專利名稱：一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一種生物傳感器及其制備方法，屬于電分析化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄糖是有機(jī)體內(nèi)極為重要的一種物質(zhì)，近年來檢測(cè)葡萄糖含量的文獻(xiàn)已經(jīng)很多，但是他們很多檢測(cè)對(duì)象都是血清，組織液和細(xì)胞液等。廣泛應(yīng)用于檢測(cè)葡萄糖的方法很多，如分光光度法，熒光檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光法，電化學(xué)分析法等，而且這些方法都已被成功用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)葡萄糖。電化學(xué)分析方法靈敏度高，樣品用量少，儀器簡(jiǎn)單，價(jià)格相對(duì)便宜，因此得到了廣泛的應(yīng)用。近年來用電化學(xué)方法檢測(cè)葡萄糖的很多，電化學(xué)方法檢測(cè)葡萄糖通常是利用葡萄糖脫氫酶或者是葡萄糖氧化酶，制成酶生物傳感器。酶生物傳感器是將酶作為生物敏感基元，通過各種物理、化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器捕捉目標(biāo)物與敏感基元之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的與目標(biāo)物濃度成比例關(guān)系的可測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物定量測(cè)定的分析儀器。與其它分析方法相比，電化學(xué)生物傳感器具有便攜、成本低、靈敏度高、穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，再加上CNTs本身的催化和增敏效應(yīng)，使得基于CNTs的酶生物傳感器具有廣闊的應(yīng)用前景。化學(xué)修飾電極是目前最活躍的電化學(xué)和電分析化學(xué)的研究領(lǐng)域之一，賦予電極某種特定的性質(zhì)，可以高選擇性的進(jìn)行所期望的反應(yīng)，克服了未修飾電極測(cè)定時(shí)出現(xiàn)的過電位偏高，反應(yīng)速度慢等缺點(diǎn)，甚至可以用來檢測(cè)沒有電活性的物質(zhì)，在分析化學(xué)領(lǐng)域尤其是在生物傳感器的制備方面得到了廣泛的應(yīng)用。常用的化學(xué)修飾電極有Hg修飾微電極，化學(xué)修飾碳糊微電極，微金屬顆粒修飾微電極，表面分子膜修飾微電極，粉末微電極，酶電極等。現(xiàn)有技術(shù)中有將Ti02-MWNTs_CS的混合物修飾在玻碳電極上，然后再將普魯士藍(lán)電沉積在修飾電極的表面，最后將葡萄糖氧化酶和金納米顆粒吸附在普魯士藍(lán)上制成的葡萄糖生物傳感器檢測(cè)葡萄糖的含量的(Zhang Μ.H., Yuan R.，Chai Y.Q.，LiW.J., Zhong H.A., Wang C.Glucose biosensor based on titanium dioxide-multiwallcarbon nanotubes-chitosan composite and functionalized gold nanoparticles[J].Bioprocess Biosyst.Eng.，2011，34:1143-1150.)。有將 Pt 和 Pd 納米顆粒通過電沉積的方法固定在MWCNTs制成葡萄糖生物傳感器檢測(cè)葡萄糖的，(Cui H.F, Ye J.S，Zhang W.D, LiC.Mj Luong J.H.T.，Sheu F.S.Selective and sensitive electrochemical detectionof glucose in neutral solution using platinum - lead alloy nanoparticle/carbonnanotube nanocomposites [J].Analytica Chimica Acta2007, 594:175-183.)。文獻(xiàn)(ReitzE，Jia Wj Gentile Mj Wang Yj Lei Y.CuO Nanospheres Based Nonenzymatic GlucoseSensor [J].Electroanalysis, 2008，20:2482.)中把CuO納米球固定在玻碳電極上，固定上Nafion膜制備成一個(gè)無酶生物傳感器。這些生物傳感器要么制備方法復(fù)雜，要么靈敏度、穩(wěn)定性不夠好
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足而提供一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器及其制備方法，該方法簡(jiǎn)單易作，制得的傳感器靈敏度高，檢測(cè)限低，抗干擾能力強(qiáng)。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:—種高靈敏度葡萄糖生物傳感器，包括鍍鈀鉬電極、分布在鍍鈀鉬電極表面并交成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的碳納米管、及電極與碳納米管所負(fù)載的葡萄糖氧化酶。一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，包括步驟如下:(I)將打磨好的鉬電極置于K2PdCl4與硫酸的混合溶液中，電沉積電位設(shè)為-0.1到-0.5V (vs.SCE),電沉積10-15S,沖洗、晾干得鈕納米顆粒修飾的鉬電極；(2)配制酶溶液:將葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸處理過的單壁碳納米管溶液，將此酶溶液混合均勻待用；葡萄糖氧化酶在酶溶液中的濃度908U/mL (根據(jù)葡萄糖氧化酶的活性為109U/mg，相當(dāng)于8.3mg/mL)，葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1-10，戊二醛在酶溶液中的濃度為8-10mg/mL,磷酸鹽緩沖溶液pH6.0 8.0，酸處理過的單壁碳納米管溶液在酶溶液中的濃度為
0.2-1.0mg/mL ；(3)將鈀納米顆粒修飾的鉬電極在酶溶液中蘸取3-5次，每次蘸取時(shí)間為10 15s0步驟(I)所述的K2PdC14與硫酸的混合溶液中，K2PdC14濃度為lX10_3mol/L，H2SO4濃度為0.5mol/L。所述的電沉積優(yōu)選電位設(shè)為-0.2V (vs.SCE),電沉積15s。步驟(2)所述的酸處理過的單壁碳納米管溶液的制備方法將每克單壁碳納米管加入400mL6mol/L硝酸中加熱回流6_6.5h，冷卻后過濾，用二次蒸餾水洗至中性，放入烘箱中干燥，然后用二次蒸餾水將其配制成濃度為10mg/mL的水溶液.。磷酸鹽緩沖溶液是0.2754 2.1202g Na2HPO4.12H20 與 0.0517 0.8553gNaH2PO4.2H20配制在250mL的容量瓶中配成。本發(fā)明通過電化學(xué)沉積在鉬電極表面形成很規(guī)則有序的排列的鈀顆粒，鍍鈀的鉬電極表面有許多多孔結(jié)構(gòu)，這種多孔的結(jié)構(gòu)增大了電極的比表面積，增加了酶在電極表面的負(fù)載量，從而使催化活性點(diǎn)大量增加，促進(jìn)了電子的轉(zhuǎn)移速率，提高了電流響應(yīng)的靈敏度。電極的表面較為平整，傳感器表面的碳納米管交聯(lián)在一起，形成了一個(gè)巨大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于電子的傳導(dǎo)，碳納米管大的比表面積也增大了酶在電極表面的負(fù)載量，對(duì)提高電流響應(yīng)靈敏度有一定的貢獻(xiàn)。傳感器表面的鈀納米顆粒和碳納米管有促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移的作用，增大電極的比表面積，增強(qiáng)催化活性，提高了檢測(cè)靈敏度。利用此生物傳感器中酶的高選擇性而避免了其它物質(zhì)的干擾實(shí)現(xiàn)了人體血液中葡萄糖的快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)。同時(shí)本發(fā)明傳感器葡萄糖的檢測(cè)限為5X10_7mOl/L，檢測(cè)限低。本發(fā)明具有電極制作、修飾方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，比其它電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖方法的檢測(cè)限低的特點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明鍍鈀鉬電極的掃描電化學(xué)顯微鏡圖。圖2為本發(fā)明葡萄糖生物傳感器的掃描電化學(xué)顯微鏡圖。圖3為本發(fā)明毛細(xì)管電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖的裝置圖。
圖4為本發(fā)明毛細(xì)管電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖的檢測(cè)池。圖5為本發(fā)明干擾物質(zhì)混合樣的電泳譜圖，a_DA(0.2mM)，b_葡萄糖(0.6mM),c_半胱氨酸(0.5mM)，d-AA (0.5mM)，e_UA (0.8mM)。圖6為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定人血清中葡萄糖的電泳譜圖，a.0, b.0.6mmol/L葡萄糖，c.1.0mmol/L葡萄糖。其中，1、工作電極，2、參比電極，3、對(duì)電極，4、石英玻璃毛細(xì)管，5、參比池，6、檢測(cè)池，7連接管，8、高壓電源，9、進(jìn)樣系統(tǒng)，10、收集系統(tǒng)，11、檢測(cè)池，12、毛細(xì)管，13、負(fù)極，14、正極。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明。實(shí)施例1為最佳實(shí)施例(I)鈀納米顆粒修飾的鉬電極的制備:將一直徑為200 μ m,長度大約為5cm的鉬絲穿入一段約為3cm長的石英毛細(xì)管(250 μ m 1.D., 375 μ m0.D.)中，使石英毛細(xì)管兩端同時(shí)露出鉬絲，將其一端涂滿環(huán)氧樹脂膠，從另外一端緩慢抽回，使鉬絲剛好露至毛細(xì)管端口，并使之充滿環(huán)氧樹脂膠，24h后，待膠固化。截取一段5cm的銅絲，在金相砂紙上打磨平滑，將露在外面的鉬絲纏繞到銅絲上，在纏繞處涂滿導(dǎo)電銀膠，放在烘箱中70°C下烘30min，最后再用一個(gè)約5cm長的玻璃管(400 μ m 1.D., 700 μ m 0.D.)放在鉬絲和銅絲接口處，用環(huán)氧樹脂膠粘住玻璃管的兩端，晾24小時(shí)后即可使用。用細(xì)金相砂紙將電極打磨平滑，使得鉬絲截面與毛細(xì)管截面平齊，將打磨好的鉬電極分別在二次水、無水乙醇、二次水中各超聲5min，清洗好的鉬電極置于含IX 10_3mol/L K2PdCl4的0.5mol/L H2SO4的混合液中，電沉積電位設(shè)為-0.2V (vs.SCE),電沉積15s。電沉積完成后，用二次水將工作電極沖洗干凈，得到鈀納米顆粒修飾的微電極，室溫環(huán)境下自然晾干。(2)配制酶溶液:配制酶溶液:將葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸處理過的單壁碳納米管溶液，將此酶溶液混合均勻待用；葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:5，葡萄糖氧化酶在酶溶液中的濃度為
8.3mg/mL,戊二醛在酶溶液中的濃度為9mg/mL，磷酸鹽緩沖溶液的濃度0.025mol/L, pH為
7.4，磷酸鹽緩沖溶液的是 1.8131g Na2HPO4.Iffi2O 與 0.1853g NaH2PO4.2H20 配制在 250mL的容量瓶中，酸處理過的單壁碳納米管溶液在酶溶液中的濃度為0.5mg/mL ；(3)將鈀納米顆粒修飾的鉬電極在酶溶液中蘸取3次，每次蘸取時(shí)間為10 15s。圖1和圖2分別為鍍鈀鉬電極和葡萄糖生物傳感器的掃描電鏡圖。從圖1中可以看出，電化學(xué)沉積在鉬電極表面的鈀納米顆粒很有序的排列在鉬電極表面，促進(jìn)了電子的轉(zhuǎn)移速率，提高了電流響應(yīng)的靈敏度。從圖2中可以看出，電極的表面較為平整，傳感器表面的碳納米管交聯(lián)在一起，形成了一個(gè)巨大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于電子的傳導(dǎo)，碳納米管大的比表面積也增大了酶在電極表面的負(fù)載量，對(duì)提高電流響應(yīng)靈敏度有一定的貢獻(xiàn)。實(shí)施例2改變步驟(2)中葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白的質(zhì)量比分別為1:1，1:3，1:8，1:10，其他步驟同實(shí)施例1。
實(shí)施例3改變步驟(2)中酸處理過的單壁碳納米管溶液在酶溶液中的濃度分別為0.2mg/mL,0.8mg/mL, 1.0mg/mL,其他步驟同實(shí)施例1。實(shí)施例4改變步驟(2)中戍二醒在酶溶液中的濃度為4mg/mL, 13mg/mL, 17mg/mL,其他步驟同實(shí)施例1。毛細(xì)管電泳安培檢測(cè)葡萄糖( I)儀器自組裝毛細(xì)管電 泳系統(tǒng)，0_30kV高壓電源(山東師范大學(xué)儀器廠，濟(jì)南)；分離毛細(xì)管(25μ 1.D,375ym 0.D，長度60cm，永年銳灃色譜器件有限公司)；CHI832b電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；過濾器(0.20μπι，頗爾公司)；三電極體系:飽和甘汞電極(參比電極)、鉬電極(對(duì)電極)、鈀納米顆粒修飾微電極作電極)金相砂紙(砂紙WA W5 (06)，上海砂輪廠，上海)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，江蘇)；石英亞沸高純水蒸餾器(金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠，江蘇)；高速離心機(jī)(金壇市醫(yī)療儀器廠，江蘇)。(2)檢測(cè)的方法步驟及最佳條件檢測(cè)方法步驟:使用實(shí)施例1的葡萄糖傳感器，用毛細(xì)管之前，分別用氫氧化鈉溶液、二次水、緩沖溶液清洗，然后利用三維操縱儀將處理好的毛細(xì)管與工作電極對(duì)齊，將高壓調(diào)到18kV，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，看基線電流是否平穩(wěn)，如果基線電流平穩(wěn)后，再將高壓調(diào)到5kV，把配置好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10s，調(diào)電壓為18kV，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到電泳圖進(jìn)行分析。最佳檢測(cè)條件:分離電壓為18kV、檢測(cè)電壓-0.8V、緩沖溶液的濃度為0.025mol/L, pH 為 7.4。重現(xiàn)性和檢測(cè)限在上述檢測(cè)方法和最佳檢測(cè)條件下，對(duì)I X 10_3mol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)行10次平行測(cè)定，葡萄糖峰電流和遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是3.8%和1.4%。在此實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，葡萄糖的檢測(cè)限為5X 10_7mol/L。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)操作，電極制作，修飾方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，比其它電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖方法的檢測(cè)限低。表I毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖所用工作電極、線性范圍、檢測(cè)限對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器，其特征是，包括鍍鈀鉬電極、分布在鍍鈀鉬電極表面并交成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的碳納米管、及電極與碳納米管所負(fù)載的葡萄糖氧化酶。
2.一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，包括步驟如下: (O將打磨好的鉬電極置于K2PdCl4與硫酸的混合溶液中，電沉積電位設(shè)為-0.1到-0.5V,電沉積10-15S,沖洗、晾干得鈕納米顆粒修飾的鉬電極； (2)配制酶溶液:將葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸處理過的單壁碳納米管溶液，將此酶溶液混合均勻待用；葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1-10，葡萄糖氧化酶在酶溶液中的濃度8.3mg/mL,戊二醛在酶溶液中的濃度為8-10mg/mL，磷酸鹽緩沖溶液pH6.0 8.0，酸處理過的單壁碳納米管溶液在酶溶液中的濃度為0.2-1.0mg/mL ； (3)將鈀納米顆粒修飾的鉬電極在酶溶液中蘸取3-5次，每次蘸取時(shí)間為10 15s。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，步驟(I)所述的K2PdCl4與硫酸的混合溶液中，K2PdCl4濃度為I X 10^3mol/L, H2SO4濃度為0.5mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，所述的電沉積選電位設(shè)為-0.2V,電沉積15s。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，步驟(2)所述的酸處理過的單壁碳納米管溶液的制備方法將每克單壁碳納米管加入400mL6mol/L硝酸中加熱回流6_6.5h,冷卻后過濾，用二次蒸餾水洗至中性，放入烘箱中干燥，然后用二次蒸餾水將其配制成濃度為10mg/mL的水溶液.。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器的制備方法，其特征是，磷酸鹽緩沖溶液是每 0.2754 2.1202g Na2HPO4.Iffi2O 加 0.0517 0.8553g NaH2PO4.2H20在250mL的容量瓶中定容制得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高靈敏度葡萄糖生物傳感器及其制備方法，將打磨好的鉑電極置于K2PdCl4與硫酸的混合溶液中電沉積得鈀納米顆粒修飾的鉑電極，將葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸處理過的單壁碳納米管溶液混合得酶溶液，將鈀納米顆粒修飾的鉑電極在酶溶液中蘸取，得到葡萄糖生物傳感器。本發(fā)明具有電極制作、修飾方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，穩(wěn)定性好，比其它電化學(xué)檢測(cè)葡萄糖方法的檢測(cè)限低的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/416GK103175884SQ20131008717
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者王曉蕾, 馬艷芳, 李玲君, 劉冬菊, 王軍 申請(qǐng)人:山東師范大學(xué)