專利名稱：使用乙酰膽堿酯酶進行農(nóng)藥檢測的量熱方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用乙酰膽堿酯酶進行農(nóng)藥快速檢測的量熱方法，尤其是能夠?qū)崿F(xiàn)熱放大的乙酰膽堿酯酶量熱分析方法，屬農(nóng)藥檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
量熱法通過測量生化反應過程的熱量變化進行分析，與光學、電化學等方法比較，其通用性強，不受試樣自身顏色、渾濁、及電化學等屬性的干擾，能夠滿足實際試樣的檢測要求，尤其適合現(xiàn)場速測，并且檢測原理簡單、可靠，有利于微型系統(tǒng)的開發(fā)。乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase,AchE)是生物正常神經(jīng)傳導活動所必不可少的，因有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶的正常功能有抑制作用，乙酰膽堿酯酶常用于酶抑制率法檢測有機磷酸酯類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的存在和超標。雖然出現(xiàn)了許多乙酰膽堿酯酶替代酶源的研究和嘗試(劉洋等.農(nóng)藥殘留檢測用植物酯酶篩選研究.安徽農(nóng)學通報，2012，18(19):41-43;鄧光輝等.用于有機磷農(nóng)藥殘留檢測酯酶的篩選.環(huán)境科學與技術(shù)，2010, 12:99-103)，但從實際效果看，替代酶源的靈敏度和特異性較差，容易誤報，并且成本低廉的主要原因是其是粗酶，實際提純后，價格往往會高于工業(yè)批量生產(chǎn)的乙酰膽堿酯酶。乙酰膽堿酯酶酶促反應產(chǎn)生的熱量較小，檢測靈敏度低，量熱法檢測難度大，商用微量熱計靈敏度能滿足微小熱量變化測量的要求，但穩(wěn)定時間長(幾個小時)，價格高(幾十萬到上百萬人民幣)，只能在實驗室使用，不適于快速檢測和現(xiàn)場使用，難以規(guī)模應用。目前，主要使用微量熱分析手段對乙酰膽堿酯酶的性質(zhì)深入研究和了解，這有助于量熱法應用?？紤]現(xiàn)場速測和規(guī)模應用需求，實現(xiàn)基于乙酰膽堿酯酶的農(nóng)藥檢測量熱方法，采用熱放大這一有效手段，酶促反應熱可通過連續(xù)的酶促反應來提高，最終的熱信號是各級酶促反應熱的總和，能增強有效熱信號強度，提高系統(tǒng)靈敏度、分辨率和選擇性。已有專利(徐斐等，適用于量熱式農(nóng)藥快速檢測的固定化酶的制作方法，ZL 200610147245.2 ;鄭藝華等，實現(xiàn)熱放大的量熱法檢測重金屬用固定化酶的制作方法，201110150133.3)均應用了熱放大原理，但沒有涉及乙酰膽堿酯酶或農(nóng)藥殘留檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服乙酰膽堿酯酶酶促反應產(chǎn)生的熱量較小，用于量熱法檢測難度大和檢測靈敏度低的缺點；實現(xiàn)乙酰膽堿酯酶對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的高敏感度及量熱法適合現(xiàn)場實際試樣快速檢測的共用優(yōu)勢；提供一種基于乙酰膽堿酯酶的放熱量大，易于測量的滿足現(xiàn)場速測和規(guī)模應用需求的農(nóng)藥檢測量熱方法。本發(fā)明的原理是對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測采用酶抑制法和級聯(lián)反應進行，乙酰膽堿酯酶被農(nóng)藥抑制，降低酶促反應速度，產(chǎn)物膽堿的量減少并正比于被抑制的程度，進一步地，膽堿的量可通過膽堿氧化酶和過氧化氫酶的級聯(lián)反應熱量得到，膽堿被膽堿氧化酶催化分解，后者能催化前者催化產(chǎn)生的水解產(chǎn)物-過氧化氫，其反應分別為:
權(quán)利要求
1.一種使用乙酰膽堿酯酶進行農(nóng)藥檢測的量熱方法，其特征在于，采用流動注射固定化酶熱分析系統(tǒng)，系統(tǒng)設置第一反應器和第二反應器，第一反應器中放置固定化乙酰膽堿酯酶，第二反應器中放置固定化膽堿氧化酶和過氧化氫酶，系統(tǒng)設置熱檢測器全程監(jiān)測第二反應器中的酶促反應熱，在一定流量、溫度、PH等反應及分析條件下，包括下列步驟: (1)定量、定濃度的反應底物乙酰膽堿溶液注入并流過第一反應器，第一反應器中發(fā)生乙酰膽堿酯酶酶促反應，乙酰膽堿分解為膽堿和乙酸，流出的為含有膽堿的反應產(chǎn)物溶液； (2)取第一反應器的定量反應產(chǎn)物溶液作為第二反應器的反應底物，注入并流過第二反應器，第二反應器中發(fā)生膽堿氧化酶和過氧化氫酶級聯(lián)酶促反應，膽堿氧化酶催化膽堿分解產(chǎn)生過氧化氫，產(chǎn)生的過氧化氫被過氧化氫酶催化，并放出熱量； (3)熱檢測器監(jiān)測第二反應器的酶促反應熱，作為無抑制的系統(tǒng)響應熱信號； (4)已處理的樣液注入并流過第一反應器，對乙酰膽堿酯酶進行一定時間的抑制，重復步驟(I) (2) (3)得到有抑制的系統(tǒng)響應熱信號； (5)農(nóng)藥的檢測結(jié)果以乙酰膽堿酯酶被農(nóng)藥抑制的程度，按照計算公式:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用乙酰膽堿酯酶進行農(nóng)藥檢測的量熱方法，其特征在于，為消除非特異性熱和干擾，可以設置與第二反應器同為孿生結(jié)構(gòu)的參考反應器，其中放置固定化膽堿氧化酶和過氧化氫酶的空白載體，進行分析時，底物同時、同量注入并流過第二反應器和參考反應器，熱檢測器監(jiān)測第二反應器和參考反應器的熱響應信號差，作為系統(tǒng)響應熱信號。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用乙酰膽堿酯酶進行農(nóng)藥檢測的量熱方法，其特征在于，為簡化檢測步驟和提高檢測速度，可以預先進行步驟(I) (2) (3)得到標準化分析條件下無抑制的系統(tǒng)響應熱信號，并作為已知數(shù)據(jù)，進行檢測時，僅需進行步驟(4)，得到標準化分析條件下有抑制的系統(tǒng)響應熱信號，與已知的無抑制的系統(tǒng)響應熱信號比較，進行步驟(5)，得到相對抑制率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用乙酰膽堿酯酶進行農(nóng)藥快速檢測的量熱方法，其技術(shù)方案是采用酶抑制法和級聯(lián)反應進行，乙酰膽堿酯酶被農(nóng)藥抑制，降低酶促反應速度，產(chǎn)物膽堿的量減少并正比于被抑制的程度，進一步地，膽堿的量可通過膽堿氧化酶和過氧化氫酶的級聯(lián)反應熱量得到。本發(fā)明利用了級聯(lián)反應大大提高了原始熱信號強度以及檢測的靈敏度和分辨率，降低檢測限，并有效提高檢測的準確度；實現(xiàn)了基于乙酰膽堿酯酶的農(nóng)藥檢測量熱方法，集合了乙酰膽堿酯酶對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感度高和量熱方法不受樣品電化學活性物質(zhì)或顏色、渾濁干擾的優(yōu)點；方便現(xiàn)場快速檢測農(nóng)藥殘留，有助于規(guī)?；瘧?。
文檔編號G01N25/48GK103196952SQ201310116550
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月7日
發(fā)明者鄭藝華, 劉君 申請人:青島大學