一種水產(chǎn)品中亞硝酸鹽、硝酸鹽和多聚磷酸鹽同時測定的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多種添加劑和污染物的檢測方法，特別涉及一種水產(chǎn)品中亞硝酸鹽、硝酸鹽和多聚磷酸鹽同時測定的檢測方法。本發(fā)明采用快速超聲輔助萃取-固相萃取-離子色譜法（UAE-SPE-IC）同時檢測水產(chǎn)品中的硝酸鹽、亞硝酸和多聚磷酸鹽，通過快速超聲輔助萃取，大大提高了硝酸鹽、亞硝酸鹽和多聚磷酸鹽的回收率，并結(jié)合C18小柱，有效去除了其他物質(zhì)的干擾，提高了實際檢測的靈敏度，且離子色譜法（IC）對電解系數(shù)較大的物質(zhì)尤其是陰離子具有較強的分離能力、可進行不同價態(tài)分析、檢測限低等優(yōu)點，本發(fā)明適合水產(chǎn)品中硝酸鹽、亞硝酸鹽和多聚磷酸鹽的定量檢測及食品安全監(jiān)測。
【專利說明】—種水產(chǎn)品中亞硝酸鹽、硝酸鹽和多聚磷酸鹽同時測定的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及多種無機鹽的檢測方法，特別涉及水產(chǎn)品中亞硝酸鹽、硝酸鹽和多聚磷酸鹽同時檢測的方法。
【背景技術】
[0002]海產(chǎn)品中的硝酸鹽在細菌和酶的作用下會還原成亞硝酸鹽。一些儲存時間較長、有腐敗變質(zhì)傾向且蛋白質(zhì)含量較高的海產(chǎn)品其所含亞硝酸含量更高。亞硝酸鹽可使血液的載氧能力下降，導致高鐵血紅蛋白癥。其與胺類結(jié)合可形成亞硝胺，誘發(fā)消化系統(tǒng)的癌變。關于亞硝酸鹽中毒的事件也時有報道。為控制人體對硝酸和亞硝酸的攝入量，硝酸和亞硝酸被列為食品衛(wèi)生標準中的重要指標，我國對食品中硝酸和亞硝酸鹽提出明確的限量標準。目前，水產(chǎn)品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定方法主要有離子色譜法、分光光度法、示波極譜法等，分光光度法、示波極譜法需分步測定硝酸和亞硝酸，且操作繁瑣，靈敏度低。離子色譜法可同時檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽。
[0003]磷酸鹽可分為正磷酸鹽和縮聚磷酸鹽:正磷酸鹽指正磷酸(Η3Ρ04)的各種鹽。正磷酸鹽加熱脫水縮合形成縮聚磷酸鹽，其通式為Μη+2Ρη03η+1，式中Μ為一價金屬離子，η為磷原子數(shù)，當η增大時，磷酸鹽穩(wěn)定性變差。焦磷酸的各種鹽稱為焦磷酸鹽，Μ4Ρ207 ;三磷酸的各種鹽稱為三聚磷酸鹽，Μ5Ρ301(ι ;分子含有3個以上的磷原子的縮聚磷酸鹽統(tǒng)稱為多聚磷酸鹽，偏磷酸鹽分子式為(ΜΡ03)η。目前，在水產(chǎn)加工中，多聚磷酸鹽主要是指焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽。多聚磷酸鹽是一類性能優(yōu)異的保水劑和抗凍劑，被許多水產(chǎn)企業(yè)大量用于海產(chǎn)品特別是冷凍海產(chǎn)品的加工和保存過程中，用來提高海產(chǎn)品的有效持水能力，并有效延長海產(chǎn)品的貨架期，減少解凍后的流滴損失。同時，有研究證明多聚磷酸鹽對水產(chǎn)品中的微生物生長有抑制作用。近些年來，有一些不法商販利用了多聚磷酸鹽可以加大水產(chǎn)品吸水性、抑制微生物生長等特點，在商品中人為注水，以次充好，以少充多。但是，人體如過多地攝入磷酸鹽，則會降低鈣吸收導致肌體鈣磷失衡，繼而引發(fā)疾病，因此各國對水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽含量作了明確的限量要求。目前，國內(nèi)還沒有檢測水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽含量的國家標準和行業(yè)標準。傳統(tǒng)檢測多聚磷酸鹽的方法多用雙氧水和硫酸將磷酸鹽的多聚體轉(zhuǎn)化為正磷酸鹽，然后用離子色譜法進行檢測。但是水產(chǎn)品中本身就具有一定含量的正磷酸鹽，因此，用這種方法并不能準確的測定多聚磷酸鹽的含量。也有一些科研工作者曾嘗試不同的前處理方法，對海產(chǎn)品進行提取后用核磁共振法直接檢測多聚磷酸鹽，但由于設備昂貴，效果也不甚理想。楊敏等人采用離子色譜法測定白菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、及總磷、總氮。但是不能對不同的磷酸鹽進行定量。由于生物體本身含有一定的磷酸，因此該方法依舊不能同時測定硝酸鹽、亞硝酸鹽及多聚磷酸鹽。離子色譜法對水產(chǎn)品中污染物及添加劑的測定是目前研究熱點，但至今尚未建立一種快速超聲輔助提取-固相萃取-離子色譜法(UAE-SPE-1C)同時檢測水產(chǎn)品中的硝酸鹽、亞硝酸鹽和多聚磷酸鹽的檢測方法。國內(nèi)已經(jīng)在申報的相關的發(fā)明專利有申請?zhí)?01210014139.2、申請日2012-01-18公開的一種檢測酸腌菜中亞硝酸鹽、硝酸鹽的方法，但是這些方法實際檢測時靈敏度不高，對于同時檢測水產(chǎn)品中的硝酸鹽、亞硝酸鹽和多聚磷酸鹽快速檢測應用難度較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種水產(chǎn)品中亞硝酸鹽、硝酸鹽和多聚磷酸鹽同時測定的檢測方法，該方法定量分析結(jié)果可靠、檢測限低、適用于同時測定水產(chǎn)品中硝酸鹽、亞硝酸鹽和多聚磷酸鹽(包括正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽)快速檢測。
[0005]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0006]一種水產(chǎn)品中亞硝酸鹽、硝酸鹽和多聚磷酸鹽同時測定的檢測方法，該方法包括如下步驟:
[0007]a、樣品前處理:將待測的水產(chǎn)品樣品充分混勻并攪碎，裝入容器內(nèi)，密封、冷藏備用；
[0008]b、快速超聲輔助提取:準確稱取經(jīng)前處理的水產(chǎn)品樣品放于玻璃容器中，加入適量超純水制成均質(zhì)系統(tǒng)，封蓋后超聲波提??；
[0009]c、蛋白質(zhì)沉淀:將超聲波提取后的樣品倒入離心管中，離心過濾，取濾液與三氟乙酸溶液混合，濾液與三氟乙酸溶液的體積比為20:3-4，0-4°C保存；
[0010]d、固相萃取:將蛋白質(zhì)沉淀后的樣品離心，過濾后對濾液采用C18柱進行固相萃取，過柱液經(jīng)尼龍濾膜過濾后收集于5mL自動進樣器樣品瓶中，供離子色譜儀測定；
[0011]e、離子色譜分析；
[0012]f、標準曲線的制備，取硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽配制成系列濃度，求出回歸方程與相關系數(shù)，根據(jù)標準曲線以確定被檢測樣品中硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽的含量。
[0013]本發(fā)明采用快速超聲輔助提取-固相萃取-離子色譜法(UAE-SPE-1C)同時檢測水產(chǎn)品中的硝酸鹽、亞硝酸和多聚磷酸鹽，通過快速超聲輔助提取，大大提高了硝酸鹽、亞硝酸鹽和多聚磷酸鹽的回收率，并結(jié)合C18小柱，有效去除了其他物質(zhì)的干擾，提高了實際檢測的靈敏度，且離子色譜法(1C)對電解系數(shù)較大的物質(zhì)尤其是陰離子具有較強的分離能力、可進行不同價態(tài)分析、檢測限低等優(yōu)點，本發(fā)明適合水產(chǎn)品中硝酸鹽、亞硝酸鹽和多聚磷酸鹽的定量檢測及食品安全監(jiān)測。
[0014]作為優(yōu)選，前處理中所用到的實驗用水均為超純水，電阻率18.2ΜΩ.cm。
[0015]作為優(yōu)選，快速超聲輔助提取的條件為:樣品經(jīng)均質(zhì)后，超聲波振蕩提取30min，每5min振搖一次，以保持固相完全分散。
[0016]作為優(yōu)選，三氟乙酸溶液的體積濃度為20%。步驟c中沉淀劑采用三氟乙酸，通常采用20%的濃度，沉淀效果較好，若待測樣品蛋白質(zhì)含量較少，可適當降低三氟乙酸濃度。
[0017]作為優(yōu)選，SPE固相萃取C18柱上樣前，用5mL甲醇進行活化后15mL高純水進行清洗，流速小于3mL / min,樣品過柱時前處理柱保持垂直。
[0018]作為優(yōu)選，步驟e中色譜條件為:色譜柱:分離柱:1nPac AS11 一 HC ;保護柱1nPac AG11 — HC ;淋洗液:Κ0Η 溶液，流速 1.0mL/min ；AMMS-1CE300 (4mm)抑制器自動抑制模式，抑制電流200mA，抑制型電導檢測器檢測；柱溫:30.0°C ;進樣量:30.0μ L ;外接水模式；以保留時間定性，峰面積定量。[0019]作為優(yōu)選，步驟e中的淋洗液梯度程序具體為:0-10min內(nèi)，濃度為6mM/L，之后將濃度降低到2mM/L并穩(wěn)定1分鐘，ll-20min內(nèi)保持濃度2mM/L，再在lmin內(nèi)將濃度調(diào)整并穩(wěn)定在25mM/L,保持5min, 26min_28min之間將濃度繼續(xù)升高至60mM/L,并保持至31min,之后將濃度降低至25mM/L，對色譜柱進行沖洗，并在45min時，結(jié)束整個檢測流程。
[0020]作為優(yōu)選，所述的步驟還包括回收率實驗。
[0021]作為優(yōu)選，該方法具體步驟如下:
[0022]a、樣品前處理:將待測的水產(chǎn)品樣品充分混勻并攪碎，裝入容器內(nèi)，密封、冷藏備用；
[0023]b、快速超聲輔助提取:準確稱取經(jīng)前處理的水產(chǎn)品樣品放于玻璃容器中，加入50mL超純水制成均質(zhì)系統(tǒng)，封蓋后超聲波提取30min ；
[0024]c、蛋白質(zhì)沉淀:將超聲波提取后的樣品倒入離心管中，7000r/min離心lOmin,過濾，取濾液20mL，加3mL體積濃度為20%的三氟乙酸溶液混合，0_4°C保存30分鐘；
[0025]d、固相萃取:將蛋白質(zhì)沉淀后的樣品8000rpm離心10分鐘，過濾后將濾液過活化好的C18柱，去除初過柱液3mL，盛接過柱液，0.22 μ m尼龍濾膜過濾后收集于5mL自動進樣器樣品瓶中，供ISC-3000離子色譜儀測定；
[0026]e、離子色譜分析:采用陰離子色譜柱，外接水模式，KOH自動發(fā)生裝置，梯度淋洗，抑制型電導檢測；
[0027]f、標準曲線的制備，取硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽配制成系列濃度，求出回歸方程與相關系數(shù)，根據(jù)標準曲線以確定被檢測樣品中硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽的含量。
[0028]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0029]1、應用范圍廣。本發(fā)明可加強水產(chǎn)品中亞硝酸鹽，硝酸鹽及多聚磷酸鹽的監(jiān)控，有利于水產(chǎn)品流通環(huán)節(jié)中的監(jiān)控減少水產(chǎn)品中亞硝酸鹽和多聚磷酸鹽中毒事件，保障食品安全。
[0030]2、本發(fā)明采用了快速超聲輔助提取(UAE)進行提取，利用其空化效應、強化擴散等理化特性對目標產(chǎn)物進行提取，與傳統(tǒng)提取方法相比，具有快速、常溫、能耗低、提取率高等優(yōu)點。提高了提取效率，且經(jīng)濟環(huán)保。
[0031]3、本發(fā)明采用了離子色譜法對亞硝酸、硝酸鹽和多聚磷酸鹽進行測定，該法是目前測定無機陰離子的首選方法，且能對不同價態(tài)的離子進行分離。本方法中以水作為流動相，無需特殊試劑，對環(huán)境和人員健康不產(chǎn)生有害影響。
[0032]4、本發(fā)明采用了 KOH自動發(fā)生淋洗液裝置，可在短時間內(nèi)產(chǎn)生準確濃度的淋洗液，適合于進行梯度，可將硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽及三種多聚磷酸鹽有效分離，且去除水產(chǎn)品中常見陰離子的干擾。
[0033]5、本發(fā)明采用了快速超聲輔助提取-固相萃取-離子色譜法(UAE-SPE-1C)檢測水產(chǎn)品中的硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽及三偏磷酸鹽，大大提高了回收率，并結(jié)合C18柱，有效去除了其他物質(zhì)的干擾，提高了實際檢測的靈敏度，且通過梯度淋洗具有較強的分離能力、檢測限低等優(yōu)點，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，具有更好的利用價值。
[0034]6、儀器自動進樣，適合大批量生物樣品的檢測。
[0035]7、本發(fā)明的方法實現(xiàn)了水產(chǎn)品中多種有毒有害物質(zhì)的同時檢測，有效降低了測試成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為亞硝酸鹽、硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽的標準色譜圖，其中1-亞硝酸鹽、2-硝酸鹽、3-正磷酸鹽、4-焦磷酸鹽、5-三聚磷酸鹽、6-三偏磷酸鹽；
[0037]圖2為亞硝酸鹽、硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽與常見陰離子色譜圖，其中 1-F-，2-C1-，3-N02—，4-Br_，5-N03—，6-S042—，7_Ρ043_，8_Ρ2074_，9-Ρ301(ι5—，10-ΡΑ3-；
[0038]圖3為實施例1中空白樣品離子色譜圖，其中1-亞硝酸根，2-正磷酸根；
[0039]圖4為實施例1中樣品加標離子色譜圖，其中1-亞硝酸鹽、2-硝酸鹽、3-正磷酸鹽、4-焦磷酸鹽、5-三聚磷酸鹽、6-三偏磷酸鹽。
【具體實施方式】
[0040]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。
[0041]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。
[0042]實施例1離子色譜法同時測定魚肉中亞硝酸鹽、硝酸鹽和多聚磷酸鹽
[0043]1、樣品前處理:
[0044]將待測的魚肉樣品充分混勻并攪碎，裝入容器內(nèi)，密封、冷藏(_18°C)備用；
[0045]2、快速超聲輔助提取(UAE):
[0046]稱取經(jīng)組織搗碎后的樣品5g (精確到0.lg)于150mL錐形瓶中，加50mL去離子水，均質(zhì)后置超聲波震蕩器中超聲30min,每5min振搖一次，以保持固相完全分散。然后以7000r/min離心lOmin,過濾,取濾液20mL,加3mL20%三氟乙酸溶液混合,放入0_4°C冰箱中保存30分鐘，再在8000rpm的離心機中離心10分鐘。
[0047]3、固相萃取(SPE):
[0048]取SPE固相萃取C18柱，先用5mL甲醇進行活化后用15mL高純水進行清洗，流速小于3mL / min。取步驟2中離心后的樣品，過濾后,將濾液以小于3mL / min的流速過垂直放置的SPE-C18柱，棄去前3mL流出液，取2mL流出液。取0.5mL用去離子水定容至5mL，于自動進樣器進樣瓶中上機待測。
[0049]4、離子色譜分析:
[0050]離子色譜條件:分離柱:1nPac AS 11-HC ;保護柱1nPac AG11-HC ;淋洗液:Κ0Η溶液梯度淋洗，流速1.0mL/min ;抑制器:AMMS-1CE300 (4_)抑制器，自動抑制模式自動抑制模式，抑制電流200mA ;檢測器:抑制型電導檢測器；進樣量:30μ L ;柱溫:30°C (樣品為步驟3得到的水溶液)；以保留時間定性，峰面積定量。
[0051]淋洗液梯度程序:Κ0Η淋洗液自動發(fā)生，外接水模式。0-10min內(nèi)，濃度為6mM/L，之后將濃度降低到2mM/L并穩(wěn)定1分鐘，ll-20min內(nèi)保持濃度2mM/L，再在lmin內(nèi)將濃度調(diào)整并穩(wěn)定在25mM/L,保持5min, 26min_28min之間將濃度繼續(xù)升高至60mM/L,并保持至31min,之后將濃度降低至25mM/L，對色譜柱進行沖洗，并在45min時，結(jié)束整個檢測流程。淋洗液梯度程序具體見表1。
[0052]表1梯度洗脫程序
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種水產(chǎn)品中亞硝酸鹽、硝酸鹽和多聚磷酸鹽同時測定的檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟:a、樣品前處理:將待測的水產(chǎn)品樣品充分混勻并攪碎，裝入容器內(nèi)，密封、冷藏備用；b、快速超聲輔助提取:準確稱取經(jīng)前處理的水產(chǎn)品樣品放于玻璃容器中，加入適量超純水制成均質(zhì)系統(tǒng)，封蓋后超聲波提??；c、蛋白質(zhì)沉淀:將超聲波提取后的樣品倒入離心管中，離心過濾，取濾液與三氟乙酸溶液混合，濾液與三氟乙酸溶液的體積比為20:3-4，0-4°C保存；d、固相萃取:將蛋白質(zhì)沉淀后的樣品離心，過濾后對濾液采用C18柱進行固相萃取，過柱液經(jīng)尼龍濾膜過濾后收集于5mL自動進樣器樣品瓶中，供離子色譜儀測定；e、離子色譜分析；f、標準曲線的制備，取硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽配制成系列濃度，求出回歸方程與相關系數(shù)，根據(jù)標準曲線以確定被檢測樣品中硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:快速超聲輔助提取的條件為:樣品經(jīng)均質(zhì)后，超聲波振蕩提取30min,每5min振搖一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 或2所述的檢測方法，其特征在于:三氟乙酸溶液的體積濃度為20%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于:固相萃取C18柱上樣前，用5mL甲醇進行活化后15mL高純水進行清洗，流速小于3mL / min，樣品過柱時前處理柱保持垂直。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:步驟e中色譜條件為:色譜柱:分離柱:1nPac AS11 一 HC ;保護柱 1nPac AG11 一 HC ;淋洗液:K0H 溶液，流速 1.0 mL/min ；AMMS-1CE 300 (4mm)抑制器自動抑制模式，抑制電流200 mA，抑制型電導檢測器檢測；柱溫:30.0°C ;進樣量:30.0--L ;外接水模式。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的檢測方法，其特征在于:步驟e中的淋洗液梯度程序具體為:0-10min內(nèi)，濃度為6mM/L，之后將濃度降低到2mM/L并穩(wěn)定1分鐘，ll_20min內(nèi)保持濃度2mM/L，再在lmin內(nèi)將濃度調(diào)整并穩(wěn)定在25mM/L，保持5min，26min-28min之間將濃度繼續(xù)升高至60 mM/L，并保持至31min，之后將濃度降低至25 mM/L，對色譜柱進行沖洗，并在45min時，結(jié)束整個檢測流程。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟:a、樣品前處理:將待測的水產(chǎn)品樣品充分混勻并攪碎，裝入容器內(nèi)，密封、冷藏備用；b、快速超聲輔助提取:準確稱取經(jīng)前處理的水產(chǎn)品樣品放于玻璃容器中，加入50mL超純水制成均質(zhì)系統(tǒng)，封蓋后超聲波提取30min ；c、蛋白質(zhì)沉淀:將超聲波提取后的樣品倒入離心管中，7000r/min離心10min,過濾，取濾液20mL，加3 mL體積濃度20%的三氟乙酸溶液混合，0_4°C保存30分鐘；d、固相萃取:將蛋白質(zhì)沉淀后的樣品8000rpm離心10分鐘，過濾后將濾液過活化好的C18柱，去除初過柱液3 mL，盛接過柱液，0.22--m尼龍濾膜過濾后收集于5mL自動進樣器樣品瓶中，供ISC-3000離子色譜儀測定；e、離子色譜分析:采用陰離子色譜柱，外接水模式，K0H自動發(fā)生裝置，梯度淋洗，抑制型電導檢測；f、標準曲線的制備，取硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽配制成系列濃度，求出回歸方程與相關系數(shù)，根據(jù)標準曲線以確定被檢測樣品中硝酸鹽、亞硝酸鹽、正磷酸鹽、焦磷 酸鹽、三聚磷酸鹽和三偏磷酸鹽的含量。
【文檔編號】G01N30/06GK103675118SQ201310574027
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】邵宏宏 申請人:舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心