專利名稱：一種抗體檢測試劑盒(OmpC-IgA)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測抗大腸桿菌外膜孔道蛋白C IgA抗體的免疫分析檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
大腸桿菌是人體腸道內(nèi)的正常細(xì)菌之一，一般情況下不致病。但在某些特殊情況下，當(dāng)機(jī)體對大腸桿菌的某種蛋白過激反應(yīng)時(shí)，可發(fā)生腹痛、腹瀉等腸炎癥狀。研究表明，一種病因復(fù)雜的非特異性炎癥性腸病((Inflammatory Bowel Disease, IBD)與機(jī)體對大腸桿菌外膜孔道蛋白C的過激反應(yīng)有關(guān)，大約有50%的IBD患者血清抗OmpC的IgA抗體比正常人高2倍以上，因此，通過檢測血清中抗OmpC的IgA可以輔助診斷IBD?，F(xiàn)有檢測OmpC抗原的雙抗夾心法酶聯(lián)免疫試劑盒，但沒有檢測OmpC抗體的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方便、靈敏、準(zhǔn)確的檢測OmpC抗體的免疫分析檢測試劑盒，具體來說是檢測人抗大腸桿菌OmpC-1gA抗體的免疫分析檢測試劑盒。本發(fā)明提供了一種檢測OmpC-1gA抗體的免疫分析檢測試劑盒，該試劑盒包括:包被有OmpC的微孔板、酶標(biāo)記抗人I gA抗體、陰性對照品、陽性對照品、顯色劑、洗滌液。其中包被微孔板的OmpC是用重組的蛋白或者從大腸桿菌純化所得的蛋白。所述的酶標(biāo)記抗人IgA抗體采用化學(xué)方法偶聯(lián)得到，標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，所述偶聯(lián)方法為戊二醛法。用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。所述的洗滌液為0.05% -0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1:1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。所述的樣品稀釋液為含0.1%吐溫-20的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液，所述的抗體稀釋也為含0.1 %吐溫-20的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液。本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測血清中抗OmpC-1gA含量的方法，包括步驟:(I)用權(quán)利要求1-8任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測，向OmpC包被的酶標(biāo)板孔中加入對照品或待測樣品溶液，再加入酶標(biāo)記的抗人IgA抗體，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑、終止液，用酶標(biāo)儀或化學(xué)發(fā)光儀測定吸光度值；(2)分析檢測結(jié)果。本發(fā)明試劑盒的檢測原理為:將OmpC包被在固相載體上，加入待檢測樣品或?qū)φ掌?，樣品或?qū)φ掌分械目筄mpC抗體就跟固相載體上的OmpC蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，用洗滌液去除無關(guān)的成分，然后加入酶標(biāo)記的抗人IgA抗體，酶標(biāo)抗體與微孔板上的抗原-抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，通過洗滌出去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中含抗OmpC-1gA抗體的量呈正相關(guān)，與陰性對照品和陽性對照品檢測所得的值進(jìn)行比較即可得出樣品中是否含有抗OmpC-1gA抗體，以及抗體的含量多少。
具體實(shí)施例方式提供下述實(shí)施例是為了更好地理解本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1大腸桿菌OmpC制備試劑及儀器I)試劑大腸桿菌宿主菌DH5 a、BL21 (DE3)，克隆載體pCR2.lT-vector，表達(dá)質(zhì)粒pET28a (+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA連接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性內(nèi)切酶BamH
I,Hind III 和 EcoR 1.BamH I, DL2000DNA Marker、T4DNA 連接酶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，DNA膠回收試劑盒，IPTG等2)儀器普通搖床SCS-24 ;隔水式恒溫電熱培養(yǎng)箱；Biophotometer分光光度計(jì)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)Centrifuge 5810R、臺(tái)式離心機(jī)MiniSpin ;高速冷凍離心機(jī)；蛋白質(zhì)電泳儀以及凝膠成像系統(tǒng)；PCR儀；超聲裂解儀；恒溫金屬??；HIS蛋白純化柱等。3)實(shí)驗(yàn)方法載體構(gòu)建設(shè)計(jì)引物ATTG GATC CGCT CCGAAAGA 和 TCTC GAGT TAAG CCTG CGGCT 從模板 DNA中PCR擴(kuò)增出OmpC片段，膠回收試劑盒回收片段后連接到pCR2.1克隆載體進(jìn)行測序鑒定。將鑒定正確的序列克隆至表達(dá)載體pET28a(+)中，酶切位點(diǎn)為EcoR 1.BamH I，同時(shí)載體上有6XHIS標(biāo)簽，便于后續(xù)的蛋白純化。表達(dá)將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，通過抗性篩選陽性表達(dá)菌株。將篩選出來的陽性菌液按1: 1000的比例接種加有Kan抗性的LB培養(yǎng)基中，每個(gè)菌接種兩管，一管用于誘導(dǎo)，另一管用于非誘導(dǎo)對照，同時(shí)要接種一管空質(zhì)粒菌作對照。37°C過夜培養(yǎng)至0D600值約為0.4-0.6時(shí)，誘導(dǎo)管和空質(zhì)粒對照管加入IPTG至終濃度為lmmol/L，非誘導(dǎo)對照不加，最終選擇表達(dá)能力高的兩個(gè)菌，用于大量的蛋白的表達(dá)。并按照常規(guī)的SDS-PAGE方法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。純化將表達(dá)的產(chǎn)物用HIS蛋白純化柱純化蛋白，經(jīng)測定純化后的蛋白濃度為403mg/L。實(shí)施例2酶標(biāo)抗人IgA抗體制備辣根過氧化物酶標(biāo)記抗抗體:將抗人IgA抗體與辣根過氧化物酶通過戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)記抗人IgA抗體。方法是將IOmgHRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH6.80.mo I/LPBS 中，將IOmg HRP溶于0.2mol/LpH5.6醋酸鹽緩沖液Iml中，溶解混勻，后加入0.1mol/L Na104溶液1ml，混勻，置冰箱20min，取出加入0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml,室溫放置30min后,加入含5mg抗人IgA抗體的水溶液(或PBS) Iml,混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH值9.6碳酸鈉緩沖液緩慢攪拌透析6h (或過夜)使之結(jié)合，然后取出加NaBH4溶液(5mg/ml) 0.2ml，置冰箱2h。將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，冰箱放置30min，離心，取上清，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH值7.4PBS中，并對之透析過夜。次日再離心除去不溶物，即得酶抗體結(jié)合物。用002mol/L、pH值7.4PBS加至5ml，進(jìn)行測定后，冷凍干燥或低溫保存。加60%甘油PBS，分裝保存?zhèn)溆?。?shí)施例3微孔板包被包被緩沖液:pH9.60.5mol/L的碳酸氫鈉緩沖液封閉液:I % BSA (牛血清白蛋白)的PBS溶液用包被緩沖液將OmpC稀釋，每孔加入100ul，37°C溫育2h或4°C過夜；傾去包被液，用洗滌液洗滌5次，每次Imin ;拍干，然后在每孔中加入200ul封閉液，37°C溫育2h ;傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實(shí)施例4免疫分析檢測方法建立4.1確定最佳酶標(biāo)抗人IgA抗體反應(yīng)濃度(I)用100ng/ml人IgA進(jìn)行包被，洗滌(2)將酶標(biāo)抗人IgA抗體用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫，洗漆。(3)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀讀取吸光度(450nm)。取OD值為1.0時(shí)的酶標(biāo)抗人IgA抗體的工作濃度為最佳濃度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表1.
表I
權(quán)利要求
1.種檢測大腸桿菌OmpC IgA抗體的檢測試劑盒,其中包括:包被有OmpC的微孔板、酶標(biāo)記抗人IgA抗體、陰性對照品、陽性對照品、底物顯色劑、洗滌液、反應(yīng)終止液、樣品稀釋液。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述OmpC是從大腸桿菌純化，或通過基因工程方法獲得的重組蛋白。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)記抗人IgA抗體所用的酶為辣根過氧化物酶。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照品是OmpC-1gA陰性人血清經(jīng)56°C I小時(shí)滅活，除菌過濾所得。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照品是OmpC-1gA陽性人血清經(jīng)56°C I小時(shí)滅活，除菌過濾，用10% (v/v)胎牛血清、0.1% (v/v)Proclin300,pH7.5的磷酸鹽緩沖液1: 100稀釋。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的顯色劑含過氧化氫或過氧化脲或類似物以及鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。
7.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述的洗滌液為含0.05% -0.5%吐溫-20磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液。
8.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述的樣品稀釋液為含0.1%吐溫-20的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液。
9.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測樣品中抗大腸桿菌OmpC-1gA的酶聯(lián)免疫試劑盒，在檢測抗大腸桿菌OmpC-1gA的酶聯(lián)免疫中的應(yīng)用，其步驟是: (1)用權(quán)利要求1-8任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測，向OmpC包被的酶標(biāo)板孔中加入對照品或待測樣品溶液，再加入酶標(biāo)記的抗人IgA抗體，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑、終止液，用酶標(biāo)儀或化學(xué)發(fā)光儀測定吸光度值； (2)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測大腸桿菌外膜孔道蛋白C(OmpC)的IgA抗體的檢測檢測試劑盒及其檢測方法，屬于免疫分析檢測領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的OmpC抗體試劑盒包括OmpC包被的微孔板、酶標(biāo)記的抗人IgA抗體。本發(fā)明的檢測試劑具有高準(zhǔn)確性、高特異性和高靈敏度等特點(diǎn)，可用于檢測人體組織抗OmpC IgA抗體，在某些自體免疫性疾病診斷中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/535GK103091500SQ201310062278
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者朱凡, 唐太清, 陳菲, 霍如松 申請人:蘇州和銳醫(yī)藥科技有限公司