分析。信號(hào)發(fā)生器5的同步輸出連接到一個(gè)延時(shí)控制器上后連接到相敏檢波器6上。納米粒子樣品置于三維納米臺(tái)3上，NI板卡的模擬輸出端口連接到三維納米臺(tái)3上驅(qū)動(dòng)三維納米臺(tái)進(jìn)行三維的納米掃描或定位。
[0031]為顯示本發(fā)明所示方法的成像質(zhì)量，本發(fā)明所獲得的成像將與用傳統(tǒng)上的光子計(jì)數(shù)成像結(jié)果進(jìn)行對比。三維納米臺(tái)首先掃描納米粒子樣品可獲得納米粒子熒光的光子計(jì)數(shù)成像(圖2所示)和模擬信號(hào)成像(圖3所示)。選擇成像中的任意一個(gè)納米粒子控制納米臺(tái)將該納米粒子移動(dòng)到激光的焦點(diǎn)內(nèi)，激光激發(fā)納米粒子輻射熒光可獲得納米粒子熒光的光子計(jì)數(shù)光譜(圖4 (a)所示)和為納米粒子的模擬信號(hào)熒光光譜(圖4 (b)所示)。
[0032]實(shí)驗(yàn)過程中各儀器參數(shù)設(shè)置為，信號(hào)發(fā)生器5輸出的正弦波信號(hào)(30kHz，4.0Vpp)加載到聲光強(qiáng)度調(diào)制器2的驅(qū)動(dòng)模塊上，對連續(xù)激光器(40MHz)輸出的激光進(jìn)行調(diào)制，被調(diào)制后的激光經(jīng)顯微鏡物鏡聚焦后照射納米粒子樣品，顯微鏡物鏡9 (100X，oil，NA=1.3)收集納米粒子發(fā)出的熒光，單光子探測器4收集入射熒光單光子信號(hào)，并輸入相敏檢波器6對信號(hào)進(jìn)行相位提取，計(jì)算機(jī)記錄相敏檢波器輸出的模擬信號(hào)。
[0033]在圖2、圖3中選擇的掃描步長為IOOnm,掃描的像素為100X 100，在χ-y平面的掃描面積為10 μ mX 10 μ m。圖2和圖3分別為納米粒子熒光的光子計(jì)數(shù)成像和納米粒子模擬信號(hào)成像，光子計(jì)數(shù)成像的性噪比大約為8，納米粒子模擬信號(hào)成像的性噪比大約為40，信噪比改善了大約5倍。
[0034]圖4 (a)和(b)分別為納米粒子熒光的光子計(jì)數(shù)光譜和納米粒子的模擬信號(hào)熒光光譜，從圖4 (a)中可以看到納米粒子熒光的平均光子計(jì)數(shù)N大約為9K，光子計(jì)數(shù)起伏ΛΝ大約為3K，對應(yīng)熒光信號(hào)起伏—/#=1/3;從圖4 (b)中可以看到納米粒子熒光的模擬信號(hào)的平均信號(hào)F:大約為3.6mV，起伏Λ V大約為0.3mV，那么熒光信號(hào)起伏Δ/ = 1/15,即納米粒子熒光強(qiáng)度起伏由光子計(jì)數(shù)光譜的1/3減小為1/15。
[0035]在圖4中選擇的掃描步長為25nm，掃描像素為40X40，在χ-y平面的掃描面積為I μ mX I μ m。圖5和圖6分別為同一個(gè)納米粒子的熒光光子計(jì)數(shù)成像的三維立體圖像和模擬信號(hào)熒光成像的三維立體圖像，從圖5中可以看到光子計(jì)數(shù)的起伏較大，而采用本技術(shù)所得到的熒光成像更為平滑，有利于熒光納米粒子成像的精確定位。
[0036]在計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)控制與采集單元中，基于納米粒子的熒光成像分析納米粒子的成像精度，圖7所示為利用納米粒子熒光成像進(jìn)行納米粒子質(zhì)心定位分析的方法示意圖。我們對納米粒子樣品的同一區(qū)域進(jìn)行多次重復(fù)掃描獲得一系列的成像，由成像精度分析程序依次對每一幀圖像進(jìn)行納米粒子定位分析。對同一納米粒子的多幀光子計(jì)數(shù)成像的質(zhì)心定位分布如圖8所示,通過高斯擬合,光子計(jì)數(shù)成像的質(zhì)心定位精度為28±5nm。對同一納米粒子的多幀相位成像的質(zhì)心定位分布如圖9所示，相位成像的質(zhì)心定位精度約為15±5nm。這種熒光相位成像技術(shù)顯著改善了定位精度。 [0037]圖10為納米粒子熒光成像儀器控制和數(shù)據(jù)流程原理圖。
【權(quán)利要求】
1.一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，其特征在于，包括以下步驟:(a)向用于激發(fā)納米粒子樣品的激光加載一個(gè)強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)，將加載有強(qiáng)度調(diào)制信號(hào)的激光照射納米粒子樣品；(b)收集納米粒子樣品在激光的激發(fā)下所發(fā)射的帶有調(diào)制信號(hào)特性的熒光信號(hào)，利用相敏檢波提取納米粒子熒光的相位信息；(C)對納米粒子樣品進(jìn)行掃描，根據(jù)調(diào)制信號(hào)提取納米粒子熒光的相位信息，獲得納米粒子樣品發(fā)射熒光的模擬信號(hào)成像；(d)選擇樣品中任意一個(gè)納米粒子，將該納米粒子移動(dòng)到激光的焦點(diǎn)內(nèi)，激光激發(fā)納米粒子福射熒光，即可獲得該納米粒子的模擬信號(hào)熒光光譜。
2.如權(quán)利要求1所述的一種提高納米粒子熒光成像清晰度的方法，其特征在于，還包括步驟(e);對納米粒子樣品的同一區(qū)域上的納米粒子進(jìn)行多次重復(fù)掃描獲得一系列的成像，對每一幀圖像的納米粒子的熒光成像進(jìn)行高斯分析定位可獲得每一幀圖像的納米粒子的質(zhì)心坐標(biāo)，將所有幀的定位坐標(biāo)整合到一起可獲得該納米粒子質(zhì)心的定位分布，從而可獲得該納米粒子成像的定位精度。
3.一種提高納米粒子熒光成像清晰度的裝置，用于實(shí)現(xiàn)如權(quán)利要求1或2所述的方法，包括一個(gè)連續(xù)激光器(1)，其特征在于，連續(xù)激光器(I)的出射端順次設(shè)有位于連續(xù)激光器(O出射光路上的聲光強(qiáng)度調(diào)制器(2)、λ /2玻片(a)、λ /4玻片(b)以及激光擴(kuò)束器(C)；激光擴(kuò)束器(c)的出射光路上設(shè)有倒置熒光顯微鏡，所述倒置熒光顯微鏡的入射端口位于激光擴(kuò)束器(c)的出射光路上，經(jīng)過擴(kuò)束后的激光通過激發(fā)濾光器(d)進(jìn)行濾波后由二向色鏡(8)反射進(jìn)入顯微鏡物鏡(9);顯微鏡物鏡(9)前端設(shè)有一個(gè)用于搭載樣品的三維納米臺(tái)(3);倒置熒光顯微鏡的熒光收集光路上順次設(shè)有一個(gè)陷波濾波器(e)、一個(gè)發(fā)射濾波器(f)、一個(gè)共焦針孔(10)和一個(gè)單光子探測器(4);單光子探測器(4)的信號(hào)輸出端分別連接有相敏檢波器(6)以及裝有LabVIEW和MATLAB程序的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)(7);所述相敏檢波器(6)的信號(hào)輸出端與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)(7)的信號(hào)輸入端相連接；相敏檢波器(6)的信號(hào)輸入端還通過一個(gè)延時(shí)控制器(g)連接有一個(gè)信號(hào)發(fā)生器(5);所述信號(hào)發(fā)生器(5)的另一個(gè)信號(hào)輸出端與聲光強(qiáng)度調(diào)制器(2)的調(diào)制信號(hào)輸入端相連接；計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集成像與控制系統(tǒng)(7)的信號(hào)輸出端與三維納米臺(tái)(3)的信號(hào)輸入端相連接。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103901012SQ201410165529
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】張國峰, 陳瑞云, 高巖, 肖連團(tuán), 賈鎖堂 申請人:山西大學(xué)