云芝及含有云芝的制劑的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，該方法以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖等單糖碎片為評價指標(biāo)，采用超高效液相色譜法或高效液相色譜法對云芝及含有云芝的制劑的多糖水解后的單糖碎片進(jìn)行檢測，建立其特征圖譜及含量測定的質(zhì)量控制和評價方法，此方法可用于云芝藥材以及含云芝藥材、云芝提取物或云芝有效部位制劑的質(zhì)量控制和評價。本發(fā)明對云芝及含有云芝的制劑多糖水解后的單糖碎片進(jìn)行控制，以此評價其藥材和制劑的質(zhì)量。該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，操作簡便，易于控制，能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，具有較高實(shí)用價值。
【專利說明】云芝及含有云芝的制劑的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，具體涉及云芝藥材以及含有云芝、或云芝有效部位、或云芝有效部位群的制劑的質(zhì)量控制和評價方法。
【背景技術(shù)】
[0002]云芝為多孔菌科真菌彩絨革蓋菌Coriolus versicolor (L.ex Fr.) Quel干燥子實(shí)體。東漢時期《神農(nóng)本草經(jīng)》已有記載以云芝治療癌癥，《本草綱目》記載云芝有安神、益壽、利關(guān)節(jié)、堅筋骨、治耳聾作用?，F(xiàn)代研究表明，從云芝中提取的云芝多糖用于腫瘤患者的輔助治療，能顯著提高癌癥病人的生存質(zhì)量，增強(qiáng)免疫，減少繼發(fā)感染，緩解病痛，改善癌癥患者的食欲減退作用。由于云芝多糖的獨(dú)特活性與低毒效應(yīng)在臨床應(yīng)用中具有極大的潛力，針對云芝多糖類成分開發(fā)的保健品、藥品日益增加，1977年，從云芝中提取純化的云芝多糖(PSK)，在日本被開發(fā)成抗癌新藥Krestin ; 1998年，以從云芝中提取純化得到的云芝多糖肽(PSP)為主要成分的云芝糖肽膠囊正式獲得我國衛(wèi)生部的正式生產(chǎn)批準(zhǔn)文號，目前已上市產(chǎn)品有云芝糖肽、云芝菌膠囊、云芝肝泰片、云芝肝泰膠囊等。目前，國內(nèi)總多糖含量測定主要采取紫外分光光度法進(jìn)行，經(jīng)典的顯色體系有苯酚-硫酸法(λ max=490nm)和蒽酮-硫酸法(Xmax= 630nm),均選擇無水葡萄糖為對照品。也有采用滴定法測定總多糖含量的，常用有斐林氏滴定法和間接碘量滴定法。如2010版《中國藥典》中，云芝藥材中的總多糖含量測定就采用的是間接碘量法。由于云芝藥材及其制劑大多為有色樣品，應(yīng)用此類方法測定樣品中的云芝總多糖時，方法的干擾因素多，結(jié)果準(zhǔn)確度、專屬性差。在國外對多糖的質(zhì)量控制多采用高效凝膠色譜法測定多糖分子量及其分布，這也是對多糖產(chǎn)品質(zhì)控手段之一，其對純度較高的多糖產(chǎn)品質(zhì)量控制較好，能有效的評價該產(chǎn)品的真?zhèn)?。國?nèi)云芝類產(chǎn)品也有采用高效凝膠色譜法測定多糖分子量及其分布，以此來評價該類產(chǎn)品的質(zhì)量，此方法能在一定程度上控制產(chǎn)品的質(zhì)量，但對于主要含多糖類成分的云芝藥材及其制劑的質(zhì)量控制方法較少，由于它們所含的有效多糖是一大類，很難對其多糖含量、分子量分布范圍來評價藥材及其制劑質(zhì)量的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，該評價方式不能反映它們整體的內(nèi)在質(zhì)量變化，存在一定的不合理性和不科學(xué)性，且專屬性也較差。同時，云芝藥材及其制劑中多糖分子組成、空間結(jié)構(gòu)不同，而以相應(yīng)對照品測得的樣品多糖的分子量，并非分子量的絕對值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、操作簡便的云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，以便更好進(jìn)行質(zhì)量控制和評價。
[0004]本發(fā)明根據(jù)云芝藥材及其制劑多糖的單糖組成是其一級結(jié)構(gòu)的主要內(nèi)容，是其空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，首先需要將其多糖進(jìn)行完全酸水解為單糖類物質(zhì)之后，其中所含單糖的成分、各單糖成分含量的相互比例應(yīng)該是具有物種唯一性和個體相似性的，因此，針對其開展的色譜分析，所獲的色譜圖譜具有較強(qiáng)的專屬性。采用液相色譜分離檢測技術(shù)，分析云芝藥材及其制劑中多糖的單糖組成，建立相應(yīng)的特征圖譜，通過運(yùn)用多糖中單糖組分特征圖譜的相對保留時間和相對峰面積來評價該藥材真?zhèn)?，該質(zhì)量控制和評價方法具有較強(qiáng)的專屬性和創(chuàng)新性。同時，在特征圖譜的基礎(chǔ)上，建立單糖組分定量測定，并制定各含量限度，通過對單糖質(zhì)量的控制可間接控制多糖的含量，以此質(zhì)量控制方法評價藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，該質(zhì)量控制和評價方法具有較高精確度和新穎性。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
取云芝藥材3~6g (加水適量，加熱回流提取，提取液離心，量取適量提取液，減壓濃縮至適量)或制劑0.5~Ig (加水使溶解),加入3~6倍體積的無水乙醇,分取沉淀,沉淀加水溶解，并加入稀硫酸(濃度為10%)，100-120°C加熱回流水解5-6小時，水解后溶液調(diào)pH至中性并定容，吸取上清液，置具塞試管中，加入NaOH溶液和PMP的甲醇溶液，于60~80°C衍生化反應(yīng)30-60min，反應(yīng)完全后調(diào)PH至中性并定容，取上清液加等體積三氯甲烷振搖提取，棄去有機(jī)溶液，重復(fù)操作3次，水溶液減壓濃縮至適量用乙腈定容，作為供試品溶液；取D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖和L-巖藻糖對照品適量，加水溶解，按上述供試品溶液的衍生方法制備混合對照品溶液，分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液，注入高效液相色譜儀或超高效液相色譜儀，測定各單糖含量。其中超高效液相色譜檢測條件是:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流速為0.3~1.0毫升/分鐘；檢測波長245nm ;以乙腈為流動相A，以磷酸緩沖鹽溶液(稱取K2HPO4 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸調(diào)pH至6.5，并加水稀釋至1000mL)為流動相B，流動相梯度洗脫表:
【權(quán)利要求】
1.一種云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，其特征在于云芝及含有云芝的制劑采用醇沉提取粗多糖，用酸水解多糖成單糖碎片，再對單糖衍生反應(yīng)制成供試品溶液，采用超高效液相色譜法或/和高效液相色譜法檢測供試品溶液中的甘露糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖的單糖碎片的特征圖譜及其各單糖的含量，建立特征圖譜，通過各單糖的特征峰的相對保留時間或/和峰面積以及含量來控制和評價云芝藥材及其制劑的質(zhì)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，其特征在于:所述的供試品溶液的制備方法是: 取云芝藥材3~6g，加水適量，加熱回流提取，提取液離心，量取適量提取液，減壓濃縮至適量，或取云芝制劑0.5~lg，加水使溶解；加入3~6倍體積的無水乙醇，分取沉淀，沉淀加水溶解，并加入重量含量10%的稀硫酸，100-120°C加熱回流水解5-6小時，水解后溶液調(diào)pH至中性并定容，吸取上清液，置具塞試管中，加入0.5mol/L的NaOH溶液和PMP的甲醇溶液，于60~80°C衍生化反應(yīng)30-60min，反應(yīng)完全后調(diào)pH至中性并定容，取上清液加等體積三氯甲烷振搖提取，棄去有機(jī)溶液，重復(fù)操作3次，水溶液減壓濃縮至適量用乙腈定容，作為供試品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，其特征在于，所述的超高效液相色譜檢測條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流速為0.3~1.0毫升/分鐘；檢測波長245nm ;以乙腈為流動相A，以磷酸緩沖鹽溶液為流動相B，進(jìn)行流動相梯度洗脫； 所述的磷酸緩沖鹽溶液配置方法:稱取K2HPO4 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸調(diào)pH至6.5，并加水稀釋至1000mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，其特征在于:所述的高效液相色譜檢測條件是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流速為0.8~1.5毫升/分鐘；檢測波長245nm ；以乙腈為流動相A，以磷酸緩沖鹽溶液(稱取K2HPO4 4.4g，加水800mL溶解，加磷酸調(diào)PH至6.5，并加水稀釋至1000mL)為流動相B，進(jìn)行流動相梯度洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，其特征在于:所述的特征圖譜的建立方法是:取D-甘露糖、D-葡萄糖、半乳糖和L-巖藻糖對照品適量，加水溶解，按權(quán)利要求2所述的“供試品溶液”的衍生方法制備混合對照品溶液，分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，測定各單糖含量；供試品溶液的特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖4個特征峰，其應(yīng)分別與相應(yīng)的參照物峰的保留時間相一致，以其中任意一個參照物峰相對應(yīng)的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間、相對峰面積，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5~10%范圍之內(nèi)，相對峰面積可上下浮動10 ~30%O
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，其特征在于，通過各單糖的特征峰的相對保留時間或/和峰面積以及含量來控制和評價云芝藥材及其制劑的質(zhì)量: (I)云芝提取物真?zhèn)舞b別: 以半乳糖參照物峰相對應(yīng)的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)，規(guī)定值為:甘露糖0.5、葡萄糖0.9、半乳糖1.0、巖藻糖 1.1 ;以半乳糖參照物峰相對應(yīng)的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對峰面積，其相對峰面積應(yīng)在規(guī)定值的±30%范圍之內(nèi)，相對峰面積規(guī)定值為:甘露糖0.6、葡萄糖16.5、半乳糖.1.0、巖藻糖0.4; (2)云芝藥材真?zhèn)舞b別: 以半乳糖參照物峰相對應(yīng)的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)，規(guī)定值為:甘露糖0.5、葡萄糖0.9、半乳糖1.0、巖藻糖 1.1 ; 以半乳糖參照物峰相對應(yīng)的峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對峰面積，其相對峰面積應(yīng)在規(guī)定值的±30%范圍之內(nèi)；相對峰面積規(guī)定值為:甘露糖0.8、葡萄糖22.5、半乳糖.1.0、巖藻糖0.3 ； 各特征峰存在，相對保留時間和相對峰面積符合要求，以此可評價云芝及含有云芝的制劑的的真?zhèn)危? (3)質(zhì)量評價: A、云芝藥材含云芝多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖總量計，不得少于4.0% ； B、云芝提取物含云芝多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖總量計，不得少于25%; 以甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖單糖總量評價云芝及含有云芝的制劑的優(yōu)劣。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的云芝及含有云芝的制劑的檢測方法，其特征在于，該方法在云芝藥材，含有云芝的制劑，包括云芝單味藥材提取物、云芝有效部位或云芝有效部位群的 復(fù)方制劑的質(zhì)量控制和評價方面的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N30/02GK103604879SQ201310546455
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】韋紅言, 溫慶偉, 周永強(qiáng), 覃艷霞, 寧平行 申請人:培力(南寧)藥業(yè)有限公司