專利名稱：β2受體生物傳感器、其制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種電化學生物傳感器、制備方法及其應用，特別是一種β 2受體生物傳感器、制備方法及其應用。
背景技術：
β 2腎上腺素能激動劑(簡稱β 2激動劑或β 2配體、俗稱瘦肉精)是一類人工合成激素類藥物，家族成員達數十種之多。其共同作用機制是:β 2激動劑首先結合于細胞膜上的β 2腎上腺素能受體(簡稱β 2受體)，通過G蛋白偶聯(lián)的cAMP信號轉導途徑發(fā)揮正常生理效應，同時還具有增強肌肉，減少脂肪的生理作用，已被濫用作生長促進劑以提高家畜瘦肉率，肉類食品中的該類藥物殘留嚴重危害人民身體健康。現有檢測技術無法根本遏制β 2激動劑的濫用。生物電化學傳感器主要由生物分子識別和信息轉換部件兩部分組合構成。其設計原理是待測物通過生物分子識別部件將被感知物質的非電信號轉換成可測量的電信息，再經過放大信號處理，進行信號輸出。電化學體系借助電極實現電能的輸入或輸出，從而獲得電極表面修飾物質的電信號，常用的為三電極體系。三電極體系包括工作電極、輔助電極(也稱對電極)和參比電極，電流流經工作電極和對電極。電化學方法作為一種分析檢測方法，具有靈敏度高、快速、簡便快捷等優(yōu)點。以電化學為基礎發(fā)展起來的受體生物傳感器技術如今受到了極大的關注。電化學受體生物傳感器是將受體蛋白(或載有該受體蛋白的細胞膜)作為分子識別元件固定于金屬表面從而構建工作電極，當與待測定的配體分析物發(fā)生親合性結合時，可在三電極體系中將這種結合作用轉換、放大并輸出電化學信號。電化學受體生物傳感器技術綜合了現代生物和微電子二大技術，既具有前者受體-配體結合的高度特異性和廣譜性的特點，又具有后者靈敏、快速、操作簡易的特點，這種明顯的優(yōu)勢有望發(fā)展成為強有力的新型檢測技術

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種檢測β 2激動劑的電化學β 2受體生物傳感器，該傳感器通過配體-受體的特異結合，實現對于β 2激動劑的檢測。本發(fā)明的目的之二在于提供該傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該傳感器在檢測β2激動劑中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種β 2受體生物傳感器，為三電極體系傳感器，對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，其特征在于在所述的金電極上修飾有重組β2腎上腺素能受體，該重組β 2腎上腺素能受體該重組β 2腎上腺素能受體為SEQ ID NO:1所示的堿基序列。其氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示
一種制備上述的β 2受體生物傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.將預處理好的金電極浸入ImM巰基丙酸MPA溶液中修飾過夜；
b.將步驟a所得的金電極浸入含400mM 1_乙基_3_ (3-二甲基氨基丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽EDC、200 mM N-羥基琥珀酰亞胺NHS的水溶液中10 min，超純水徹底清洗后浸入含100 mM組氨酸的水溶液中10 min,超純水清洗；
c.將步驟b所得金電極浸入Iμ g/mL的氧化鎳(NiO)納米顆粒水溶液中10 min,超純水清洗；
d.將步驟c所得金電極浸入0.27mg/mL的增溶β 2受體蛋白水溶液中10 30 min,經超純水清洗得到經β 2受體修飾的金電極；
e.將步驟d所得金電極作為工作電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的β 2受體生物傳感器。上述的增容β 2受體蛋白的制備方法是:
a.將β2受體基因的重組工程菌細胞膜用1% DDMN-十二烷基-β -D-麥芽苷-PBS緩沖液進行增溶處理，O C 45min，18000g離心20min，取上清液即為均質的增溶β 2受體蛋白溶液；
b.將步驟a所得增溶β2受體溶液加入Ni2+-NTA親和柱吸附，經50mM咪唑高鹽緩沖液洗柱三次后用200mM咪唑高鹽緩沖液洗脫，部分收集即獲得β 2受體蛋白。一種檢測β 2激動劑的方法， 采用上述的β 2受體生物傳感器進行檢測，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.將工作電極浸入到含有待測樣品中，O C，30 min，超純水清洗；
b.在20 C溫度下，將經步驟a后的工作電極浸入到5.0 mL檢測緩沖溶液中，所述的檢測緩沖溶液為濃度為0.5 M的K3Fe(CN)6/ K4Fe (CN) 6的磷酸鹽緩沖液，其pH為7.4。c.循環(huán)伏安法進行電化學掃描；參數設置:掃描范圍-0.1 "0.55 V,掃描速率100mV/s0本發(fā)明首先利用β 2受體作“靶”，建立一種受體-配體檢測系統(tǒng)，理論上可檢測所有的β 2激動劑，同時由于β 2激動劑行使功能是通過β 2受體介導，因此該系統(tǒng)既具有高通量和廣譜性“生物芯片”的技術效果，同時還具有生物功能檢測的含義。該受體-配體檢測系統(tǒng)具有如下優(yōu)點:1.高特異性一受體與配體的結合具有嚴格的立體構象互補性。
2.高親和力一受體-配體系統(tǒng)親和力一般高于抗原-抗體系統(tǒng)。3.高通量一基于抗原-抗體系統(tǒng)的檢測技術只能檢出一種β 2激動劑，而基于受體-配體系統(tǒng)的檢測技術可一次檢出所有種類的β 2激動劑，將其“一網打盡”。利用基因重組技術可在酵母細胞高效表達β 2受體基因，表達產物β 2受體定位于細胞膜，作為膜蛋白行使功能。在β2受體-配體檢測系統(tǒng)中的“靶”，既可以是該基因重組細胞的膜，也可以是分離純化的受體蛋白，二者各有特點。前者制備工藝簡單，但由于細胞膜成分復雜，導致檢測系統(tǒng)特異性和靈敏度不夠高；后者制備工藝精細復雜，但成分單一，構建的檢測系統(tǒng)特異性和靈敏度都比前者高。本發(fā)明的突出特點主要在于，基于循環(huán)伏安技術，在工作電極上修飾純化增溶的β 2受體蛋白，以此作為分子識別元件構建了三電極體系的電化學β 2受體生物傳感器，與先前申請的細胞膜修飾工作電極(“一種電化學受體生物傳感器及其應用”(申請?zhí)?00910196550.4))的系統(tǒng)相比，本發(fā)明進一步通過分離、純化技術，以獲得的β 2受體蛋白作為分子識別元件構建了新型電化學β 2受體生物傳感器，具有更高的特異性和靈敏度。能更好滿足目前對β 2激動劑現場檢測的迫切需要，為食品安全檢測提供新的技術平臺，可用于進出口檢驗檢疫、食品衛(wèi)生監(jiān)管、畜牧飼養(yǎng)場等現場檢測，具有廣闊的市場應用前景和較大的經濟、社會效益。


圖1為采用空載宿主細胞膜工作電極(對照2)組成的電化學生物傳感器對六種系列濃度的CLE進行獨立循環(huán)伏安法掃描結果。(a) O, (b) 1，(c) 10，(d) 100，(e) 1000，(f) 10000。圖2為采用β 2受體細胞膜工作電極(對照I)組成的電化學生物傳感器對六種系列濃度的CLE進行獨立循環(huán)伏安法掃描結果。(a) O, (b) 1，(c) 10，(d) 100，(e) 1000，(f) 10000。圖3為采用β 2受體蛋白工作電極；CLE的濃度(pM)組成的電化學生物傳感器對六種系列濃度的CLE進行獨立循環(huán)伏安法掃描結果。(a) O, (b) l,(c)10，⑷100 ,Ce)1000，(f) 10000。圖4為圖1中三種電化學生物傳感器峰值電流變化值與CLE濃度對數的關系曲線。(A)空載宿主細胞膜工作電極(對照2) ; (B) β 2受體細胞膜工作電極(對照I) ; (C)β 2 受體蛋白工作電極；CLE 的濃度(pM): (a) 0，(b) 1，(c) 10，⑷ 100，(e) 1000，(f)10000。
具體實施例方式實施例一:增溶β 2受體的純化及制備
人β 2受體基因在畢赤酵母中的克隆、表達，以及重組工程菌細胞膜的制備見“建立一種β 2-激動劑的新的檢測系統(tǒng)的研究”(戴小峰，上海大學碩士研究生論文，2004)，和“一種電化學受體生物傳感器及其應用”(陳宇光等，發(fā)明專利申請?zhí)?00910196550.4，2009)ο增溶β 2受體蛋白的制備:將上述重組工程菌細胞膜用1% DDM (N-十二烷基-β -D-麥芽苷)-PBS緩沖液進行增溶處理，O C 45min, 18000g離心20min，取上清液即為均質的增溶β 2受體蛋白。增溶β 2受體蛋白的部分純化:將上述增溶β 2受體溶液加入Ni2+-NTA親和柱吸附，經50mM咪唑高鹽緩沖液洗柱三次后用200mM咪唑高鹽緩沖液洗脫，部分收集即獲得β 2受:體蛋白。實施例二: β 2受體工作電極的制備
金電極的預處理:金電極首先在5000目的金相砂紙上打磨，再用粒徑由大到小1.0μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的氧化招粉末的懸池液拋光,使金電極表面成光滑鏡面,取出分別在無水乙醇和超純水中超聲5min，然后將金電極放入0.5 M的H2SO4中進行循環(huán)伏安掃描(0-1.5 V電壓范圍)，掃速設置為100 mV/s，約20圈達到穩(wěn)定。然后在氮氣中吹干電極，得到表面清潔的裸金電極。β 2受體工作電極的制備:
a.將上述裸金電極 浸入ImM巰基丙酸(MPA)溶液中修飾過夜；
b.將上述(a)修飾金電極浸入含400mM EDC (1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽)、200 mM NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)的水溶液中10 min，超純水徹底清洗后浸入含100 mM組氨酸的水溶液中10 min,超純水清洗；
c.將上述(b)修飾金電極浸入1μ g/mL的氧化鎳(NiO)納米顆粒水溶液中10 min,超純水清洗；
d.將上述(c)修飾金電極浸入純化增溶β2受體溶液(0.27mg/mL) 10-30 min,經超純水清洗得到β 2受體工作電極；
e.將步驟d所得β2受體工作電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的電化學β 2受體生物傳感器。實施例三:電化學β 2受體生物傳感器應用于β 2激動劑(克倫特羅)的檢測 操作程序:在該三電極電化學傳感器的體系中
a.將上述所得β2受體工作電極浸入到含有100 UL β 2激動劑的待測樣品溶液或陰性對照溶液中，O C，30 min，超純水清洗；
b.將上述a.反應后的β2受體工作電極浸入5.0 mL檢測緩沖溶液(20 C)，檢測緩沖溶液為:0.5 M K3Fe (CN) 6/ K4Fe (CN) 6 的磷酸鹽緩沖液(50 mM, pH 7.4)。c.循環(huán)伏安法進行電化學掃描；參數設置:掃描范圍-0.1^0.55 V,掃描速率100mV/s。β 2激動劑(克倫特羅)的檢測特征:
分別制備克倫特羅(CLE)的六種系列濃度(0，1，10，100，1000，10000 pM)。分別制備三種工作電極，即β 2受體蛋白工作電極，β 2受體細胞膜工作電極(對照1)，空載宿主細胞膜工作電極(對照2)。該三種工作電極組成了三種生物傳感器。使用這三種工作電極組成的電化學生物傳感器分別對六種系列濃度的CLE進行獨立循環(huán)伏安法掃描。結果表明:
1、線性檢測1.0Χ10_12Μ至1.0Χ10-8 M 5個數量級范圍(圖3、圖4 CO)；
2、檢測濃度下限達0.1nM (0.03ppb)(圖3、圖4 (C))；
3、響應快速，靈敏度高，β2受體生物傳感器比β 2受體細胞膜工作電極(對照I)提高近十倍，參見表1。
權利要求
1.一種β 2受體生物傳感器，為三電極體系傳感器，對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，其特征在于在所述的金電極上修飾有重組β 2腎上腺素能受體，該重組β 2腎上腺素能受體為SEQ ID NO:1所示的堿基序列。
2.一種制備根據權利要求1所述的β 2受體生物傳感器的方法，其特征在于該方法的具體步驟為: a.將預處理好的金電極浸入ImM巰基丙酸MPA溶液中修飾過夜； b.將步驟a所得的金電極浸入含400mM 1_乙基_3_ (3-二甲基氨基丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽EDC、200 mM N-羥基琥珀酰亞胺NHS的水溶液中10 min，超純水徹底清洗后浸入含100 mM組氨酸的水溶液中10 min,超純水清洗； c.將步驟b所得金電極浸入Iμ g/mL的氧化鎳(NiO)納米顆粒水溶液中10 min,超純水清洗； d.將步驟c所得金電極浸入0.27mg/mL的增溶β 2受體蛋白水溶液中10-30 min,經超純水清洗得到經β 2受體修飾的金電極； e.將步驟d所得金電極作為工作電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的β 2受體生物傳感器。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的增容β2受體蛋白的制備方法是: a.將β2受體基因的重組工程菌細胞膜用1% DDMN-十二烷基-β -D-麥芽苷-PBS緩沖液進行增溶處理，O C 45min，18 000g離心20min，取上清液即為均質的增溶β 2受體蛋白溶液； b.將步驟a所得增溶β2受體溶液加入Ni2+-NTA親和柱吸附，經50mM咪唑高鹽緩沖液洗柱三次后用200mM咪唑高鹽緩沖液洗脫，部分收集即獲得β 2受體蛋白。
4.一種檢測β 2激動劑的方法，采用根據權利要求1所述的β 2受體生物傳感器進行檢測，其特征在于該方法的具體步驟為: a.將工作電極浸入到含有待測樣品中，O C，30 min，超純水清洗； b.在20 C溫度下，將經步驟a后的工作電極浸入到5.0 mL檢測緩沖溶液中，所述的檢測緩沖溶液為濃度為0.5 M的K3Fe(CN)6/ K4Fe (CN) 6的磷酸鹽緩沖液，其pH為7.4。
c.循環(huán)伏安法進行電化學掃描；參數設置:掃描范圍-0.Γ0.55 V，掃描速率100 mV/So
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β2受體生物傳感器、制備方法及其應用。本β2受體生物傳感器，為三電極體系傳感器，對電極是鉑電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，其特征在于在所述的金電極上修飾有重組β2腎上腺素能受體，該重組β2腎上腺素能受體為SEQ ID NO1所示的堿基序列。本發(fā)明不僅減少了該電化學生物傳感器出現假陰性的檢測結果，也進一步提高了檢測的靈敏度，能更好滿足目前對β2激動劑現場檢測的迫切需要，為食品安全檢測提供了新的技術平臺，可用于進出口檢驗檢疫、食品衛(wèi)生監(jiān)管、畜牧飼養(yǎng)場等現場檢測，具有廣闊的市場應用前景和較大的經濟、社會效益。
文檔編號G01N27/327GK103196970SQ20131009469
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月22日 優(yōu)先權日2012年8月10日
發(fā)明者蘇潔, 沈敏, 戴小峰, 郭敏, 顧鳴, 陳宇光 申請人:上海大學