專利名稱：一種七通道黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全分析、納米功能材料與生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種七通道黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxins )是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，特曲霉也能產(chǎn)生黃曲霉毒素，但產(chǎn)量較少。產(chǎn)生的黃曲霉毒素主要有B1、B2、Gl、G2以及另外兩種代謝產(chǎn)物Ml、M2。其中Ml和M2是從牛奶中分離出來的。B1、B2、G1、G2、M1和M2在分子結(jié)構(gòu)上十分接近。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有十幾種。眾所周知的“黃曲霉毒素Ml”主要出現(xiàn)在各種奶中。B1、B2、G1和G2是經(jīng)常出現(xiàn)在農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒素的代表，毒性最強(qiáng)的是BI。BI和B2被奶牛吃后，分別有一小部分會(huì)轉(zhuǎn)化為Ml和M2進(jìn)入奶中，這就是牛奶中黃曲霉毒素的來源。黃曲霉毒素在農(nóng)產(chǎn)品中幾乎無法避免,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，黃曲霉毒素超標(biāo)的玉米并不少見。倘若全部銷毀，將會(huì)造成很大的損失，世界各國(guó)，通過設(shè)定一個(gè)“限量標(biāo)準(zhǔn)”加以控制。黃曲霉毒素BI的半數(shù)致死量為0.36 mg/kg體重,屬特劇毒的毒物范圍。它引起人的中毒主要是損害肝臟，發(fā)生肝炎、肝硬化和肝壞死等。臨床表現(xiàn)有胃部不適、食欲減退、惡心嘔吐、腹脹及肝區(qū)觸痛等，嚴(yán)重者 出現(xiàn)水腫昏迷，甚至抽搐而死。黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的致癌物質(zhì)，其致癌力比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍，主要誘使動(dòng)物發(fā)生肝癌也能誘發(fā)胃癌、腎癌、直腸癌及乳腺，卵巢小腸等部位的癌癥。1995年，世界衛(wèi)生組織制定的食品黃曲霉毒素最高允許濃度為15Pg/kg ;美國(guó)聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定人類消費(fèi)食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒含量(指B1+B2+G1+G2的總量)不能超過15Pg/kg ;人類消費(fèi)的牛奶中的含量不能超過0.5Pg/kg，其他動(dòng)物飼料中的含量不能超過30(g/kg。而歐盟國(guó)家規(guī)定更加嚴(yán)格，花生和堅(jiān)果及其加工產(chǎn)品、所有谷類食品及其加工產(chǎn)品中黃曲霉毒素BI限量為2.0Pg/kg ;原奶、熱處理奶及加工奶產(chǎn)品中Ml限量為
0.05^g/kg ;嬰兒食品(包括嬰幼兒奶)中Ml限量為0.025Pg/kg。目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)都在使用薄膜層析法和液相色譜法進(jìn)行黃曲霉毒素的檢測(cè)。由于其檢測(cè)周期長(zhǎng)、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)，已不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)要求。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，建立靈敏、特異、快速地檢測(cè)黃曲霉毒素的方法迫在眉睫。所用原料均可以在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購買。本發(fā)明利用電化學(xué)技術(shù)，提高方法的靈敏度；結(jié)合免疫技術(shù)，增強(qiáng)傳感器的選擇性；不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)成本；采用多通道絲網(wǎng)印刷電極實(shí)現(xiàn)了多種黃曲霉毒素的同時(shí)檢測(cè)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免傳統(tǒng)檢測(cè)方法的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣、檢測(cè)人員要求高、檢測(cè)成本昂貴等缺點(diǎn)，提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便快速的七通道黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的。技術(shù)方案，包括以下步驟。1.一種七通道黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)在塑料基板上，用摻雜復(fù)合材料的導(dǎo)電油墨印刷7個(gè)工作電極，用導(dǎo)電油墨印刷I
個(gè)輔助電極；用銀漿印刷I個(gè)參比電極、電極觸點(diǎn)以及連接導(dǎo)線；用絕緣漿涂覆除各電極和電極觸點(diǎn)外的導(dǎo)線區(qū)域，形成絕緣層；在電極區(qū)域形成一個(gè)圓形的電解池凹槽，制得七通道絲網(wǎng)印刷電極。所述復(fù)合材料由1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸離子液體([EMM]BF4)和聚苯胺組成，其質(zhì)量比為(10 20):1。所述復(fù)合材料與導(dǎo)電油墨的質(zhì)量比為1: (10 15)。(2)在所制備的七通道絲網(wǎng)印刷電極的7個(gè)工作電極的表面分別涂覆一層鈀納米粒子-殼聚糖復(fù)合材料，鈀納米粒子是由硼氫化鈉還原氯鈀酸銨制得的；所述的鈀納米粒子-殼聚糖復(fù)合材料是將Img鈀納米粒子分散于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的殼聚糖乙酸溶液中。(3)在步驟(2)得到的工作電極b的表面上滴涂5 IOPL黃曲霉毒素BI抗體、工作電極c的表面上滴涂5 IOPL黃曲霉毒素Β2抗體、工作電極d的表面上滴涂5 ΙΟμ 黃曲霉毒素Gl抗體、工作電極e的表面上滴涂5 IOPL黃曲霉毒素G2抗體、工作電極f的表面上滴涂5 IOPL黃曲霉毒素Ml抗體、工作電極g的表面上滴涂5 10μ 黃曲霉毒素M2抗體和工作電極h的表面上滴涂5 10μ 總黃曲霉毒素抗體；潤(rùn)濕狀態(tài)下放置I 3h ;所述抗體濃度為5 10 Pg/mL。(4)在步驟(3)得到的7個(gè)工作電極表面分別滴加5PL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白，待干燥后，用PH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，即制得七通道黃曲霉毒素免疫傳感器。2.所述的制備的一種七通道黃曲霉毒素免疫傳感器，用于6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的檢測(cè)，步驟如下:
(I)將6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到上述方法制備的七通道黃曲霉毒素免疫傳感器對(duì)應(yīng)的工作電極表面上，孵化I 3 h，然后用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，得到修飾好的工作電極。(2)將參比電極、輔助電極和工作電極連接在多通道電化學(xué)工作站上,在電解槽中加入5 mmol/L的鐵氰化鉀溶液，通過方波伏安法檢測(cè)所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)。(3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。(4)用待測(cè)樣品代替6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)照所繪制的6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線，計(jì)算出樣品中6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的含量。所述七通道黃曲霉毒素免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素Ml、黃曲霉毒素M2以及總黃曲霉毒素的同時(shí)測(cè)定。
所述的七通道黃曲霉毒素免疫傳感器，所用原料均可以在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購買。本發(fā)明具備以下優(yōu)勢(shì)。(I) 本發(fā)明快速、準(zhǔn)確，不需前處理，可用于復(fù)雜樣品中的多種黃曲霉毒素的同時(shí)檢測(cè)。(2)本發(fā)明采用的聚苯胺、離子液體、鈀納米粒子可顯著提高電化學(xué)信號(hào)，從而提高了本發(fā)明傳感器的靈敏度。(3)本發(fā)明印刷電極制備簡(jiǎn)單、成本低、便于攜帶、樣品消耗少，易于微型化和集成化，應(yīng)用范圍廣。( 4)本發(fā)明與其它的絲網(wǎng)印刷電極傳感器相比，可以一次性同時(shí)檢測(cè)復(fù)雜樣品中6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素，具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，顯著提高了檢測(cè)效率。


圖1是絲網(wǎng)印刷電極的示意圖。a為塑料基板，b h為工作電極，i為輔助電極，j為參比電極，k為電極觸點(diǎn)，I為絕緣層，m為電解池凹槽。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例一
本發(fā)明所述的一種七通道黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，結(jié)合圖1，步驟如下。第一步，清洗電極基板a，干燥后在基板a上用摻雜質(zhì)量比為20:1 [EMM]BF4和聚苯胺的復(fù)合材料的導(dǎo)電油墨印刷7個(gè)工作電極b h，用導(dǎo)電油墨印刷I個(gè)輔助電極i，常溫干燥，其中復(fù)合材料與導(dǎo)電油墨的質(zhì)量比為1: 10。第二步，在塑料基板a上印刷銀漿，用銀漿印刷參比電極j和電極觸點(diǎn)k之間連接的導(dǎo)線，并將各電極與相應(yīng)觸點(diǎn)用銀漿連接起來，常溫干燥。第三步，在塑料基板a上用絕緣漿涂覆除各電極及電極觸點(diǎn)外的導(dǎo)線區(qū)域，形成絕緣層1，將導(dǎo)線覆蓋，干燥后，再印刷一層絕緣漿。第四步，在電極區(qū)域形成一個(gè)圓形的電解池凹槽m，干燥保存。實(shí)施例二
改變復(fù)合材料中[EMIM]BF4和聚苯胺的質(zhì)量比為15: 1，其它與實(shí)施例一相同。實(shí)施例三
改變復(fù)合材料與導(dǎo)電油墨的質(zhì)量比為1: 15，其它與實(shí)施例一相同。實(shí)施例四
本發(fā)明所述的一種快速檢測(cè)黃曲霉毒素七通道絲網(wǎng)印刷電極免疫傳感器的制備，結(jié)合圖1，步驟如下:
(I)在所制備的七通道絲網(wǎng)印刷電極的7個(gè)工作電極的表面，涂覆一層鈀納米粒子-殼聚糖復(fù)合材料，鈀納米粒子-殼聚糖復(fù)合材料是將Img鈀納米粒子分散于1%的殼聚糖乙酸溶液中。(2)在步驟(I)得到的7個(gè)工作電極的表面上分別滴涂IOPL的抗體，即:工作電極b的表面上滴涂黃曲霉毒素BI抗體、工作電極c的表面上滴涂黃曲霉毒素B2抗體、工作電極d的表面上滴涂黃曲霉毒素Gl抗體、工作電極e的表面上滴涂黃曲霉毒素G2抗體、工作電極f的表面上滴涂黃曲霉毒素Ml抗體、工作電極g的表面上滴涂黃曲霉毒素M2抗體和工作電極h的表面上滴涂總黃曲霉毒素抗體；潤(rùn)濕狀態(tài)下放置I 3 h;所述每種抗體濃度為 5 Pg/mL。(3)在步驟(2)得到的7個(gè)工作電極表面分別滴加5PL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%牛血清白蛋白，待干燥后，用PH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，即制得七通道黃曲霉毒素免疫傳感器。實(shí)施例五
改變?cè)?個(gè)工作電極表面滴涂抗體的量為5PL，其它與實(shí)施例四相同。實(shí)施例六
改變?cè)?個(gè)工作電極表面滴涂抗體的濃度為10 Pg/mL，其它與實(shí)施例四相同。實(shí)施例七
實(shí)施例一到實(shí)施例六制備的七通道黃曲霉毒素免疫傳感器，用于6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的檢測(cè)，步驟如下:
(I)將具有一定濃度梯度的6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到所制備的七通道黃曲霉毒素免疫傳感器對(duì)應(yīng)的工作電極表面上，孵化I 3 h，然后用pH為
7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，得到修飾好的工作電極。(2)將參比電極、輔助電極和工作電極連接在多通道電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入5 mmol/L的鐵氰化鉀溶液，通過方波伏安法檢測(cè)所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)。(3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線，線性范圍均為0.01(Tl0(^g/kg，對(duì)黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素Ml、黃曲霉毒素M2及總黃曲霉毒素的檢測(cè)限為0.0056Pg/kg 以下。(4)用待測(cè)牛奶樣品代替6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)照所繪制的6種黃曲霉毒素及總黃 曲霉毒素工作曲線，計(jì)算出樣品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2及總黃曲霉毒素的含量，結(jié)果顯示黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2及總黃曲霉毒素均未檢出，黃曲霉毒素Ml、黃曲霉毒素M2僅有少量檢出，屬于合格產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種七通道黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)在塑料基板上，用摻雜復(fù)合材料的導(dǎo)電油墨印刷7個(gè)工作電極；用導(dǎo)電油墨印刷I個(gè)輔助電極；用銀漿印刷I個(gè)參比電極、電極觸點(diǎn)以及連接導(dǎo)線；用絕緣漿涂覆除各電極和電極觸點(diǎn)外的導(dǎo)線區(qū)域，形成絕緣層；在電極區(qū)域形成一個(gè)圓形的電解池凹槽； (2)在所制備的七通道絲網(wǎng)印刷電極的7個(gè)工作電極的表面分別涂覆一層鈀納米粒子-殼聚糖復(fù)合材料； (3)在步驟(2)得到的工作電極b的表面上滴涂5 IOPL黃曲霉毒素BI抗體、工作電極c的表面上滴涂5 IOPL黃曲霉毒素Β2抗體、工作電極d的表面上滴涂5 ΙΟμ 黃曲霉毒素Gl抗體、工作電極e的表面上滴涂5 IOPL黃曲霉毒素G2抗體、工作電極f的表面上滴涂5 IOPL黃曲霉毒素Ml抗體、工作電極g的表面上滴涂5 ΙΟμ 黃曲霉毒素M2抗體和工作電極h的表面上滴涂5 IOPL總黃曲霉毒素抗體；潤(rùn)濕狀態(tài)下放置I I h;所述抗體濃度為5 10 Pg/mL ； (4)在步驟(3)得到的7個(gè)工作電極表面分別滴加5PL牛血清白蛋白，待干燥后，用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈 ，即制得七通道黃曲霉毒素免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述復(fù)合材料由1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸離子液體和聚苯胺組成，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸離子液體和聚苯胺質(zhì)量比為(10 20):1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述復(fù)合材料與導(dǎo)電油墨的質(zhì)量比為1:(10 15)。
4.一種檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，該方法包括以下步驟: (1)將6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到權(quán)利要求1-3中所述的方法制備的七通道黃曲霉毒素免疫傳感器對(duì)應(yīng)的工作電極表面上，孵化I 3 h，然后用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，得到修飾好的工作電極； (2)將參比電極、對(duì)電極和工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入5mmol/L的鐵氰化鉀溶液，通過方波伏安法檢測(cè)所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)； (3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線； (4)用待測(cè)樣品代替6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)照所繪制的6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線，計(jì)算出樣品中6種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種七通道黃曲霉毒素免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于食品安全分析、納米功能材料和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。所述傳感器集成7個(gè)工作電極，其制作方案是以塑料為基板，將導(dǎo)電油墨、摻雜復(fù)合材料的導(dǎo)電油墨、銀漿、絕緣漿通過絲印機(jī)印刷到基板上，分別制成輔助電極、工作電極、參比電極以及絕緣層。復(fù)合材料由1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸離子液體和聚苯胺構(gòu)成，采用鈀納米粒子-殼聚糖復(fù)合材料修飾工作電極。實(shí)現(xiàn)了黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素M2以及總黃曲霉毒素的同時(shí)測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N27/403GK103196973SQ20131007976
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者魏琴, 杜斌, 王歡, 于海琴, 張勇, 吳丹, 李賀, 馬洪敏 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)