專利名稱：熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，屬于生物工程和生物免疫學領域。
背景技術：
肝癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，治愈性肝切除以及肝移植是目前肝癌病人的首選方法，但是由于肝癌的肝內多發(fā)病灶、肝外轉移及供體缺乏的因素，診斷出的病人中僅有10% 15%的病人可以接受手術治療。臨床資料還顯示，大多數肝癌患者對化療、放療不敏感，且對正常細胞造成一定的損害，毒副反應大，易復發(fā)，因此肝癌的臨床治療迫切地需要新技術和新方法。近年來，腫瘤免疫治療已成為繼手術、化療和放療后另一種很有前途的治療手段。其吸引人之處在于能夠激發(fā)患者自身免疫系統，誘發(fā)高特異性免疫反應，不僅實現對腫瘤病灶的腫瘤細胞的特異性殺傷，而且還可以消除血液和淋巴系統中的癌細胞，有效地阻止癌細胞轉移，因此，成為近年來國內外研究的熱點。肝腫瘤細胞疫苗是將自身或異體同種肝癌細胞經過物理因素(照射、高溫)、化學因素(酶解)以及生物因素(病毒感染、基因轉染等)的處理，改變或消除其致瘤性，保留其免疫原性，免疫機體，刺激機體產生特異性抗腫瘤免疫，以達到治療肝癌、預防肝癌轉移和復發(fā)的目的。然而，腫瘤疫苗研制過程中存在的一個共同問題是大多數腫瘤抗原的免疫原性弱，抗原表位少，表達分布不同，很難引起機體特異性免疫應答，需添加佐劑來增強其免疫原性。鋁鹽佐劑是目前唯一全球公認的人用佐劑，但存在對蛋白亞單位疫苗誘導抗體產生的能力較弱，激發(fā)細胞免疫應答能力差等，而且在某些情況下，還會產生與過敏反應有關的IgE，其副作用難以避免。因此，需要研發(fā)更為安全有效的人用新型佐劑，尤其是安全無毒、能夠刺激較強細胞免疫應答的佐劑。近年來，從藥用植物中提取安全、高效的自然組分作為免疫佐劑成為佐劑·研究的趨勢。熊果酸(Ursolic acid, UA),又名烏索酸、烏蘇酸,是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，以游離形式或與糖結合成苷的形式分布于枇杷葉、熊果、女貞子、山楂、車前草、夏枯草、白花蛇舌草等多種植物中。研究發(fā)現其具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、增強免疫功能等多種生物學效應。經系統查閱文獻和專利資料，目前未發(fā)現熊果酸在抗腫瘤免疫佐劑方面的用途。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，該方法是將熊果酸和H22細胞共培養(yǎng)，采用常規(guī)方法制備肝癌細胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，結果表明熊果酸為佐劑的疫苗免疫小鼠后，荷瘤小鼠腫瘤的生長明顯抑制，小鼠的生命延長率明顯高于模型組，胸腺等免疫器官得到保護，脾淋巴細胞增殖能力顯著升高，血清中細胞因子IL-2、IL-4含量明顯升高，⑶47⑶8+T細胞含量比例明顯升高，免疫熒光顯示免疫小鼠血清可與H22細胞發(fā)生特異性結合，ELISA從血清中檢測到高滴度抗體。熊果酸作為佐劑制備的肝腫瘤全細胞疫苗，可有效的提高肝腫瘤疫苗的免疫原性，通過該方法獲得的熊果酸免疫佐劑疫苗安全，無毒，來源廣泛，克服了目前免疫佐劑單一，免疫效果低，副作用難以避免的問題。本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，按下列步驟進行:
a、在對數生長期H22腫瘤細胞5X IO7個接種于Iml含滅活的10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，加入20 μ mol/mL的熊果酸培養(yǎng)48h ；
b、離心棄上清液，剩余物細胞懸浮于Iml生理鹽水中，再放入液氮中冷凍，時間5-10分鐘，再將冷凍物取出，放入溫度37°C水融化，反復5-8次，即可得到熊果酸免疫佐劑疫苗。一種所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝腫瘤全細胞的疫苗。一種所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備預防肝腫瘤全細胞的疫苗。本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，其中熊果酸的結構式為:.H Pcooh I Hi,.H 1:
本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，通過該方法獲得的熊果酸免疫佐劑疫苗中，包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細胞的活性成分；其中所述的活性成分為蛋白質、多肽、脂類、蛋白質多肽復合物、DNA分子、RNA分子、腫瘤相關抗原或特異性腫瘤抗原。本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，通過所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝癌腫瘤全細胞和預防肝癌腫瘤全細胞的新用途，其中:
(1)、小鼠肝腫瘤全細胞免疫疫苗的制備:采用熊果酸與小鼠給腫瘤細胞共培養(yǎng)后，反復凍融，獲得小鼠肝腫瘤全細胞免疫疫苗；
(2)、建立小鼠免疫模型，檢測各個組的免疫小鼠存活情況，結果表明全細胞疫苗組可明顯提高小鼠的成活率及延長小鼠的生存天數；而且全細胞疫苗組可抑制腫瘤的快速生長;
(3)、小鼠免疫模型各組中，全細胞疫苗組可以在一定程度上保護小鼠的免疫器官，增強淋巴細胞的活性，提高⑶47⑶8+比值，提高細胞因子IL-2、IL-4的表達量；
(4)、利用免疫熒光檢測小鼠免疫模型各組中抗原、抗體結合情況，結果表明，免疫成功小鼠血清中存在與腫 瘤抗原結合的特異抗體，而且體液中特異性抗體IgG的表達也得到了提聞。
(全細胞+UA)疫苗免疫小鼠后，胸腺等免疫器官得到保護，脾淋巴細胞增殖能力顯著升高，⑶47⑶8+T細胞含量比例明顯升高，血清中細胞因子IL-2、IL-4含量明顯升高，免疫熒光顯示免疫小鼠血清可與H22細胞發(fā)生特異性結合，ELISA從血清中檢測到高滴度抗體。本發(fā)明的有益效果是:熊果酸作為佐劑制備的腫瘤全細胞疫苗，可有效的提高腫瘤疫苗的免疫原性，提高小鼠的生存率及生存天數，保護肝腫瘤導致的脾免疫器官異常增大、增強細胞免疫活性，調節(jié)免疫細胞亞群和細胞因子的作用，可作為抗肝腫瘤免疫佐劑；其另外一個優(yōu)勢是安全，無毒，來源廣泛。


圖1為本發(fā)明免疫小鼠生長過程中體重的變化圖，其中一 一為模型組，一■一為熊果酸組，一▲一為細胞組，一X—為疫苗組，一 一為空白組；
圖2為本發(fā)明接種腫瘤后，腫瘤生長曲線圖，其中一 一為模型組，一▲一為熊果酸組，一.一為細胞組，一 一為疫苗組；
圖3為本發(fā)明免疫各組的細胞因子IL-2 (a) IL-4 (b)的變化 圖4為本發(fā)明熒光顯微鏡觀察免疫血清抗體(X20) 圖5為本發(fā)明免疫各組血清中IgG的表達情況圖。
具體實施例方式實施例1
本發(fā)明所述的一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，按下列步驟進行:
a、在對數生長期H22腫瘤細胞5X IO7個接種于Iml含滅活的10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，加入20 μ mol/mL的熊果酸培養(yǎng)48h ；
b、離心棄上清液，剩余物細胞懸浮于Iml生理鹽水中，再放入液氮中冷凍，時間5-10分鐘，再將冷凍物取出，放入溫度37°C水融化，反復5-8次，即可得到熊果酸免疫佐劑疫苗。實施例2
通過本發(fā)明所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝腫瘤全細胞或預防肝腫瘤全細胞的用途:
小鼠肝癌疫苗的免疫模型的建立:
小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為空白組、模型組、熊果酸免疫組、細胞免疫組、熊果酸細胞共培養(yǎng)免疫組(簡稱疫苗免疫組);
熊果酸免疫組為在Iml生理鹽水中加入熊果酸至終濃度為20ymol/L，細胞免疫組為在Iml含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，接種對數生長期H22細胞5 X IO7個，培養(yǎng)48h后取出，離心棄上清，懸浮于Iml生理鹽水中，液氮中反復凍融5-8次，空白組不進行處理，模型組給予0.2ml/只生理鹽水，熊果酸組給予0.2ml/只熊果酸，細胞免疫組和疫苗免疫組分別給予相應疫苗0.2ml/只；背部皮下免疫，每周I次，第3次免疫后7天給模型組、熊果酸組、細胞組和疫苗免疫組分別右側腋窩皮下接種對數生長期H22細胞2 X IO6個/只，觀察各組的觀察各組小鼠的成瘤率、出瘤時間、腫瘤生長狀態(tài)以及生存期； 結果:小鼠適應性飼養(yǎng)5天后，開始接種免疫，期間各組小鼠體重變化趨于一致，自腋窩皮下接種H22細胞建模后，每日稱量小鼠體重，繪制小鼠體重隨時間變化圖(圖1);建模7天后，各組體重變化開始出現明顯差異；模型組和熊果酸免疫組體重明顯升高，細胞免疫組和疫苗免疫組升高幅度較小，且后期逐漸持平；至實驗結束模型組平均體重為42.10±2.16g,熊果酸免疫組平均體重為40.45±3.96g,細胞免疫組平均體重為37.78±3.64g，疫苗免疫組平均體重為37.15±4.50g，空白組平均體重為36.35±3.80g，其中細胞免疫組和疫苗免疫組體重與空白組最接近；說明單純癌細胞疫苗和全細胞疫苗均有一定的免疫預防作用，其中全細胞疫苗組效果最好。免疫小鼠存活情況及腫瘤生長檢測:
各組小鼠自免疫開始，測量體重變化并記錄生存時間，計算小鼠生命延長率和存活率，生命延長率(ILS)=(各免疫組平均生存時間-模型組平均生存時間)/模型組平均生存時間 X100% ；
接種腫瘤后，每日觀察腫瘤細胞生長，計算腫瘤體積，腫瘤體積(mm3) =長X寬2X0.5 ；結果:模型組和熊果酸組在接種實體瘤20天時開始出現死亡，至27天已全部死亡；細胞免疫組存活時間有所延長，但接種實體瘤30天后也全部死亡；至實驗結束時，疫苗免疫組仍有50%小鼠存活，生命延長率大幅提高，平均存活時間為38.00±7.07天，與模型組比較存在極顯著性差異(P〈0.01)，說明注射的疫苗能明顯的延長小鼠的存活時間見表1:
表I各免疫組小鼠生存狀況(n=10)
權利要求
1.一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法，其特征在于按下列步驟進行 a、在對數生長期H22腫瘤細胞5X IO7個接種于Iml含滅活的10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，加入20 μ mol/mL的熊果酸培養(yǎng)48h ； b、離心棄上清液，剩余物細胞懸浮于Iml生理鹽水中，再放入液氮中冷凍，時間5-10分鐘，再將冷凍物取出，放入溫度37°C水融化，反復5-8次，即可得到熊果酸免疫佐劑疫苗。
2.一種如權利要求I所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，其特征在于該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備抗肝腫瘤全細胞的疫苗。
3.—種如權利要求I所述方法獲得的熊果酸作為免疫佐劑疫苗的用途，其特征在于該熊果酸作為免疫佐劑疫苗在制備預防肝腫瘤全細胞的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熊果酸作為免疫佐劑疫苗的制備方法和用途，該方法是將熊果酸和H22細胞共培養(yǎng)，采用常規(guī)方法制備肝癌細胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，結果表明熊果酸為佐劑的疫苗免疫小鼠后，荷瘤小鼠腫瘤的生長明顯抑制，小鼠的生命延長率明顯高于模型組，胸腺等免疫器官得到保護，脾淋巴細胞增殖能力顯著升高，血清中細胞因子IL-2、IL-4含量明顯升高，CD4+/CD8+T細胞含量比例明顯升高，免疫熒光顯示免疫小鼠血清可與H22細胞發(fā)生特異性結合，ELISA從血清中檢測到高滴度抗體。熊果酸作為佐劑制備的肝腫瘤全細胞疫苗，可有效的提高肝腫瘤疫苗的免疫原性，通過該方法獲得的熊果酸免疫佐劑疫苗安全，無毒，來源廣泛，克服了目前免疫佐劑單一，免疫效果低，副作用難以避免的問題。
文檔編號A61K39/39GK103251944SQ20131021182
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月31日 優(yōu)先權日2013年5月31日
發(fā)明者李曉波, 李艷紅, 陸雪瑩, 肖向文 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所