專利名稱：一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米功能材料、環(huán)境檢測、免疫分析及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙通道環(huán)境雌激素電化學免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大量環(huán)境有害物質(zhì)隨著人類的生產(chǎn)活動進入人類生活環(huán)境，對人類的健康產(chǎn)生極大危害。環(huán)境雌激素能夠通過影響人類腎上腺、甲狀腺等人體重要的內(nèi)分泌腺體，使其不正常分泌，從而造成人體神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的功能障礙，嚴重影響人類身心健康。環(huán)境雌激素對人類生殖、發(fā)育和自身免疫性疾病影響極大，早已引起了人們的廣泛關(guān)注。環(huán)境雌激素種類繁多，大致分為以下幾類:(1)農(nóng)藥類，如狄試劑，DDT等；(2)類固醇類，如雌二醇，雌酮等；(3)多氯聯(lián)苯類，如多氯聯(lián)苯等；(4)雙酚類，如雙酚A，壬基酚等；(5) 二惡英類，如T⑶D等；(6)酞酸酯類，如DMP等；(7)金屬化合類，如三丁基錫。其中雌二醇、己烯雌酚、雌酮等在環(huán)境中最為常見。雌二醇是一種人體自然分泌的激素，雖然對女性的正常發(fā)育有增進和調(diào)節(jié)作用，但過量攝入、不當攝入等對人類身體會有很大危害。另外，因為它能夠改善牲畜瘦肉比，在禽畜飼養(yǎng)中也有應(yīng)用。這就可能造成其在肉類中的殘留，通過食物鏈而影響人類健康，造成女性過早發(fā)育，男性乳房發(fā)育，生殖系統(tǒng)異變，甚至有致癌作用。因此檢測水體、肉類中的雌
二醇非常重要。己烯雌酚是一類人工合成的雌性激素，它具有和雌二醇相同的藥理和治療效果。懷孕期間如若服用己烯雌酚會對胎兒的健康產(chǎn)生極其嚴重的影響。它會造成胎兒的畸形、性特征逆轉(zhuǎn)、腦積水等病變，并對孕婦的肝、腎、膽囊、胰腺等造成損傷。
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在獸醫(yī)臨床中己烯雌酚也被用作于牲畜催情、助產(chǎn)等方面。己烯雌酚在食品動物中已被禁用，但還是有不法畜牧養(yǎng)殖商非法添加。雌酮是雌二醇的氧化產(chǎn)物，其生物學作用低于雌二醇。在人體、妊娠動物和孕婦體內(nèi)都有存在，它具有止血作用，但環(huán)境中的雌酮對人體肝臟、睪丸、心臟都有影響，而且會造成女性原發(fā)性或繼發(fā)性卵巢功能減退。對于環(huán)境雌激素的檢測方法有很多，如色譜學方法，免疫學方法，電化學方法、生物分析法等，但多數(shù)需要貴重儀器，其操作復雜，檢出限高，檢測物質(zhì)單一，因此，建立一種快速、簡便、靈敏、且能同時檢測多種物質(zhì)的檢測方法迫在眉睫。免疫傳感器是將免疫學方法和分析化學相結(jié)合的生物傳感器，通過抗原與抗體的特異性結(jié)合，使得它具有靈敏、選擇性高、快速、操作簡便等優(yōu)點。電化學免疫傳感器，結(jié)合了電化學方法，具有靈敏度高，選擇性好、結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便、易于小型化、可連續(xù)、快速自動化檢測分析等優(yōu)點，制備了一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器，實現(xiàn)了兩種環(huán)境雌激素的同時檢測。納米材料在光學、熱學、電學、磁學、力學以及化學方面的特殊性質(zhì)，使其在生產(chǎn)、生活、科研等各方面都有很廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明利用納米材料修飾傳感器，基于其特殊的物理化學性質(zhì)，從而達到修飾傳感器的目的。石墨烯納米層(GS)具有大的比表面積，催化性能好，能有效地吸附固載抗原，增強電子傳遞等優(yōu)點。氨基化介孔四氧化三鐵(AFMFe3O4)具有比表面積大、吸附性能好、原料低廉、制備簡單等優(yōu)點，能夠穩(wěn)定的固載抗體。本發(fā)明采用石墨烯增強電極的電子傳遞能力，利用氨基化介孔四氧化三鐵吸附金屬離子，區(qū)分標記環(huán)境雌激素抗體，從而增大檢測信號，并實現(xiàn)了兩種環(huán)境雌激素的同時檢測。經(jīng)對現(xiàn)有專利技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，目前CN102323323A公開了一種17β-雌二醇分子印跡膜電化學傳感器的制備方法，CN101059480A公開了一種玻碳電極修飾的電化學檢測方法，其靈敏度低于電化學免疫方法。CN101639478A公開了一種利用磁微?；瘜W發(fā)光免疫技術(shù)檢測雌二醇的試劑盒。CN102262125A公開了一種檢測己烯雌酚的電化學免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，實現(xiàn)對一種雌激素的檢測。本發(fā)明提供了一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，實現(xiàn)了兩種環(huán)境雌激素的同時檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之二是將所制備的雙通道免疫傳感器，用于同時檢測兩種環(huán)境雌激
素。 本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。1.一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(I)氨基化介孔四氧化三鐵(AFMFe3O4)的制備
I g FeCl3.6H20溶解于15 18 mL乙二醇，與3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均勻，強烈攪拌2(T30 min，裝入聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，于18(T200 °C加熱8 9 h，取出、冷卻至室溫，得到黑色固體，用超純水洗滌至中性，制得AFMFe3CV(2)吸附金屬離子的氨基化介孔四氧化三鐵(M2+-AFMFe3O4)的制備
分別量取8(T100 mL、濃度為8(Tl20 mg/L的Pb2+溶液和80 120 mg/L的Cd2+溶液置于錐形瓶中，分別加入8 10 mg的氨基化介孔四氧化三鐵，振蕩廣3 h，使Pb2+和Cd2+被氨基化介孔四氧化三鐵充分吸附，烘干，制得M2+-AFMFe3O4,即Pb2+-AFMFe3O4和Cd2+-AFMFe3O4,備用。(3) Pb2+-AFMFe3O4和Cd2+-AFMFe3O4標記的抗體孵化物的制備
I)將 0.5 mL、2 5mg/L 的 Pb2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.4^0.6 mL、pH 7.(Γ7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3 5μ L—種環(huán)境雌激素抗體(Ab1)，振蕩1(T12 h后離心，用pH 7.(Γ7.8的PBS溶液定容至ImL,制得Pb2+金屬離子標記的抗體孵化物(Pb2+-AFMFe3O4Ab1),置于4°C冰箱中備用。2)將 0.5 mL、2 5 mg/L 的 Cd2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.4^0.6 mL、ρΗ7.(Γ7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3 5 μ 另一種環(huán)境雌激素抗體(Ab2)，振蕩10 12 h后離心，用pH 7.0 7.8的PBS溶液定容至I mL，制得另一種金屬離子標記的抗體孵化物(Cd2+-AFMFe304/Ab2)，置于4°C冰箱中備用。
(4)一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法
1)將3 5yL、2 mg/mL超聲處理分散均勻的石墨烯,滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干。2)分別將3 5 μ 的兩種環(huán)境雌激素標準溶液滴涂在I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中干燥。3)滴涂5 7 μ ,ΙΟΟ.mL-1的牛血清白蛋白于2)中得到的工作電極表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干。4)分別取:Γ5 μ I中(3)所制備的兩種金屬離子標記的抗體孵化物Pb2+-AFMFe3O4Ab1和Cd2+-AFMFe3O4Ab2滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器。2.如上所述的制備的一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器，用于兩種環(huán)境雌激素的同時檢測，包括如下步驟:
(I)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 5.(Γ5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入200μ 、3(Γ50 mg/L的Hg2+溶液，用計時電流法將電壓設(shè)置為-1 V沉積40^60 S，使Hg2+沉積在電極表面形成Hg膜。(2)采用循環(huán)伏安法(CV)在-1.(Γ0.1 V電壓范圍掃描，檢測Hg2+是否在工作電極上成膜，并使Hg與M形成汞 齊。(3 )經(jīng)步驟(2 )處理后的工作電極反復經(jīng)步驟(I)和(2 )處理4飛次，用計時電流法沉積3 5 min，工作電極處理完畢。(4)由(3)得到的工作電極用方波伏安法(SWV)進行測試，電壓設(shè)置為-1.0 0.1V，根據(jù)所得電流強度與兩種環(huán)境雌激素標準溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。(5)將待測樣品代替兩種環(huán)境雌激素的標準溶液，按照所述兩種環(huán)境雌激素工作曲線的繪制方法進行檢測。3.如上所述的環(huán)境雌激素選自下列任意兩種:己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17 α -乙炔基雌二醇。所述一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器，所用原材料均可在化學試劑公司或生物制藥公司購買。本發(fā)明的有益成果
(1)使用了吸附金屬離子的氨基化介孔四氧化三鐵(M2+-AFMFe3O4),提高了傳感器的靈敏度；
(2)利用M2+-AFMFe3O4標記抗體制得的孵化物，增大了傳感器電流響應(yīng)；
(3)使用完全相同的材料、修飾方法和檢測方法，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，只需改變環(huán)境雌激素抗體種類即可實現(xiàn)對另外兩種環(huán)境雌激素的高靈敏同時檢測，顯著提高了檢測效率。
具體實施方式
實施例1
AFMFe3O4和M2+-AFMFe3O4的制備，包括以下步驟:
(I)氨基化介孔四氧化三鐵(AFMFe3O4)的制備
I g FeCl3.6H20溶解于15 mL乙二醇，與3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均勻，強烈攪拌20 min，裝入聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，于180°C加熱8 h，取出、冷卻至室溫，得到黑色固體，用超純水洗滌至中性，制得AFMFe3O4。(2)吸附金屬離子的氨基化介孔四氧化三鐵(M2+-AFMFe3O4)的制備
分別量取80 mL、濃度為80 mg/L的Pb2+溶液和80 mg/L的Cd2+溶液置于錐形瓶中，分別加入8 mg的氨基化介孔四氧化三鐵，振蕩lh，使Pb2+和Cd2+被氨基化介孔四氧化三鐵充分吸附，烘干，制得 M2+-AFMFe3O4,即 Pb2+-AFMFe3O4 和 Cd2+-AFMFe3O4,備用。實施例2
AFMFe3O4和M2+-AFMFe3O4的制備，包括以下步驟:
(I)氨基化介孔四氧化三鐵(AFMFe3O4)的制備
I g FeCl3.6H20溶解于17 mL乙二醇，與3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均勻，強烈攪拌25 min，裝入聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，于190°C加熱8.5 h，取出、冷卻至室溫，得到黑色固體，用超純水洗滌至中性，制得AFMFe3CV
(2)吸附金屬離子的氨基化介孔四氧化三鐵(M2+-AFMFe3O4)的制備
分別量取90 mL、濃度為90 mg/L的Pb2+溶液和90 mg/L的Cd2+溶液置于錐形瓶中，分別加入9 mg的氨基化介孔四氧化三鐵，振蕩2 h，使Pb2+和Cd2+被氨基化介孔四氧化三鐵充分吸附，烘干，制得 M2+-AFMFe3O4,即 Pb2+-AFMFe3O4 和 Cd2+-AFMFe3O4,備用。實施例3
AFMFe3O4和M2+-AFMFe3O4的制備，包括以下步驟:
(I)氨基化介孔四氧化三鐵(AFMFe3O4)的制備
I g FeCl3.6H20溶解于18 mL乙二醇，與3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均勻，強烈攪拌30 min，裝入聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，于200 °C加熱9 h，取出、冷卻至室溫，得到黑色固體，用超純水洗滌至中性，制得AFMFe3O4。(2)吸附金屬離子的氨基化介孔四氧化三鐵(M2+-AFMFe3O4)的制備
分別量取100 mL、濃度為120 mg/L的Pb2+溶液和120 mg/L的Cd2+溶液置于錐形瓶中，分別加入10 mg的氨基化介孔四氧化三鐵，振蕩3 h，使Pb2+和Cd2+被氨基化介孔四氧化三鐵充分吸附，烘干，制得 M2+-AFMFe3O4,即 Pb2+-AFMFe3O4 和 Cd2+-AFMFe3O4,備用。實施例4
Pb2+-AFMFe3O4和Cd2+-AFMFe3O4標記的抗體孵化物的制備，包括以下步驟:
(I)將 0.5 mL、2mg/L 的 Pb2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.4 mL、pH 7.0的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3 μ L 一種環(huán)境雌激素抗體(Ab1),振蕩10 h后離心,用pH 7.0的PBS溶液定容至ImL,制得Pb2+金屬離子標記的抗體孵化物(Pb2+-AFMFe3O4Ab1 )，置于4° C冰箱中備用。(2)將 0.5 mL、2 mg/L 的 Cd2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.4 mL、pH 7.0的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3 μ L另一種環(huán)境雌激素抗體(Ab2)，振蕩10 h后離心，用pH 7.0的PBS溶液定容至I mL，制得另一種金屬離子標記的抗體孵化物(Cd2+-AFMFe304/Ab2)，置于4°C冰箱中備用。所述環(huán)境雌激素選自以下任意兩種:己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17 α-乙炔基雌二醇。實施例5
Pb2+-AFMFe3O4和Cd2+-AFMFe3O4標記的抗體孵化物的制備，包括以下步驟:
(I)將 0.5 mL、3mg/L 的 Pb2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.5 mL、pH 7.4的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入4 μ L —種環(huán)境雌激素抗體(Ab1),振蕩11 h后離心,用pH 7.4的PBS溶液定容至ImL,制得Pb2+金屬離子標記的抗體孵化物(Pb2+-AFMFe3O4Ab1),置于4°C冰箱中備用。(2)將 0.5 mL、3mg/L 的 Cd2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.5 mL、pH 7.4的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入4 μ L另一種環(huán)境雌激素抗體(Ab2),振蕩11 h后離心 ,用pH 7.4的PBS溶液定容至I mL,制得另一種金屬離子標記的抗體孵化物(Cd2+-AFMFe304/Ab2)，置于4°C冰箱中備用。所述環(huán)境雌激素選自以下任意兩種:己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17 α-乙炔基雌二醇。實施例6
Pb2+-AFMFe3O4和Cd2+-AFMFe3O4標記的抗體孵化物的制備，包括以下步驟:
(I)將 0.5 mL、5mg/L 的 Pb2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.6 mL、pH 7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入5 μ L 一種環(huán)境雌激素抗體(Ab1)，振蕩12 h后離心，用pH 7.8的PBS溶液定容至lmL，制得Pb2+金屬離子標記的抗體孵化物(Pb2+-AFMFe3O4Ab1),置于4°C冰箱中備用。(2)將 0.5 mL、5 mg/L 的 Cd2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.6 mL、pH 7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入5 μ 另一種環(huán)境雌激素抗體(Ab2)，振蕩12 h后離心，用pH 7.8的PBS溶液定容至I mL，制得另一種金屬離子標記的抗體孵化物(Cd2+-AFMFe304/Ab2)，置于4°C冰箱中備用。所述環(huán)境雌激素選自以下任意兩種:己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17 α-乙炔基雌二醇。實施例7
一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法
(I)將3 μ 、2 mg/mL超聲處理分散均勻的石墨烯,滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干。(2)分別將3 μ 的兩種環(huán)境雌激素標準溶液滴涂在(I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中干燥。(3)滴涂5 μ ,ΙΟΟ.mL—1的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作電極表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4 °C冰箱中晾干。(4)分別取3 PL上述制備的兩種金屬離子標記的抗體孵化物Pb2+-AFMFe3O4Ab1和Cd2+-AFMFe3O4Ab2滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器。所述環(huán)境雌激素選自以下任意兩種:己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17 α-乙炔基雌二醇。實施例8
一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法
(I)將4 μ 、2 mg/mL超聲處理分散均勻的石墨烯,滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干。(2)分別將4 μ 的兩種環(huán)境雌激素標準溶液滴涂在(I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中干燥。(3)滴涂6 μ ,ΙΟΟ Pg.ml/1的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作電極表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4 °C冰箱中晾干。(4)分別取4 μ 上所制備的兩種金屬離子標記的抗體孵化物Pb2+-AFMFe3O4Ab1和Cd2+-AFMFe3O4Ab2滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器。所述環(huán)境雌激素選自以下任意兩種:己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17 α-乙炔基雌二醇。實施例9
一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法
(I)將5 KL、2mg/mL超聲處理分散均勻的石墨烯,滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干。(2)分別將5PL的兩種`環(huán)境雌激素標準溶液滴涂在(I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中干燥。(3)滴涂7 μ ,ΙΟΟ.mL—1的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作電極表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4°C冰箱中晾干。(4)分別取5 PL上所制備的兩種金屬離子標記的抗體孵化物Pb2+-AFMFe3O4Ab1和Cd2+-AFMFe3O4Ab2滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器。所述環(huán)境雌激素選自以下任意兩種:己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17 α-乙炔基雌二醇。實施例10
兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇同時檢測，包括如下步驟:
(I)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入200 μ 、30 mg/L的Hg2+溶液，用計時電流法將電壓設(shè)置為-1 V沉積40 s,使Hg2+沉積在電極表面形成Hg膜。(2)采用循環(huán)伏安法(CV)在-1.(Γ0.1 V電壓范圍掃描，檢測Hg2+是否在工作電極上成膜，并使Hg與M形成汞齊。(3)經(jīng)步驟(2)處理后的工作電極反復經(jīng)步驟(I)和(2)處理4次，用計時電流法沉積3 min，工作電極處理完畢。(4)由(3)得到的工作電極用方波伏安法(SWV)進行測試，電壓設(shè)置為-1.(Γθ.1V，根據(jù)所得電流強度與兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇的標準溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。
(5)將待測樣品代替兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇的標準溶液，按照所述兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇工作曲線的繪制方法進行檢測。同時檢測雌二醇和己烯雌酚，實驗結(jié)果表明，雌二醇檢測范圍:0.05 pg/mL^lOOng/mL,檢出限0.015 pg/mL ;己烯雌酹檢測范圍:1 pg/mL 100 ng/mL,檢出限0.38 pg/mL。實施例11
兩種環(huán)境雌激素雌酮和雌三醇的同時檢測，包括如下步驟:
(1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入200 μ 、40 mg/L的Hg2+溶液，用計時電流法將電壓設(shè)置為-1 V沉積50 s,使Hg2+沉積在電極表面形成Hg膜。(2)采用循環(huán)伏安法(CV)在-1.(Γ0.1 V電壓范圍掃描，檢測Hg2+是否在工作電極上成膜，并使Hg與M形成汞齊。(3)經(jīng)步驟(2)處理后的工作電極反復經(jīng)步驟(I)和(2)處理5次，用計時電流法沉積4 min,工作電極處理完畢。(4)由(3)得到的工作電極用方波伏安法(SWV)進行測試，電壓設(shè)置為-1.(Γθ.1V，根據(jù)所得電流強度與兩種環(huán)境雌激素雌酮和雌三醇的標準溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。(5)將待測樣品代替兩種環(huán)境雌激素雌酮和雌三醇的標準溶液，按照所述兩種環(huán)境雌激素雌酮和雌三醇工作曲線的繪制方法進行檢測。同時檢測雌三醇和雌酮，實驗結(jié)果表明，雌三醇線性范圍為0.05 pg/mL^100 ng/mL ;檢出限可達到0.014pg/mL ;雌酮檢測范圍:0.50 pg/mL 100 ng/mL,檢出限0.15 pg/mL。實施例12
兩種環(huán)境雌激素炔雌醇和17 α -乙炔基雌二醇的同時檢測，包括如下步驟:
(I)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入200μ 、50 mg/L的Hg2+溶液，用計時電流法將電壓設(shè)置為-1 V沉積60 s,使Hg2+沉積在電極表面形成Hg膜。(2)采用循環(huán)伏安法(CV)在-1.(Γ0.1 V電壓范圍掃描，檢測Hg2+是否在工作電極上成膜，并使Hg與M形成汞齊。(3)經(jīng)步驟(2)處理后的工作電極反復經(jīng)步驟(I)和(2)處理6次，用計時電流法沉積5 min，工作電極處理完畢。(4)由(3)得到的工作電極用方波伏安法(SWV)進行測試，電壓設(shè)置為-1.(Γ0.1V，根據(jù)所得電流強度與兩種環(huán)境雌激素炔雌醇和17 α-乙炔基雌二醇的標準溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。(5)將待測樣品代替兩種環(huán)境雌激素炔雌醇和17 α -乙炔基雌二醇的標準溶液，按照所述兩種環(huán)境雌激素炔雌醇和17 α -乙炔基雌二醇的工作曲線的繪制方法進行檢測。同時檢測炔雌醇和17α-乙炔基雌二醇，實驗結(jié)果表明，炔雌醇線性范圍為
0.10pg/mL^100 ng/mL ;檢出限可達到0.021pg/mL ; 17 α -乙炔基雌二醇線性范圍為0.84pg/mL 100 ng/mL ;檢出限可達到 0.26 pg/mL ；
實施例13
兩種環(huán)境雌激素雌二醇和雌酮的同時檢測，包括如下步驟:
(I)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 5.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入200 μ 、35 mg/L的Hg2+溶液，用計時電流法將電壓設(shè)置為-1 V沉積60 s,使Hg2+沉積在電極表面形成Hg膜。(2)采用循環(huán)伏安法(CV)在-1.(Γ0.1 V電壓范圍掃描，檢測Hg2+是否在工作電極上成膜，并使Hg與M形成汞齊。(3)經(jīng)步驟(2)處理后的工作電極反復經(jīng)步驟(I)和(2)處理6次，用計時電流法沉積4 min,工作電極處理完畢。(4)由(3)得到的工作電極用方波伏安法(SWV)進行測試，電壓設(shè)置為-1.(Γθ.1V，根據(jù)所得電流強度與兩種環(huán)境雌激素雌二醇和雌酮的標準溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。(5)·將待測樣品代替兩種環(huán)境雌激素雌二醇和雌酮的標準溶液，按照所述兩種環(huán)境雌激素雌二醇和雌酮的工作曲線的繪制方法進行檢測。同時檢測雌二醇和雌酮，實驗結(jié)果表明，其線性范圍為0.050 pg/mL^100 ng/mL ；檢出限可達到0.015 pg/mL ;雌酮檢測范圍:0.50 pg/mL 100 ng/mL,檢出限0.15 pg/mL。實施例14
兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌酮的同時檢測，包括如下步驟:
(I)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入200 μ 、45 mg/L的Hg2+溶液，用計時電流法將電壓設(shè)置為-1 V沉積60 s,使Hg2+沉積在電極表面形成Hg膜。(2)采用循環(huán)伏安法(CV)在-1.(Γ0.1 V電壓范圍掃描，檢測Hg2+是否在工作電極上成膜，并使Hg與M形成汞齊。(3)經(jīng)步驟(2)處理后的工作電極反復經(jīng)步驟(I)和(2)處理5次，用計時電流法沉積5 min，工作電極處理完畢。(4)由(3)得到的工作電極用方波伏安法(SWV)進行測試，電壓設(shè)置為-1.(Γ0.1V，根據(jù)所得電流強度與兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌酮的標準溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。(5)將待測樣品代替兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌酮的標準溶液，按照所述兩種環(huán)境雌激素炔雌醇和雌酮的工作曲線的繪制方法進行檢測。同時檢測炔雌醇和雌酮，實驗結(jié)果表明，炔雌醇線性范圍為0.lOpg/mL^lOO ng/mL ;檢出限可達到0.021pg/mL ;;雌酮檢測范圍:0.50 pg/mL 100 ng/mL,檢出限0.15 pg/mL。
權(quán)利要求
1.一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)氨基化介孔四氧化三鐵(AFMFe3O4)的制備 I g FeCl3.6H20溶解于15 18 mL乙二醇，與3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均勻，強烈攪拌2(T30 min，裝入聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，于18(T200 °C加熱8 9 h，取出、冷卻至室溫，得到黑色固體，用超純水洗滌至中性，制得AFMFe3O4 ; (2)吸附金屬離子的氨基化介孔四氧化三鐵(M2+-AFMFe3O4)的制備 分別量取8(T100 mL、濃度為8(Tl20 mg/L的Pb2+溶液和80 120 mg/L的Cd2+溶液置于錐形瓶中，分別加入8 10 mg的氨基化介孔四氧化三鐵，振蕩廣3 h，使Pb2+和Cd2+被氨基化介孔四氧化三鐵充分吸附，烘干，制得M2+-AFMFe3O4,即Pb2+-AFMFe3O4和Cd2+-AFMFe3O4,備用; (3)Pb2+-AFMFe3O4和Cd2+-AFMFe3O4標記的抗體孵化物的制備 1)將0.5 mL、2 5mg/L 的 Pb2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.4^0.6 mL、pH 7.(Γ7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3 5μ L—種環(huán)境雌激素抗體(Ab1)，振蕩1(T12 h后離心，用pH 7.(Γ7.8的PBS溶液定容至ImL,制得Pb2+金屬離子標記的抗體孵化物(Pb2+-AFMFe3O4Ab1),置于4°C冰箱中備用； 2)將0.5 mL、2 5 mg/L 的 Cd2+-AFMFe3O4 和 0.5 mL、2.5% 的戊二醛混合，振蕩 Ih,離心，傾倒上層溶液，加入0.4 0.6 mL、pH7.0 7.8的PBS溶液，超聲使其分散均勻；加入3 5 μ L另一種環(huán)境雌激素抗體(Ab2)，振蕩1(T12 h后離心，用pH 7.(Γ7.8的PBS溶液定容至lmL，制得另一種金屬離子標記的抗體孵化物(Cd2+_AFMFe304/Ab2),置于4°C冰箱中備用； (4)一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器的制備方法 1)將3 5yL、2mg/mL超聲處理分散均勻的石墨烯,滴涂在玻碳工作電極表面，自然晾干; 2)分別將:Γ5μ L的兩種環(huán)境雌激素標準溶液滴涂在I)中得到的工作電極表面，4°C冰箱中干燥； 3)滴涂5 7μ L、10(^g -πιΓ1的牛血清白蛋白于2)中得到的工作電極表面，置于4°C冰箱中直至干燥，超純水清洗后，置于4 °C冰箱中晾干； 4)分別取3 5UL I中(3)所制備的兩種金屬離子標記的抗體孵化物Pb2+-AFMFe3O4/Ab1和Cd2+-AFMFe3O4Ab2滴涂于電極表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備的一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器，用于兩種環(huán)境雌激素的同時檢測，其特征在于，包括如下步驟: (1)使用電化學工作站對三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器為工作電極，在10 mL、pH 5.(Γ5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入200 μ L、3(T50mg/L的Hg2+溶液，用計時電流法將電壓設(shè)置為-1 V沉積4(T60s，使Hg2+沉積在電極表面形成Hg膜； (2)采用循環(huán)伏安法(CV)在-1.(Γ0.1 V電壓范圍掃描，檢測Hg2+是否在工作電極上成膜，并使Hg與M形成汞齊； (3)經(jīng)步驟(2)處理后的工作電極反 復經(jīng)步驟(I)和(2)處理4飛次，用計時電流法沉積:Γ5 min，工作電極處理完畢；(4)由(3)得到的工作電極用方波伏安法(SWV)進行測試，電壓設(shè)置為-1.(T0.1 V，根據(jù)所得電流強度與兩種環(huán)境雌激素標準溶液濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線； (5)將待測樣品代替兩種環(huán)境雌激素的標準溶液，按照所述兩種環(huán)境雌激素工作曲線的繪制方法進行檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 2所述的一種雙通道環(huán)境雌激素免疫傳感器，其特征在于，所述環(huán)境雌激素選自以下任意兩種:己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17 α-乙炔基雌二醇。 ·
全文摘要
本發(fā)明屬于納米功能材料、環(huán)境檢測、免疫分析及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雙通道環(huán)境雌激素電化學免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。采用吸附金屬離子的氨基化介孔四氧化三鐵標記的電化學免疫傳感器，實現(xiàn)了對兩種環(huán)境雌激素的同時檢測，并具有較高的靈敏度，有效克服了目前環(huán)境雌激素檢測方法的不足，對環(huán)境檢測具有重要的科學意義和應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/74GK103235145SQ20131013831
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者杜斌, 魏琴, 張森, 李賀, 辛曉東, 吳丹, 馬洪敏, 于海琴, 張勇 申請人:濟南大學