專利名稱：編碼玉蜀黍除草劑抗性基因的多核苷酸和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生或增強植物中的除草劑抗性的組合物和方法。此外，本發(fā)明涉及已用本發(fā)明的組合物遺傳轉(zhuǎn)化的植物。
背景技術(shù)：
在農(nóng)作物的商業(yè)生產(chǎn)中，希望容易且快速地從農(nóng)作物植物的田地中清除不需要的植物(即，“雜草”)。理想的處理將是可應(yīng)用于整塊田地但僅清除不需要的植物同時使農(nóng)作物植物不受傷害的處理。一種這樣的處理系統(tǒng)涉及對除草劑耐受的農(nóng)作物植物的使用。當(dāng)除草劑噴灑在除草劑耐受農(nóng)作物植物的田地上時，農(nóng)作物植物繼續(xù)茁壯成長而非除草劑耐受雜草被殺死或嚴(yán)重?fù)p害。針對特定除草劑的農(nóng)作物耐受性可以通過將基因工程改造到農(nóng)作物內(nèi)來賦予，所述基因編碼合適的除草劑代謝酶。在一些情況下，這些酶和編碼其的核酸起源于植物。在其他情況下，它們衍生自其他生物 ，例如微生物。參見例如，Padgette等人(1996) “New weedcontrol opportunities !Development of soybeans with a Round UP Ready geneIPVasil (1996)“Phosphinothricin_resistant crops,，，2個參考文獻(xiàn)都在Herbicide-ResistantCrops,編輯 Duke (CRC Press, Boca Raton, Florida)第 54-84 頁和第 85-91 頁。事實上，轉(zhuǎn)基因植物已進(jìn)行工程改造以表達(dá)來自多種生物的多種除草劑耐受基因，包括編碼大鼠細(xì)胞色素P4507A1和酵母NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的嵌合蛋白質(zhì)的基因(Shiota等人(1994)Plant Physiol.106:17)，以及其他植物 P450 基因(參見，例如，Didierjean,L.等人(2002) Plant Physiol.130:179-189 ；Morant, M.S.等人(2003) Opinion inBiotechnology 14:151-162)。賦予針對除草劑耐受性的其他基因包括:乙酰輕酸合酶(“AHAS”)，其已發(fā)現(xiàn)對表達(dá)其的植物賦予針對多個ALS除草劑類型的抗性，并且已引入多種植物內(nèi)(參見，例如，Hattori等人(1995)Mol.Gen.Genet.246:419);谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶(Aono等人(1995)Plant Cell Physiol.36:1687);和關(guān)于各種磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(Datta 等人(1992) Plant Mol.Biol.20:619)。盡管除草劑耐受農(nóng)作物植物目前是商購可得的，但農(nóng)作物生產(chǎn)的每個方面中的改善是持續(xù)需要的。不幸的是，目前商購可得的除草劑和農(nóng)作物都具有可以限制其在商業(yè)農(nóng)作物生產(chǎn)中的有用性的特定特征。特別地，個別除草劑具有針對常見雜草物種的不同和不完全的活性譜。除草劑的乙酰乳酸合酶或ALS (也稱為AHAS)家族通過抑制氨基酸的支鏈的產(chǎn)生來控制雜草，所述氨基酸是植物生長和發(fā)育所必需的。特別地，它們與植物ALS酶結(jié)合。在這個家族中常用的除草劑尤其包括煙嘧黃隆、玉嘧黃隆和綠黃隆。這個種類中的除草劑可以是相當(dāng)農(nóng)作物特異的。本發(fā)明的實施方案涉及針對除草劑的ALS抑制類別的成員抗性的植物，所述ALS抑制類別包含除草劑的5個亞類，包括但不限于除草劑的磺酰脲(SU)家族和除草劑的咪唑啉酮家族。除草劑的色素合成抑制類別靶向允許植物合成色素的酶，所述色素例如類胡蘿卜素色素或葉綠素色素。色素的喪失導(dǎo)致葉綠素的光破壞和植物組織的增白，這是許多除草齊IJ常稱為“漂白”除草劑的原因。漂白除草劑的亞類的例子是HPro抑制類別，這抑制4-羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD) (Lee等人(1997) Weed Sc1.45:601-609)。這個家族的除草劑包括但不限于尤其是硝草酮(mesotrione)、tembotrione、苯卩比唑草酮(topramezone)和橫草酮。由于除草劑的代謝，玉米對硝草酮一般是耐受的(Mitchell等人(2001)Pest Mgt.Sc1.57:120-128)。相同的解毒系統(tǒng)可以給予針對硝草酮和一些SU除草劑的耐受性(Green&WiIIiams (2004)Proceedings Weed Science Society of America 44:13)。本發(fā)明的實施方案涉及針對除草劑的色素合成抑制類別的成員抗性的植物。除草劑的原卟啉原氧化酶(PPO)抑制類別干擾葉綠素的合成，從而導(dǎo)致產(chǎn)生高度活性的化合物(自由基)的化合物。這些活性化合物破壞細(xì)胞膜，這導(dǎo)致與這些產(chǎn)物的芽后(post-emergence)應(yīng)用相關(guān)的燒葉。這個家族中的除草劑包括但不限于尤其是三氟羧草醚、氟黃胺草醚、乳氟禾草靈、磺胺草唑、氟酮唑草、酰亞胺苯氧乙酸和氟嗪酮。本發(fā)明的實施方案涉及針對除草劑的PPO抑制類別的成員抗性的植物。光系統(tǒng)II (PSII)抑制除草劑具有涉及與光系統(tǒng)II的電子傳遞鏈中的組分相互作用的作用方式。光合作用要求電子從光系統(tǒng)II傳遞到光系統(tǒng)I。這個電子傳遞鏈中的關(guān)鍵步驟是在類囊體膜中由D1蛋白質(zhì)還原質(zhì)體醌(PQ)。PSII抑制劑除草劑與D1蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制PQ結(jié)合且中斷電子傳遞過程。這導(dǎo)致植物不能固定二氧化碳且不能產(chǎn)生植物存活所需的碳水化合物。電子傳遞中的阻斷還引起氧化應(yīng)激和引起快速細(xì)胞損傷的自由基的產(chǎn)生。PSII抑制除草劑由幾個除草劑家族代表,包括均三氮苯、三嗪酮(triazinone)(不對稱的三嗪)、取代的尿素、尿嘧啶、噠嗪酮、氨基甲酸苯酯、腈、苯并噻二唑、苯基噠嗪和酰胺。本發(fā)明的實施方案涉及針對除草劑的PSII抑制類別的成員抗性的植物。合成生長素除草劑是廣泛使用的除草劑類別，其模擬由植物生產(chǎn)的天然生長素激素。生長素調(diào)節(jié)許多植物過程，包括細(xì)胞生長和分化。生長素在植物中一般以低濃度呈現(xiàn)。合成生長素除草劑模擬天然生長素且在細(xì)胞中引起相對高的濃度，這導(dǎo)致快速的生長應(yīng)答。用這些除草劑處理的易感植物顯示出可以稱為‘生長素超劑量’的癥狀，并且由于增加速度的無規(guī)且不受控制的生長而最終死亡。本發(fā)明的實施方案涉及針對除草劑的合成生長素類別的成員抗性的植物。本發(fā)明的一些實施方案基于負(fù)責(zé)玉蜀黍中重要的除草劑抗性機制的基因的精細(xì)作圖、克隆和表征。已知從20世紀(jì)90年代早期開始,玉蜀黍(玉蜀黍(Zea mays) L.)中針對磺酰脲除草劑亞型(煙嘧黃隆[Dupont Accent 除草劑]、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆和噻黃隆)的天然耐受性受單基因(由 Kang(1993) Journal of Heredity84 (3):216-217 命名為 nsf)的控制，具有顯性的抗性和隱性的敏感 性(Harms等人(1990) Theor.Appl.Genet.80:353-358 ；Kang (1993)同上；Green & Uhlrich (1993) Weed Sc1.41:508-516 ；Green& Uhlrich (1994)Pestic.Sc1.40 =187-191)。還已知耐受的玉蜀黍植物通過羥基化作用來代謝煙嘧黃隆，具有細(xì)胞色素 P450 的特征(Fonne-Pfister 等人(1990)Pesticide Biochem.Ptysiol.37:165-173 ；Brown & Cotterman(1994)Chem.Plant Prot.10:47-81)。已提出負(fù)責(zé)決定對一些磺酰脲除草劑的耐受性的相同玉米基因還負(fù)責(zé)對苯達(dá)松(Barrett等人(1997)Role ofcytochrome P—450 in herbicide metabolism and selectivity and multiple herbicidemetabolizing cytochrome P_450activities in maize.1n Κ.K.Hatzios,編輯Regulationof Enzymatic Systems Detoxifying Xenobiotics in Plants.Dordrecht:KluwerAcademic.第 35-50 頁；Green(1998)Weed Technologyl2:474-477)和 HPF1D 抑制劑除草劑例如硝草酮(Green & Williams (2004)同上；Williams 等人(2005) HortScience40 (6):1801-1805)的耐受性。玉蜀黍物理圖譜和整合標(biāo)記的發(fā)展中的近期進(jìn)展(Bortiri等人(2006) Curr Opin Plant Biol.9(2):164-71)已允許用于鑒定Nsfl基因座的定位克隆法。本發(fā)明的實施方案的Nsfl抗性基因編碼與細(xì)胞色素P450家族相關(guān)的新基因。盡管多種細(xì)胞色素P450基因已得到描述，但它們在其對不同病原體的應(yīng)答和確切作用方面廣泛不同。本公開內(nèi)容中描述的新細(xì)胞色素P450基因已證實提供針對眾多除草劑改善的耐受性或抗性，所述除草劑包括煙嘧黃隆、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆、噻黃隆和硝草酮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及包括分離的多核苷酸的實施方案，所述分離的多核苷酸包含編碼能夠賦予針對至少一種除草劑的抗性的多肽的核苷酸序列，其中當(dāng)基于Needleman-Wunsch比對算法與SEQ ID NO:1比較時，所述多肽具有至少85、90或95%同一性的氨基酸序列，或所述核苷酸序列的互補體，其中所述互補體和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。實施方案的多核苷酸賦予針對其的抗性的除草劑包括除草劑的ALS抑制類別；色素合成抑制類別；ΡΡ0抑制類別；PS II抑制類別；和合成生長素類別的成員。實施方案的多核苷酸可以賦予針對來自相同類別、或來自不同類別的一種或多種除草劑的抗性，包括來自所有5個類別的代表性成員。本發(fā)明 的另外的實施方案包括包含實施方案的多核苷酸的載體，和包含與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接的實施方案的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體。還包含的是各自包含本發(fā)明的實施方案的重組DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞、以及植物和種子。還包括的是包含編碼負(fù)責(zé)目的性狀的多肽的另外多核苷酸的植物，所述多肽例如具有草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的多肽、殺蟲Bt多肽、和其他目的多肽。包含這些多核苷酸的植物包括單子葉植物和雙子葉植物，包括但不限于玉蜀黍、小麥、大麥、燕麥、柳枝稷、高粱、稻、大豆、低芥酸菜子、馬鈴薯、棉花和向日葵。由本發(fā)明具體體現(xiàn)的方法包括I)用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，其包括用本發(fā)明的實施方案的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，2)用于生產(chǎn)植物的方法，其包括用本發(fā)明的實施方案的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且由所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物，和3)賦予或增強針對至少一種除草劑的抗性的方法，其包括用本發(fā)明的實施方案的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，由此賦予或增強針對至少一種除草劑的抗性，例如除草劑的ALS抑制類別；色素合成抑制類別；ΡΡ0抑制類別；PS II抑制類別；和合成生長素類別的成員。此外，本發(fā)明的實施方案是Nsfl序列的變體等位基因，其中特定的單個氨基酸改變(參見實施例2)使得該基因不起作用，從而導(dǎo)致對于大多數(shù)玉米對其抗性的至少一種ALS或HPH)抑制劑除草劑的敏感性。因此，由本發(fā)明具體體現(xiàn)的另外方法是使用Nsfl基因的變體作為育種策略中的標(biāo)記的方法，以避免摻入敏感的等位基因。本發(fā)明還包含了改變植物細(xì)胞中能夠賦予針對至少一種除草劑的抗性的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法，其包括:(a)用本發(fā)明的實施方案的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在適合于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生改變水平的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)能夠賦予針對至少一種除草劑的抗性?？梢再x予針對其的抗性的除草劑包括例如除草劑的ALS抑制類別；色素合成抑制類別；ΡΡ0抑制類別；PS II抑制類別；和合成生長素類別的成員。實施方案的多核苷酸可以賦予或增強針對其的抗性的除草劑包括但不限于選自除草劑的ALS抑制類別的除草劑，例如煙嘧黃隆、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆、咪草煙、綠黃隆、氯嘧黃隆、醚苯黃隆、氟唑啶草、和滅草喹。此外，此種除草劑可以選自除草劑的色素合成抑制類別，例如異嗎:氟草、苯批唑草酮、磺草酮(sulcatrione)和tembotrione。此種除草劑還可以選自自除草劑的PPO抑制類別，例如三氟羧草醚、flumioxan和磺胺草唑。任選地,此種除草劑可以選自除草劑的P S II抑制類別，例如敵草隆、利谷隆、苯達(dá)松和綠麥隆。此種除草劑還可以選自除草劑的合成生長素類別，例如麥草畏。實施方案的方法包括測定植物中實施方案的多核苷酸或Nsfl基因座的存在的方法，其包含下述的至少一種:(a)從植物中分離核酸分子，且通過嘗試擴增與多核苷酸同源的序列測定Nsfl基因是否存在；或(b)從植物中分離核酸分子，且進(jìn)行DNA雜交，或(c)從植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSFl蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，或(d)從植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSFl蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行ELISA測定，由此測定植物中權(quán)利要求1的多核苷酸的存在。實施方案還包含的是具有針對至少一種除草劑增強的耐受性的植物，其包含在重組DNA構(gòu)建體中的Nsfl基因。此種植物進(jìn)一步包含第二種除草劑抗性基因，其提供針對選自除草劑類別的除草劑的一定水平的耐受性，所述除草劑類別選自:(a) ALS 抑制類別;(b)色素合成抑制類別；(c) PPO 抑制類別；(d)PS II抑制類別；和(e)合成生長素類別；從而使得Nsfl基因的存在對植物賦予的針對相同除草劑的耐受性水平高于由包含第二種除草劑抗性基因但不包含Nsfl基因的植物顯示的耐受性水平。實施方案還包含的是包含Nsfl基因的大豆植物，其中此種大豆植物還顯示出大豆胞囊線蟲抗性。此種植物已通過轉(zhuǎn)化或植物育種技術(shù)產(chǎn)生,并且可以已由種質(zhì)進(jìn)行育種，所述種質(zhì)例如選自下述的那些:Peking、PI88788、PI89772、PI90763、PI209332、PI404189A、 1437654、？14384898、？1467312、？1468916、他代￥丨8、北7-233、和衍生自所列出的來源中的任何一種的后代。


圖1 (a-e)是使其與其他已知細(xì)胞色素P450多肽(SEQ ID NOs:3_13)比較的實施方案的多肽序列(SEQ ID N0:2)的多重序列比對。圖1d還指出了細(xì)胞色素P450家族的最常見的保守結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 14)的位置。比對中的相同殘基以大寫字母指出。圖2(a_b)是幾種敏感和抗性玉米系的多肽序列的多重序列比對，顯示細(xì)胞色素P450家族的最常見的保守結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:14)以及序列中的變異。
具體實施例方式本發(fā)明的實施方案提供了涉及誘導(dǎo)植物中的除草劑抗性的組合物和方法。組合物是賦予或增強針對一個或多個除草劑類別的一個或多個成員的抗性的新核苷酸和氨基酸序列，包括ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PS II抑制、和合成生長素除草劑類別，其成員包括但不限于煙嘧黃隆、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆和硝草酮。特別地，某些實施方案提供了具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的多肽、及其變體和片段。進(jìn)一步提供了分離的核酸分子、及其變體和片段，其包含編碼SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼SEQ ID NO:2的多肽的天然核苷酸序列的一個例子在SEQ ID NO:1中闡述。本文還公開了植物、植物細(xì)胞、種子和微生物，其包含編碼實施方案的多肽的核苷酸序列。實施方案的全長多肽(SEQ ID NO:2)與細(xì)胞色素P450家族的已知多肽共享不同程度的同源性。特別地，實施方案的新多肽與從下述分離的細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)共享同源性:稻(Oryza sativa):登記號 XP_469850 (SEQ ID NO:3)，ABC69856 (SEQ ID NO:4) ；XP_469849 (SEQ ID NO:11)和 XP_469851 (SEQ ID NO:12);和 XP_469852 (SEQ ID NO:13)和瑞士黑麥草(LoIium rigidum):登記號 AAK38080 (SEQ ID NO:5) ；AAK38079 (SEQ IDNO:6) ；AAK38081(SEQ ID NO:7) ；BAD27508(SEQ ID NO:8) ；BAD27507(SEQ ID NO:9)和BAD27506 (SEQ ID NO:10)。圖1提供了 SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列與稻和瑞士黑麥草細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)(SEQ ID NOs:3_13)的比對。使用GAP程序進(jìn)行的氨基酸比對指出SEQ ID NO:2與稻和瑞士黑麥草細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)共享表I中所示的序列相似性。表1:NSF1肽與其他細(xì) 胞色素P450肽的比較
其他細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì) I百分比同一性I百分比相似性 XP—469850(SEQ ID NO:3)67%76%
ABC69856(SEQ ID NO:4)67%76%
AAK38080(SEQ ID NO:5)68%76%
AAK38079(SEQ ID NO:6)67%77%
AAK38081(SEQ ID NO:7)67%76%
BAD27508(SEQ ID NO:8)67%76%
其他細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)百分比同一性百分比相似性
權(quán)利要求
1.一種測定植物中編碼NSFl蛋白質(zhì)的多核苷酸的存在的方法，其包含下述的至少一種: Ca)從所述植物中分離核酸分子，且通過嘗試擴增與編碼NSFl蛋白質(zhì)的多核苷酸同源的序列測定編碼NSFl蛋白質(zhì)的多核苷酸是否存在，或 (b)從所述植物中分離核酸分子，且使用與編碼NSFl蛋白質(zhì)的多核苷酸同源的序列進(jìn)行DNA或RNA雜交，或 (c)從所述植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSFl蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，或 (d)從所述植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSFl蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行ELISA測定，由此測定所述植物中編碼NSFl蛋白質(zhì)的多核苷酸的存在。
2.一種測定植物中故/2基因座的存在的方法,其包含下述的至少一種: Ca)從所述植物中分離核酸分子，且通過嘗試擴增與編碼NSFl蛋白質(zhì)的多核苷酸同源的序列測定Λ&/7基因是否存在，或 (b)從所述植物中分離核酸分子，且使用與編碼NSFl蛋白質(zhì)的多核苷酸同源的序列進(jìn)行DNA或RNA雜交，或 (c)從所述植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSFl蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，或 (d)從所述植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSFl蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行ELISA測定，由此測定所述植物中Λ&/7基 因座的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼玉蜀黍除草劑抗性基因的多核苷酸和使用方法。具體地，本發(fā)明涉及編碼可以賦予針對至少一種除草劑的抗性的基因的多核苷酸序列。它進(jìn)一步涉及攜帶包含所述多核苷酸序列的嵌合基因的植物和植物種子，所述多核苷酸序列增強或賦予針對至少一種除草劑的抗性，以及制備所述植物和種子的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可以用作分子標(biāo)記的序列，其依次可以用于鑒定玉米系中起因于新雜交的目的區(qū)域，并且通過避免敏感系快速且有效地選擇最佳系用于育種策略。
文檔編號G01N33/68GK103146828SQ201310073128
公開日2013年6月12日 申請日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者T.丹, A.D.小圭達(dá), C.B.哈策爾, B.李, M.E.威廉斯 申請人:納幕爾杜邦公司