乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用，重新制備了孕酮完全抗原，并對孕酮免疫生物傳感器的條件進行優(yōu)化，確定了奶牛妊娠診斷范圍為10ng/ml-15ng/ml，同時應(yīng)用孕酮免疫生物傳感器對乳汁孕酮進行了檢測，并與血漿孕酮含量進行了比對，二者密切相關(guān)。確定了孕酮免疫生物傳感器持久黃體診斷范圍為12ng/ml-18ng/ml，卵巢靜止診斷范圍為6ng/ml-10ng/ml，黃體囊腫診斷范圍為16ng/ml-22ng/ml。
【專利說明】乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]孕酮是一種小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，要使孕酮具有完全抗原性，一般利用某種偶聯(lián)劑作為橋聯(lián)，將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)而成為完全抗原。孕酮免疫生物傳感器以高親和力、靈敏度和高特異性的單克隆抗體為基礎(chǔ)，獲得高親和力、高特異性的細胞株是獲得單克隆抗體的關(guān)鍵。單克隆抗體在當前系統(tǒng)中使用極為敏感，而且具有比較高的專一性，提高了檢測孕酮激素準確率。本發(fā)明重新制備了孕酮完全抗原，并對孕酮免疫生物傳感器的條件進行優(yōu)化。
[0003]在國外孕酮的檢測成為牛群繁殖管理的重要檢測指標之一，孕酮測定被主要用于確定排卵、孕激素治療監(jiān)測和早期妊娠狀態(tài)的評價。通過孕酮檢測，區(qū)分出已孕奶牛、休情期奶?；虬l(fā)情周期不規(guī)律的奶牛，以便迅速采取適當?shù)拇胧１景l(fā)明應(yīng)用孕酮免疫生物傳感器對妊娠奶牛、發(fā)情奶牛和繁殖障礙奶牛進行了檢測，并用ELISA檢測方法進行了對比，為奶牛妊娠、發(fā)情和繁殖障礙疾病的診斷提供了新的判定標準和理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用，重新制備了孕酮完全抗原，并對孕酮免疫生物傳感器的條件進行優(yōu)化，對妊娠奶牛、發(fā)情奶牛和繁殖障礙奶牛進行了檢測，并用ELISA檢測方法進行了對比，為奶牛妊娠、發(fā)情和繁殖障礙疾病的診斷提供了新的判定標準和理論依據(jù)。
[0005]本發(fā)明的一種乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立，具體步驟如下:
[0006]步驟一:準備材料:紫外可見分光光度計、精密電子天平、CHI660A電化學(xué)工作站、恒溫箱、磁力攪拌器、孕酮-11 α -半琥珀酸酯、孕酮單克隆抗體、HRP山羊抗小鼠酶標二抗體；3，3’，5，5’_ 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-2HCL、牛血清白蛋白(BSA)、H202、Tween20、孕酮(P4)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，二甲基甲酰胺(DMF)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、卵清白蛋白(OVA, MW:45000)、透析袋、96孔可拆酶標板
[0007]步驟二:完全檢測抗原的制備:
[0008](I)稱取Imglla-羥基孕酮半琥珀酸(11 a-OH-P4-HS)，溶于0.02mL 二甲基甲酰胺(DMF)中；分別稱取0.0298mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和0.534mg 二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，各自溶于0.004mLDMF中；將上述三種溶液混合，在室溫下振蕩90min ;將振蕩均勻的混合液逐滴緩慢地加入溶解于含有2.1mg卵清白蛋白(OVA)的0.2mol / L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)中，然后4°C攪拌過夜；將偶聯(lián)的液體裝入預(yù)先處理好的透析袋中，放入大燒杯中透析；在透析過程中用0.lMNaHC032.2L，透析4小時；去離子水2.2LX3次，透析
1.5hX3 次；最后用 ILPBS (pH7.4)透析 15 小時。取出偶聯(lián)物 11 a -OH-P4-HS-OVA, 4000rpm,離心30min，取上清分裝，在-20°C凍存?zhèn)溆谩0009](2)分別用稀釋液稀釋一定濃度的完全抗原(11 a -OH-P4-HS-OVA)，卵清白蛋白(OVA)，孕酮-11 α -半琥珀酸酯(11 a -OH-P4-HS)包被酶標板，按照間接ELISA操作，鑒定完全抗原免疫活性。
[0010](3)用紫外掃描儀測定上述完全抗原制備液的OD26tlnm和OD28tol值，以計算蛋白濃度。蛋白濃度 mg/mL= (1.45XOD28tol-0.74XOD26tlJ X 稀釋倍數(shù)。
[0011]步驟三:分別用稀釋液稀釋一定濃度的完全抗原(11 a -OH-P4-HS-OVA)，卵清白蛋白(OVA)，孕酮-11 α -半琥珀酸酯(11 a -OH-P4-HS)包被酶標板，按照間接ELISA操作，鑒定完全抗原免疫活性。
[0012]步驟四:根據(jù)間接競爭ELISA法操作:將制備好的P4-0VA(1: 1000碳酸鹽緩沖液稀釋)包被在絲網(wǎng)印刷電極上，37 °C 2h，應(yīng)用PBST沖洗電極，最后干燥；應(yīng)用0.25%BSA封閉，37°C 2h，PBST沖洗，干燥；在絲網(wǎng)印刷電極上加入HRP-AB，不同濃度的孕酮標準品，37°C 50min，PBST沖洗，干燥；應(yīng)用底物緩沖液(磷酸一檸檬酸鹽緩沖液，pH5.5)稀釋TMB (TMB為100倍濃縮)，加入H2O2每毫升工作液加入30 % H2O0.1uL / ml (或用底物緩沖液稀釋成工作濃度稀釋TMB)，加入工作電極20uL，室溫蔽光，15min ;運用計時電流法測電信號。
[0013]如權(quán)利要求1所述的乳汁孕酮生物傳感器臨床應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明重新制備了孕酮完全抗原，并對孕酮免疫生物傳感器的條件進行優(yōu)化，還對配種后妊娠奶牛的血漿雌二醇、促黃體素、促卵泡素和孕酮濃度進行了檢測，同時應(yīng)用孕酮免疫生物傳感器對乳汁孕酮進行了檢測，并與血漿孕酮含量進行了比對，二者密切相關(guān)。確定了奶牛妊娠診斷范圍為IOng / ml-15ng/ml。對產(chǎn)后發(fā)情奶牛的血漿雌二醇、促黃體素、促卵泡素和孕酮濃度進行了檢測，同時應(yīng)用孕酮免疫生物傳感器對乳汁孕酮進行了檢測，并與血漿孕酮含量進行了比對，二者密切相關(guān)。確定了奶牛發(fā)情診斷范圍為Ilng/ml-18ng/ml。對乏情奶牛的血漿雌二醇、促黃體素、促卵泡素和孕酮濃度進行了檢測，同時應(yīng)用孕酮免疫生物傳感器對乳汁孕酮進行了檢測，并與血漿孕酮含量進行了比對，二者密切相關(guān)。確定了孕酮免疫生物傳感器持久黃體診斷范圍為12ng / ml-18ng / ml，卵巢靜止診斷范圍為6ng / ml-10ng/ml,黃體囊腫診斷范圍為16ng / ml_22ng / ml。
【具體實施方式】
[0015]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0016]實施例一:所述的乳汁孕酮生物傳感器臨床應(yīng)用
[0017]1、準備材料:
[0018]離心機Anke TDL80-2B、超低溫冰箱、紫外可見分光光度計、精密電子天平(LIBRORAEG-120)、CHI660A電化學(xué)工作站、恒溫箱、50s型TringaVet便攜式獸用、B型超聲波掃描儀、肝素、孕酮單克隆抗體、HRP山羊抗小鼠酶標二抗體、孕酮完全抗原(實驗室制備)、3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-2HCL、牛血清白蛋白(BSA)、H202、Tween20、雌二醇ELISA試劑盒、孕酮ELISA試劑盒、促黃體素ELISA試劑盒、促卵泡素ELISA試劑盒。
[0019]2、試驗動物分組與樣品處理:[0020]試驗一在黑龍江省某集約化奶牛場，選取年齡、胎次及體況相近的健康奶牛7頭，分別配種后 10d、15d、20d、25d 和 30 采血 IOml (I % 肝素，120uL)，3000r / min，5min 離心，-80°C待檢。采乳汁5ml，-80°C待檢。后直檢確定這7頭奶牛為妊娠牛。
[0021]試驗二在黑龍江省某集約化奶牛場，選取年齡胎次及體況相近的奶牛26頭，其中健康奶牛8頭，產(chǎn)后60d、65d、70d、75d和80d采血和乳汁；黃體囊腫6頭，卵巢靜止6頭，持久黃體6頭，采血和乳汁。血樣采集101111(1%肝素，1201^)，300(^ / min，5min離心，_80°C待檢。采乳汁5ml，-80°C待檢。
[0022]3、繁殖障礙病種類及判斷標準
[0023]持久黃體:直腸檢查一側(cè)或兩側(cè)卵巢體積增大，卵巢內(nèi)有持久黃體存在，并突出于卵巢表面。子宮收縮反應(yīng)微弱，如宮內(nèi)有異物可觸摸到，子宮沉于腹腔內(nèi)。B超影像檢查如圖1。
[0024]卵巢靜止:奶牛不發(fā)情，直腸檢查卵巢上無卵泡和黃體，其體積變小，一側(cè)卵巢上可能有黃體殘留。B超影像檢查如圖2。
[0025]黃體囊腫:直腸檢查一側(cè)或雙側(cè)的卵巢體積增大。表面有黃豆粒大小，一個或數(shù)個突出的黃體，質(zhì)地硬而無彈性。B超影像檢查如圖3。
[0026]4、血漿激素檢測指標與原理
[0027]促卵泡素(FSH，mIU / mL)，ELISA法，試劑盒批號DZE50055，檢測原理:用純化的牛促卵泡素(FSH)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中加入促卵泡素(FSH)，再與HRP標記的促卵泡素(FSH)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物。經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的促卵泡素(FSH)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD)值，通過標準曲線計算樣品中促卵泡素(FSH)濃度；促黃體素(LH，mIU /mL), ELISA法，試劑盒批號DZE50054、孕酮(P4，ng/mL) ELISA法，試劑盒批號DZE50056、雌二醇(E2，pg / mL)ELISA法，試劑盒批號DZE50060，檢測原理同促卵泡素(FSH) —致。
[0028]5、乳汁孕酮檢測方法
[0029]根據(jù)間接競爭ELISA法操作:將制備好的P4_0VA(1: 1000碳酸鹽緩沖液稀釋)包被在絲網(wǎng)印刷電極上，37°C 2h，應(yīng)用PBST沖洗電極，最后干燥；應(yīng)用0.25% BSA封閉，370C 2h，PBST沖洗，干燥；在絲網(wǎng)印刷電極上加入HRP-AB，不同乳汁樣品，37°C 50min,PBST沖洗，干燥；應(yīng)用底物緩沖液(磷酸-檸檬酸鹽緩沖液PH5.5)稀釋TMB(TMB為100倍濃縮)，加入H202每毫升工作液加入30% H200.1uL / ml (或用底物緩沖液稀釋成工作濃度稀釋TMB)，加入工作電極20uL，室溫蔽光，15min ;運用計時電流法測電信號。
[0030]6、數(shù)據(jù)處理
[0031]應(yīng)用SPSS17.0軟件One-way ANOVA (單因素方差分析)進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)土標準差(x±SD)表示，當差異顯著時用Duncan氏檢驗法進行各組間的多重比較。組間比較，上標小寫字母不同者差異顯著(P〈0.05)，上標大寫字母不同者差異極顯著(Ρ〈0.01)。
[0032]7、結(jié)果.[0033]7.1妊娠奶牛血漿生殖激素和乳汁孕酮變化
[0034]7.1.1妊娠奶牛血漿Ε2，F(xiàn)SH, LH濃度變化[0035]表1妊娠奶牛血漿E2，F(xiàn)SH, LH濃度
[0036]
【權(quán)利要求】
1.乳汁孕酮生物傳感器檢測方法的建立，其特征在于，具體步驟如下: 步驟一:準備材料:紫外可見分光光度計、精密電子天平、CHI660A電化學(xué)工作站、恒溫箱、磁力攪拌器、孕酮-11 α -半琥珀酸酯、孕酮單克隆抗體、HRP山羊抗小鼠酶標二抗體；3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-2HCL、牛血清白蛋白(BSA)、H202、Tween20、孕酮(P4)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，二甲基甲酰胺(DMF)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、卵清白蛋白(OVA，MW:45000)、透析袋、96孔可拆酶標板 步驟二:完全檢測抗原的制備: (1)稱取Imglla-羥基孕酮半琥珀酸(11a-OH-P4-HS)，溶于0.02mL 二甲基甲酰胺(DMF)中；分別稱取0.0298mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和0.534mg 二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，各自溶于0.004mLDMF中；將上述三種溶液混合，在室溫下振蕩90min ;將振蕩均勻的混合液逐滴緩慢地加入溶解于含有2.1mg卵清白蛋白(OVA)的0.2mol / L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)中，然后4°C攪拌過夜；將偶聯(lián)的液體裝入預(yù)先處理好的透析袋中，放入大燒杯中透析；在透析過程中用0.lMNaHC032.2L，透析4小時；去離子水2.2LX3次，透析1.5hX3 次；最后用 ILPBS (pH7.4)透析 15 小時。取出偶聯(lián)物 11 a -OH-P4-HS-OVA, 4000rpm,離心30min，取上清分裝，在-20°C凍存?zhèn)溆茫? (2)分別用稀釋液稀釋一定濃度的完全抗原(11a -OH-P4-HS-OVA)，卵清白蛋白(OVA)，孕酮-11 α -半琥珀酸酯(11 a -OH-P4-HS)包被酶標板，按照間接ELISA操作，鑒定完全抗原免疫活性； (3)用紫外掃描儀測定上述完全抗原制備液的OD26tol和(?28_值，以計算蛋白濃度。蛋白濃度 mg/mL=(l.45 X OD280nm-0.74X OD260J X 稀釋倍數(shù)； 步驟三:分別用稀釋液稀釋一定濃度的完全抗原(11α-OH-P4-HS-OVA),卵清白蛋白(OVA)，孕酮-11 α -半琥珀酸酯(11 a -OH-P4-HS)包被酶標板，按照間接ELISA操作，鑒定完全抗原免疫活性； 步驟四:根據(jù)間接競爭ELISA法操作:將制備好的P4-0VA(1: 1000碳酸鹽緩沖液稀釋)包被在絲網(wǎng)印刷電極上，37°C 2h，應(yīng)用PBST沖洗電極，最后干燥；應(yīng)用0.25% BSA封閉，37°C 2h，PBST沖洗，干燥；在絲網(wǎng)印刷電極上加入HRP-AB，不同濃度的孕酮標準品，37 0C 50min, PBST沖洗，干燥；應(yīng)用底物緩沖液(磷酸-檸檬酸鹽緩沖液，pH5.5)稀釋TMB (TMB為100倍濃縮)，加入H2O2每毫升工作液加入30% H2O0.1uL / ml (或用底物緩沖液稀釋成工作濃度稀釋TMB)，加入工作電極20uL，室溫蔽光，15min ;運用計時電流法測電信號。
2.如權(quán)利要求1所述的乳汁孕酮生物傳感器臨床應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/74GK103837689SQ201410067612
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】夏成, 吳凌, 徐闖, 鄭家三, 段宇, 包凱, 孫雨航, 李穎, 許楚楚, 高陽, 張洪友, 包軍 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)