一種基于dna生物傳感器的2-羥基芴的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于電分析化學(xué)和DNA生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于非生物蛋白酶——DNA酶生物傳感器對2-羥基芴的檢測。具體的以金電極為DNA酶載基，首先通過Au-S鍵作用將巰基修飾的DNA修飾到電極表面，并將該DNA修飾電極依次浸沒到含K+、hemin溶液中形成具有類過氧化物酶催化活性的G-DNA酶。在雙氧水介質(zhì)中，通過電極表面G-DNA酶的催化作用引起膜電化學(xué)阻抗的增加，從而實(shí)現(xiàn)對2-羥基芴的檢測。該電化學(xué)DNA生物傳感器制備方法簡單，價(jià)格低廉，檢測周期短，響應(yīng)時(shí)間快，穩(wěn)定性好，選擇性高且具有高靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】—種基于DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于電分析化學(xué)和DNA生物傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種采用非生物蛋白酶DNA酶修飾的電化學(xué)生物傳感器對2-羥基芴的檢測方法，此方法能快速實(shí)現(xiàn)對2-羥基芴的檢測。

【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳經(jīng)(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)因其具有典型的“致癌”、“致畸”和“致突變”作用而引起人們的極大關(guān)注。羥基多環(huán)芳烴作為多環(huán)芳烴的衍生物，同樣具有較強(qiáng)的生物毒性和環(huán)境危害性，而且一些羥基芳香烴類污染物已被列入優(yōu)先監(jiān)測黑名單中。一些羥基多環(huán)芳烴應(yīng)用在許多工業(yè)領(lǐng)域，如煤氣、焦化、煉油、冶金、機(jī)械制造、玻璃、石油化工、木材纖維、化學(xué)有機(jī)合成工業(yè)、塑料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、油漆等，如直接排放則可污染大氣、水、土壤和食品，因此預(yù)防羥基多環(huán)芳烴的污染工作任務(wù)艱巨，實(shí)現(xiàn)其在環(huán)境中的監(jiān)測具有重要意義。到目前為止，用于羥基多環(huán)芳烴的分析檢測的傳統(tǒng)方法有很多種，如紅外光譜法、雙波長紫外分光光度法、直接熒光光度法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、共振光散射法、催化光度法、示差脈沖伏安法、固相微萃取-氣相色譜法、高效液相色譜法、免疫檢測法等，這些傳統(tǒng)的檢測方法存在儀器設(shè)備昂貴、需專業(yè)技術(shù)人員操作、操作費(fèi)時(shí)、樣本需要衍生處理和不能實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測等缺陷，因此建立檢測羥基多環(huán)芳烴的新方法有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]隨著電化學(xué)技術(shù)和生物傳感技術(shù)的發(fā)展，DNA生物傳感器作為一種新型的檢測技術(shù)越來越多的應(yīng)用于檢測環(huán)境污染物，但是到目前為止，應(yīng)用DNA生物傳感器對羥基多環(huán)芳烴的檢測還比較少，如Yang等采用酸變性單鏈DNA修飾的玻碳電極實(shí)現(xiàn)了 1_萘酚的檢測，這種基于鳥嘌呤氧化電流為信號的DNA生物傳感器對1-萘酚具有較高的靈敏性；Liu等課題組采用hairpin DNA修飾的生物傳感器對多種羥基多環(huán)芳烴進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，實(shí)現(xiàn)了對9-羥基芴的高靈敏檢測并實(shí)現(xiàn)了水體中9-羥基芴的分析。值得指出的是，采用DNA生物傳感器對羥基酚類物質(zhì)的檢測原理主要是基于DNA分子與羥基多環(huán)芳烴分子間的非特異性相互作用，因此這種電化學(xué)DNA生物傳感器對酚類化合物不具有選擇性，因此開發(fā)具有高選擇性的DNA的生物傳感器實(shí)現(xiàn)對羥基多環(huán)芳烴的檢測具有十分重要的意義。
[0004]多環(huán)芳烴芴被列為優(yōu)先控制的多環(huán)芳烴，研究發(fā)現(xiàn)，芴在體內(nèi)酶活化的作用下可以發(fā)生代謝作用，其代謝的產(chǎn)物主要是2-羥基芴和9-羥基芴，也是一類具有較高生物活性和強(qiáng)毒性的致癌物質(zhì)。此外，因二者是同分異構(gòu)體在采用色譜法、光譜法進(jìn)行分析時(shí)往往會(huì)互相產(chǎn)生干擾，且需對分析信號進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)計(jì)量處理。到目前為止，應(yīng)用電化學(xué)DNA傳感器對2-羥基芴化合物的檢測還未見報(bào)道。因此，開發(fā)對2-羥基芴靈敏性高、選擇性強(qiáng)的DNA生物傳感器具有很大的挑戰(zhàn)性。
[0005]綜上所述，建立、完善和發(fā)展2-羥基芴化合物的DNA生物分析方法是分析化學(xué)和環(huán)境化學(xué)的難點(diǎn)研究課題，既可為環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)及職業(yè)安全評估提供參考，同時(shí)開發(fā)一種新的高靈敏、低成本的檢測方法對完善現(xiàn)有檢測技術(shù)手段亦具有重要意義和較好的應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種基于DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]一種基于DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法，包括以下步驟:
[0009]I)電極的處理:
[0010]將金電極在鹿皮拋光布上用膏狀a-Al2O3拋光至鏡面，拋光后洗去表面污物，并依次在乙醇和超純水中超聲清洗，重復(fù)三次；然后在H2SO4溶液中經(jīng)循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，最后用超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，得到表面干凈的金電極；
[0011]2) DNA溶液的配制:
[0012]將固體DNA序列用Tris-NaClO4緩沖溶液溶解并稀釋到一定濃度，用漩渦振蕩器混勻，靜置于室溫下備用；
[0013]3) DNA修飾電極的制備:
[0014]將上述步驟I)活化處理的金電極浸泡在上述步驟2)配制的DNA溶液中，靜置于室溫下。巰基修飾的DNA通過Au-S鍵作用自組裝于金電極表面，從而得到DNA修飾電極；
[0015]4)酶活性DNA修飾電極的制備:
[0016]將上述步驟3)制備的DNA修飾的金電極依次浸泡在Tris-NaClO4緩沖溶液配制的KC104、hemin溶液中各lh，從而得到具有類過氧化物酶催化活性的DNA修飾電極。
[0017]優(yōu)選地，上述步驟2)中所述DNA濃度為2-20 μ Μ。
[0018]優(yōu)選地，上述步驟4)中所述K+濃度為5_50mM。
[0019]優(yōu)選地,上述步驟4)中所述hemin濃度為2-10 μ M。
[0020]本發(fā)明中，所使用的DNA序列是本領(lǐng)域人員所熟悉的，其獲得可以通過供應(yīng)商獲得。
[0021]本發(fā)明的另一方面，涉及應(yīng)用如上述制備方法得到的DNA修飾電極對2-羥基芴的檢測方法，其具體檢測方法為:以鉬絲電極為對電極，銀/氯化銀(飽和KCl溶液)為參比電極，以DNA修飾的金電極為工作電極構(gòu)筑三電極體系，先將DNA修飾電極在K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗測量，測完后用Tris-NaClO4緩沖溶液淋洗，然后置于緩沖溶液配制的不同濃度的含過氧化氫的2-羥基芴溶液中，再進(jìn)行電化學(xué)阻抗測定。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0023]1.本發(fā)明所采用的DNA修飾電極，與傳統(tǒng)的酶修飾電極相比具有成本較低、易于貯存的優(yōu)勢；
[0024]2.本發(fā)明所采用的DNA修飾電極是通過金-硫鍵作用將DNA自組裝于金電極表面，與傳統(tǒng)的酶修飾電極相比具有熱穩(wěn)定性高的優(yōu)勢；
[0025]3.本發(fā)明所采用的DNA修飾電極具有高催化活性、高專一性的優(yōu)點(diǎn)；
[0026]4.本發(fā)明所制備的DNA修飾電極對2-羥基芴的檢測具有靈敏性高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為金電極及DNA修飾的金電極的阻抗譜圖；
[0028]圖2為使用本發(fā)明的DNA修飾電極分別與K+、hemin、lmM2_羥基芴作用前后的尼奎斯特阻抗譜圖=DNA膜(〇)，與K+作用(.)；與hemin作用(?);與2-羥基芴作用(■);其中，橫坐標(biāo)代表電化學(xué)阻抗的實(shí)部(電阻)，單位為Ω 縱坐標(biāo)代表電化學(xué)阻抗的虛部(電容)，單位為Ω.cm2 ;
[0029]圖3為DNA酶電極對2_羥基芴、9_羥基芴及緩沖體系中的的Λ Rct響應(yīng)情況。

【具體實(shí)施方式】
[0030]以下實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明做更詳細(xì)的描述，但所述實(shí)施不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0031]實(shí)施例1
[0032]I)將金電極在鹿皮拋光布上用0.05 μ m的a -Al2O3粉末拋光至鏡面，拋光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去離子水中超聲清洗，每次2?3min，重復(fù)三次；然后在Imol/L H2SO4溶液中經(jīng)循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，最后用去離子水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，即可得到表面干凈的金電極；
[0033]2)將活化處理的金電極浸泡在預(yù)先配制的I μ M的DNA溶液中，靜置于室溫下3天，即得到DNA修飾電極；
[0034]3)將DNA修飾電極依次浸泡在Tris-NaClO4緩沖溶液配制的20mM的KC104、I μ M的hemin溶液中各lh，得到DNA酶修飾電極。
[0035]實(shí)施例2
[0036]將制備的DNA修飾電極依次浸泡在TriS-NaClO4緩沖溶液配制的20mM KClO4Uu Mhemin溶液中各Ih得到的具有酶催化活性的DNA修飾電極作為工作電極，以Ag/AgCl (飽和KCl溶液)電極為參比電極，鉬電極為對電極構(gòu)筑三電極體系，應(yīng)用PARSTAT2273電化學(xué)綜合測試系統(tǒng)對 Tris-NaClO4 配制的濃度分別為 5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L及500nmol/L的2-輕基荷溶液中(含雙氧水濃度為5 μ M)分別進(jìn)行電化學(xué)阻抗測定。
[0037]表IDNA修飾電極與2-羥基芴作用前后的電化學(xué)阻抗變化(Λ Rct)
[0038]
2-輕基荷濃度 5 nM 1nM 50 nM 10nM 150 nM 200 ηΜ 500 ηΜ ARct (Ω-ctn2) 83 98139213297 357 758
[0039]實(shí)施例3
[0040]以1mM的KC104、0.5 μ M的hemin溶液分別代替實(shí)施例2中的20mM的KC104、I μ M的hemin溶液，其它條件同實(shí)施例1，應(yīng)用PARSTAT2273電化學(xué)綜合測試系統(tǒng)進(jìn)行電化學(xué)阻抗測定。
[0041 ] 表2DNA修飾電極與2-羥基芴作用前后的電化學(xué)阻抗變化(Λ Rct)
[0042]
2-羥基芴濃度 5nM 1nM 50 nM 10nM 150 ηΜ 200 ηΜ 500 ηΜ ARct (Ω-cm2) 78 85119163207 269 675
[0043]實(shí)施例4
[0044]以9-羥基芴溶液代替實(shí)施例2中的2-羥基芴溶液，其它條件同實(shí)施例1，應(yīng)用PARSTAT2273電化學(xué)綜合測試系統(tǒng)進(jìn)行電化學(xué)阻抗測定。
[0045]表3DNA修飾電極與9-羥基芴作用前后的電化學(xué)阻抗變化(ARct)
[0046]

【權(quán)利要求】
1.一種基于DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法，其特征在于包括以下步驟: 1)電極的處理: 將金電極在鹿皮拋光布上用膏狀ct -Al2O3拋光至鏡面,拋光后洗去表面污物,并依次在乙醇和超純水中超聲清洗，重復(fù)三次；然后在H2SO4溶液中經(jīng)循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，最后用超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，得到表面干凈的金電極； 2)DNA溶液的配制: 將固體DNA序列用Tris-NaClO4緩沖溶液溶解并稀釋到一定濃度，用漩渦振蕩器混勻，靜置于室溫下備用； 3)DNA修飾電極的制備: 將上述步驟I)活化處理的金電極浸泡在上述步驟2)配制的DNA溶液中，靜置于室溫下。巰基修飾的DNA通過Au-S鍵作用自組裝于金電極表面，從而得到DNA修飾電極； 4)酶活性DNA修飾電極的制備: 將上述步驟3)制備的DNA修飾的金電極依次浸泡在Tris-NaClO4緩沖溶液配制的KClO4, hemin溶液中各lh，從而得到具有類過氧化物酶催化活性的DNA修飾電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于DNA生物傳感器的2-羥基芴的測定方法，其特征在于:所述緩沖溶液中KClO4濃度為5?50mM，hemin濃度為2?10 μ M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:所使用的DNA為5'端含雙硫修飾的共24個(gè)堿基的單鏈DNA序列，共包含兩部分:靠近DNA的5'端I?7的胸腺嘧啶堿基為柔性間隔基團(tuán)及可以形成DNA酶結(jié)構(gòu)的10?26堿基部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述DNA的濃度為2?20μ Μ。
5.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述制備方法得到的DNA修飾電極對2-羥基芴檢測的方法，其特征在于具體步驟為:以鉬絲電極為對電極，銀/氯化銀(飽和KCl溶液)為參比電極，以DNA修飾金電極為工作電極構(gòu)筑三電極體系，先將DNA修飾電極在K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗測量，測完后用緩沖溶液淋洗，然后置于緩沖溶液配制的不同濃度梯度的含過氧化氫的2-羥基芴溶液中，然后再進(jìn)行電化學(xué)阻抗測定，比較作用前后阻抗值的變化。
6.如權(quán)利要求5所述的DNA修飾的金電極在水中對2-羥基芴的檢測。
【文檔編號】G01N27/26GK104165914SQ201410323754
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月6日
【發(fā)明者】劉新會(huì), 梁剛, 于艷君, 劉冠男, 鞏文雯, 成登苗 申請人:北京師范大學(xué)