專利名稱：一種黃曲霉毒素B₁的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于電化學檢測領域，特別涉及一種黃曲霉毒素B1的檢測方法。
背景技術：
黃曲霉毒素主要是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌等多種真菌產生的毒性代謝產物，其結構中含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮。黃曲霉毒素是迄今發(fā)現的毒性最強的一類生物毒素，具有很強的毒性、致癌性、致突變性和致畸性。目前已分離的黃曲霉毒素及其衍生物已有20多種，其中黃曲霉毒素B1 (AFB1)的毒性、致癌性、污染率最大，并且是各種真菌毒素中其化學性質最穩(wěn)定的一種，一般的食品加工手段對其產生的破壞性極小，廣泛存在于糧食谷物和加工食品中，對人類健康危害性極大。大量研究資料表明:糧食、食用油(花生油、菜籽油、大豆油、玉米油)、特種油，如橄欖油、山茶油等油料作物的種子和加工品、水果、干果、蔬菜、調味品、煙草和草藥、乳制品和發(fā)酵類產品中都發(fā)現了黃曲霉毒素B1的存在。各國都規(guī)定了各種真菌毒素的限量標準并加強監(jiān)管力度。歐盟規(guī)定在玉米、花生、堅果和谷物等食品中黃曲霉毒素總量不能超過4ppb，其中黃曲霉毒素B1不能超過2ppb ;我國食品中黃曲霉毒素B1允許量植物油(除玉米、花生油)中不得超過10 μ g/kg，其他糧食、豆類、發(fā)酵食品及嬰幼兒配方食品中不得超過5 μ g/kg。盡管世界各國對食品中黃曲霉毒素限量標準不盡相同，但都趨于更低的控制線。目前檢測黃曲霉毒素的常用技術為HPLC，ELISA，TLC等，但這些檢測技術都在不同程度上存在著樣品前處理復雜、儀器設備昂貴、耗時較長、操作流程復雜等不足。而電化學交流阻抗技術作為一種快速靈敏的電化學檢測方法因其能實現很寬頻率范圍內的阻抗譜來研究電極系統(tǒng)，并且作為一種無損傷、原位電極過程的電化學測試技術，普遍應用于電極界面特性的研究。碳納米管因有很好的導電性、高的比表面積和熱力學穩(wěn)定性等特點 ，應用廣泛；離子液體是完全由陰離子與陽離子組成的液體，在室溫或室溫附近溫度下呈液態(tài)的由離子構成的物質。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種黃曲霉毒素B1 (AFB1)的檢測方法，該方法選擇性好、響應速度快、靈敏度高、檢測范圍寬。發(fā)明的目的可以通過以下方案來實現:一種黃曲霉毒素B1的檢測方法，其步驟包括:(I)繪制標準曲線:將黃曲霉毒素BI樣品與有機溶劑共孵育，配置成不同濃度的黃曲霉毒素B1標準品，在標準品中分別加入阻抗溶液；用多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極測得阻抗溶液中不同黃曲霉毒素B1濃度的相應的阻抗值，再以阻抗差值為縱坐標，黃曲霉毒素B1標準樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線；(2)將待測樣品提純后與有機溶劑共孵育，配成待測樣品溶液，然后再加入阻抗溶液，用預處理過的多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極測得溶液中的阻抗值，再根據步驟(I)中所得的標準曲線，計算待測樣品中黃曲霉毒素B1的濃度。
校準曲線上通過線性方程式為Ret=1651.9C+600.56式中:Ret—阻抗差值(ohm)C—黃曲霉毒素濃度(ng/ml)
所述步驟(I)和步驟(2)中的阻抗溶液為磷酸鹽緩沖溶液，該溶液的pH值為6.8-8.0，濃度為0.5-1.5mmol/L ;所述磷酸鹽緩沖溶液中還含有濃度為0.5-1.5mmol/L的K4Fe (CN)6或K3Fe (CN)f^P 0.05-0.15mol/L的KCl。優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.0-7.8，濃度為0.8-1.2mmol/L，所述磷酸鹽緩沖溶液中還含有濃度為0.8-1.2mmol/L的K4Fe (CN) 6或K3Fe (CN) 6和0.08-1.12mol/L的KCl。更優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4，濃度為lmmol/L，所述磷酸鹽緩沖溶液中還含有濃度為lmmol/L的K4Fe(CN)6或K3Fe (CN) 6 和 0.lmol/L 的 KCl。所述步驟(I)中，將不同濃度的已知黃曲霉毒素B1樣品溶液分別與有機溶劑在35°C -40°C條件下共孵育20-30分鐘，其中，黃曲霉毒素B1與有機溶劑的加入配比為:1-1Ong =ImL ;所述步驟(2)中，將提純后的待測樣品溶液與有機溶劑在35°C _40°C條件下共孵育20-30分鐘，其中，待測樣品與有機溶劑的加入配比為2-6ng =ImL ;所述有機溶劑為甲
醇、三氯甲烷或丙酮。所述步驟(I)中，標準品與阻抗溶液的體積比為1:5-20 ;所述步驟(2)中，待測樣品溶液與阻抗溶液的體積比為1:5-20。所述步驟(2)中，待測樣品的提純方法為，將待測樣品用石油醚清洗，加入甲醇水溶液靜置分層，取下層混合液加入硫酸鈉溶液稀釋，再加入三氯甲烷靜置，將下層混合液脫水處理。所述步驟(I)中，標準品與阻抗溶液的體積比為1:5-20 ;所述步驟(2)中，待測樣品溶液與阻抗溶液的體積比為1:5-20。所述待測樣品、甲醇、硫酸鈉、三氯甲烷的加入配比為10g:40-45mL:l-2g:8_12mL0所述步驟(I)和步驟(2)中的多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極的制備方法為(a)將長度為100_300nm的多壁碳納米管和1_ 丁基_3_甲基-咪唑六氟磷酸鹽混合、磁力攪拌，再加入黃曲霉毒素B1單克隆抗體搖床反應，制得離子液體包裹的多壁碳納米管混合液；(b)將步驟(a)中制得的混合液滴加到經過預處理的玻碳電極表面，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗后備用。優(yōu)選的，所述玻碳電極的預處理方法為將玻碳電極用金相紙拋光、打磨后在分別用0.3 μ m和0.05 μ m的Al2O3拋光粉拋光；然后將電極依次在7.25mol/L的HNO3溶液、無水乙醇及二次蒸餾水中超聲處理；最后將電極用氮氣吹干即可。所述步驟(a)中，多壁碳納米管、1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸鹽和黃曲霉毒素BI單克隆抗體的加入配比為:1.2-2.4mg:lmL:0.6-1 μ g。與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:1、本發(fā)明提供的黃曲霉毒素BI的檢測時間短，檢測步驟精簡，整個檢測過程為10分鐘，檢測儀器簡單、便宜，而且待測樣品前處理也比較簡單。2、本檢測方法選擇性好、響應速度快、靈敏度高、檢測范圍為0.lng/mL-10ng/
mLo


圖1是AFB1標準樣的標準曲線圖。圖2是多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極與不同濃度的AFB1的交流阻抗圖譜。圖3是阻抗差值與AFB1濃度的線性關系圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步說明:本實施例所用到的設備:電化學工作站CHI660B型。實施例11、多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極的制備:用2#、5#金相砂紙拋光打磨玻碳電極，接著用0.3μπι、0.05 μ m的Al2O3拋光粉拋光玻碳電極，沖去表面污物，然后依次在濃度為7.25mol/L的HNO3、無水乙醇、二次蒸餾水中分別超聲2分鐘，最后將電極用氮氣吹干、備用。將長度為1-2 μ m,管徑為10-20nm的多壁碳納米管置于混酸溶液之中(濃H2SO4與濃HN03的混酸溶液，其中濃H2SO4與濃HNO3的體積比為3:1)連續(xù)超聲16小時。然后用二次蒸餾水離心、洗滌多壁碳納米管混合液至中性，干燥后得到長度分布在100-300nm之間的多壁碳納米管，備用；將0.5mg打斷后的多壁碳納米管和0.25mL的1- 丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸鹽混合均勻并磁力攪拌I小時，再加入濃度為1.64 μ g/mL的黃曲霉毒素BI單克隆抗體0.25mL,搖床反應0.5小時，制得離子液體包裹的多壁碳納米管混合液；將制得的離子液體包裹的多壁碳納米管混合液4 μ L滴到處理好的玻碳電極表面，在用lOmmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(其中磷酸鹽緩沖溶液中含有87mmol/L的Na2HPO4、Hmmol/L的ΚΗ2Ρ04、137mmol/L的NaCl和2.7mmol/L的KCl)來沖洗掉未結合的抗體，最后將玻碳電極放置在冰箱中兩個小時即可。2、標準曲線繪制方法:將不同重量的AFB1樣品，加入三氯甲烷，在37°C條件下共孵育25分鐘，分別制成濃度為lng/mL、3ng/mL、5ng/mL、7ng/mL、10ng/mL的AFB1標準樣,在AFB1標準樣中加入阻抗溶液15mL，然后將上述制得的多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極放在阻抗溶液中(該阻抗溶液為PH值=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，濃度為lmmol/L，所述磷酸鹽緩沖溶液中還含有濃度為lmmol/L的K4Fe(CN)6或K3Fe(CN)f^P 0.lmol/L的KCl )，通過電化學交流阻抗方法測定阻抗值，以AFBl標準樣濃度為橫坐標，以阻抗差值為縱坐標，繪制標準曲線。具體標準曲線見圖1所示。3、待測樣品中的AFB1濃度的測定方法:(I)待測樣品中提取AFBi本發(fā)明所采用的待測樣品為橄欖油，稱取混勻橄欖油樣品IOg于20mL的燒杯中，用IOml石油醚，將樣品清洗后倒入分液漏斗中，重復清洗5次；W50mL甲醇水溶液(其中甲醇與水的體積比為4:1)搖2-3分鐘，靜置分層，取下層甲醇水溶 液轉入另一分液漏斗中，力口50mL硫酸鈉水溶液(濃度為20g/L)稀釋，加三氯甲烷10mL，輕搖2_3分鐘，靜置分層，取下層混合液通過裝有5g無水硫酸鈉溶液的小漏斗脫水(以濾紙塞住漏斗頸口，并以少量三氯甲烷潤濕)，以少量三氯甲烷洗漏斗并濾入容量瓶中，混合液中，所測樣品的濃度為lg/mL。
(2)測定 AFB1 濃度將步驟(I)中的待測溶液4μ L與ImL三氯甲烷在37°C條件下共孵育25分鐘制成待測樣品溶液，加入阻抗溶液15mL，然后將上述制得的多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極放在阻抗溶液中(該阻抗溶液為PH值=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，濃度為lmmol/L，所述磷酸鹽緩沖溶液中還含有濃度為lmmol/L的K4Fe(CN)6或K3Fe(CN)f^P 0.lmol/L的KCl )，通過電化學交流阻抗方法測定阻抗值，根據標準曲線，通過測得的阻抗差值計算出所測樣品中的AFB1濃度。本發(fā)明提供的測試方法的精準度測試:(I)AFB1的定量檢測按照本發(fā)明的檢測方法，AFBl的檢測范圍為0.Ι-lOng/mL，具體如圖2和圖3所示，其中圖2為多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極與AFB1濃度為a:0.lng/mL、b:lng/mL、c:3ng/mL、d:5ng/mL、e:7ng/mL、f:10ng/mL、g:13ng/mL 的 7 條交流阻抗圖譜，圖 3 是將圖2轉化為阻抗差值與AFBl濃度的線性關系圖，從圖中可看出，電子轉移電阻從0.1ng/mL到10ng/mL的濃度范圍內呈良好的線性關系，線性相關系數為0.994，檢測限為0.1ng/mL,當AFBl濃度到達13ng/mL后，保持穩(wěn)定不再增長，說明檢測上限到達10ng/mL，達到國標規(guī)定的范圍內檢測實際樣品的要求。做同一批次與不同批次的精準度實驗，重復5次，批內和批間的相對標準偏差均小于5.0%。(2 ) AFB1的回收率檢測在橄欖油提取樣品中分別加入濃度為2ng/mL、4ng/mL、7ng/mL的AFB1標準品后與三氯甲烷37°C孵育25分鐘，測定交流阻抗值，在校準曲線上通過線性方程Ret=1651.9C+600.56計算出相應的黃曲霉毒素濃度，用測量濃度與加入濃度的比值得出實
際樣品加標回收率，具體見下表。
權利要求
1.一種黃曲霉毒素B1的檢測方法，其步驟包括: (1)繪制標準曲線:將黃曲霉毒素氏樣品與有機溶劑共孵育，配置成不同濃度的黃曲霉毒素B1標準品，在標準品中分別加入阻抗溶液；用多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極測得阻抗溶液中不同的黃曲霉毒素BI濃度的相應的阻抗值，再以阻抗差值為縱坐標，黃曲霉毒素B1標準樣濃度為橫坐標，繪制標準曲線； (2)將待測樣品提純后與有機溶劑共孵育，配成待測樣品溶液，然后再加入阻抗溶液，用預處理過的多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極測得阻抗溶液的阻抗值，再根據步驟(I)中所得的標準曲線，計算待測樣品中黃曲霉毒素B1的濃度。
2.根據權利要求1所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述步驟(I)和步驟(2)中的阻抗溶液為磷酸鹽緩沖溶液，該溶液的pH值為6.8-8.0，濃度為0.5-1.5mmol/L ;所述磷酸鹽緩沖溶液中還含有濃度為0.5-1.5mmol/L的K4Fe (CN) 6或K3Fe (CN) 6和0.05-0.15mol/L 的 KCl。
3.根據權利要求2所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述步驟(I)中，將不同濃度的已知黃曲霉毒素B1樣品溶液分別與有機溶劑在35 °C -40 V條件下共孵育20-30分鐘，其中，黃曲霉毒素BI與有機溶劑的加入配比為:l_10ng:lmL。
4.根據權利要求2所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述步驟(2)中，將提純后的待測樣品溶液與有機溶劑在35°C _40°C條件下共孵育20-30分鐘，其中，待測樣品與有機溶劑的加入配比為2-6 μ g =ImL0
5.根據權利要求1、3或4所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述有機溶劑為甲醇、三氯甲烷或丙酮。
6.根據權利要求2所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述步驟(I)中，標準品與阻抗溶液的體積比為1:5-20 ;所述步驟(2)中，待測樣品溶液與阻抗溶液的體積比為 1:5-20。
7.根據權利要求2所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述步驟(2)中，待測樣品的提純方法為，將待測樣品用石油醚清洗，加入甲醇水溶液靜置分層，取下層混合液加入硫酸鈉溶液稀釋，再加入三氯甲烷靜置，將下層混合液脫水處理。
8.根據權利要求7所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述待測樣品、甲醇、硫酸鈉、三氯甲烷的加入配比為IOg:40-45mL:l_2g:8_12mL。
9.根據權利要求1所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述步驟(I)和步驟(2)中的多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極的制備方法為， Ca)將長度為100-300nm的多壁碳納米管和1_ 丁基_3_甲基-咪唑六氟磷酸鹽混合，再加入黃曲霉毒素B1單克隆抗體搖床反應，制得離子液體包裹的多壁碳納米管混合液； (b)將步驟(a)中制得的混合液滴加到經過預處理的玻碳電極表面，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗后備用。
10.根據權利要求9所述的黃曲霉毒素B1的檢測方法，其特征在于:所述步驟(a)中，多壁碳納米管、1- 丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸鹽和黃曲霉毒素B1單克隆抗體的加入配比為:1.2-2.4mg:lmL:0.6-1 μ g。
全文摘要
本發(fā)明屬于電化學檢測領域，特別涉及一種黃曲霉毒素B1的檢測方法,繪制標準曲線將黃曲霉毒素B1樣品與有機溶劑共孵育，配置成不同濃度的黃曲霉毒素B1標準品，在標準品中分別加入阻抗溶液；用多壁碳納米管/離子液體/抗體修飾電極測得阻抗溶液中不同AFB1濃度的相應的阻抗值，繪制標準曲線；將待測樣品提純后與有機溶劑共孵育，配成待測樣品溶液，然后再加入阻抗溶液，用預處理過的修飾電極測得阻抗溶液的阻抗值，再根據標準曲線，計算待測樣品中AFB1的濃度。本發(fā)明檢測黃曲霉毒素B1的時間短，檢測步驟精簡、檢測儀器簡單、待測樣品前處理也比較簡單。而且本檢測方法的選擇性好、響應速度快、靈敏度高、檢測范圍寬。
文檔編號G01N27/26GK103175874SQ201310053018
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月19日 優(yōu)先權日2013年2月19日
發(fā)明者賈能勤, 于利利, 張洋, 吳慧, 楊亞云, 黃楚森 申請人:上海師范大學