一種同時測定半夏提取物中尿苷、鳥苷和腺苷含量的超高效液相色譜方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥成分分析測定【技術領域】。本研究以UPLC法測定半夏藥材及飲片提取物中尿苷、鳥苷和腺苷含量的方法。色譜柱為ACQUITY?UPLC?BEH?C18(1.7μm，2.1×50mm)，流動相為水-甲醇不同比例梯度洗脫，柱溫30℃，流速0.5mL·min-1，檢測波長為254nm。尿苷、鳥苷和腺苷在適用濃度范圍內(nèi)線性關系良好。該方法準確、快速、可靠，能有效地同時測定半夏提取物中尿苷、鳥苷和腺苷的含量。
【專利說明】一種同時測定半夏提取物中尿苷、鳥苷和腺苷含量的超高效液相色譜方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及半夏藥材及飲片提取物中同時測定尿苷、鳥苷和腺苷的分析技術。
【背景技術】
[0002]半夏為天南星科植物半夏Pinelia ternate (thumb.) Breit.的干燥塊莖，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結之功效，臨床應用非常的廣泛。半夏含有多種化學成分，主要包括核苷類、有機酸類、生物堿類等。其中核苷類成分是生物細胞維持生命活動的基本組成元素，具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性，是半夏藥材及飲片中含有的很重要有效成分，含量較高的有尿苷、鳥苷和腺苷。據(jù)文獻報道，國內(nèi)外均有學者以核苷類成分為指標對半夏的水溶性成分的含量進行檢測，且作為判別半夏藥材及飲片質(zhì)量優(yōu)劣的重要依據(jù)。目前報道的對半夏藥材及飲片核苷類成分的測定均采用HPLC法，該方法耗時長，分離效果不佳；且《中國藥典》2010版中半夏藥材的質(zhì)量控制是采取電位滴定法對醇提取物中有機總酸進行測定。而對水提取物的質(zhì)量控制還沒有明確規(guī)定，由于核苷的藥理活性明確，在半夏藥材中含量也較高，因此建立核苷類成分的測定方法對于半夏藥材及飲片質(zhì)量控制也非常重要，本發(fā)明可同時測定半夏藥材及飲片中的三種核苷，可為控制半夏藥材及飲片質(zhì)量提供參考依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明米用超高效液相色譜法(UltraPerformance Liquid Chromatography,UPLC)對半夏提取物中的三種核苷類成分同時進行測定。本專利所指的半夏提取物可以是半夏藥材或飲片提取物。本發(fā)明所述的同時測定半夏提取物中三種核苷類成分的UPLC方法高效、快速，重復性和精密度良好，可為半夏藥材及飲片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。
[0004]本發(fā)明所提供的技術方案可以是:
[0005]色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μ m，2.1 X 50mm)；柱溫:30 V ；流動相為水-甲醇梯度洗脫(時間分別為0，1.1，2，3，4，7，8，8.5，11分鐘時水和甲醇的質(zhì)量百分比分別為 100: 0,100: 0,98: 2,90: 10,85: 15,0: 100,0: 100，100: O ；100: O)；檢測波長254nm ;流速0.5mL.mirT1 ;進樣量5 μ L,理論塔板數(shù)按尿苷峰計算不低于2000。在此色譜條件下，尿苷出峰時間為0.966分鐘，鳥苷的出峰時間為2.093分鐘，腺苷的出峰時間為3.338分鐘。且各成分間分離度大于1.5。
[0006]對照品儲備液的制備:精密稱取尿苷對照品20.33mg,加水溶解并稀釋后，得尿苷濃度為20.33 μ g.mL—1對照品溶液。精密稱取鳥苷對照品10.98mg,加水溶解并稀釋后，得尿苷濃度為10.98 μ g.mL—1對照品溶液。精密稱取腺苷對照品10.06mg,加水溶解并稀釋后，得腺苷濃度為2.012 μ g.mL—1對照品溶液。精密吸取尿苷對照儲備液5ml、鳥苷對照儲備液5ml和腺苷對照品溶液5ml，置50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。
[0007]供試品溶液的制備(以半夏藥材為例):半夏藥材80g粉碎成粗粉，另加干姜
6.Sg,粉碎成粗粉，加水6倍量，混勻，壓入隔膜壓濾機中，55°C加壓循環(huán)提取二次，每次30分鐘，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.10~1.20 (500C )，加入2倍量乙醇使沉淀，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至40ml。每ml提取液相當于原藥材2g。精密吸取該濃縮液Iml于25ml容量瓶中，加水稀釋定容，0.22 μ m微孔濾膜濾過取續(xù)濾液即得供試品溶液。
[0008]線性關系考察:精密量取混合對照品溶液l，2，3，5，8，10mL，置IOml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件測定，以峰面積Y對濃度Xhg.mL-1)進行線性回歸。尿苷的回歸方程為:Y = 16788X-3556(r = 0.9999);鳥苷的回歸方程為:Y = 25378X-325(r = 0.9999);腺苷的回歸方程為:Y = 30800Χ-59 (r =
0.9999)。結果表明，尿苷濃度在2.033~20.33 μ g -mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；鳥苷濃度在1.098~10.98μ g.mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系；腺苷濃度在
0.2012~2.012μ g.mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。
[0009]精密度試驗:取混合對照品溶液，按“2.1”項下方法連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結果尿苷、鳥苷和腺苷的RSD分別為0.32%,0.33%和0.34%。符合精密度實驗要求。
[0010]穩(wěn)定性試驗:取混合對照品溶液，室溫下放置0，1,2,4,6,8小時，按“2.1”項下色譜條件分別進樣5μ L測定峰面積。結果峰面積基本不變，尿苷、鳥苷和腺苷的RSD分別為
0.32%,0.31%和0.33%，表明溶液在8小時內(nèi)基本穩(wěn)定。
[0011]重復性實驗:按供試品配制方法平行配制6份，按“2.1”項下方法進樣分析，按外標法以峰面積計算含量，尿苷、鳥苷和腺苷的平均含量分別為0.016% (g/g),0.011% (g/g)和 0.001% (g/g)，RSD 分別為 0.88%、1.01%和 0.93%。
[0012]加樣回收率試驗:取已測知含量的半夏提取物，分別精密量取5ml，共27份，置IOmL量瓶中，分別精密加入提取物中尿苷、鳥苷和腺苷含量的80 %、100 %和120 %的對照儲備液，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件進樣5 μ L，按外標法計算回收率。結果尿苷、鳥苷和腺苷的平均回收率分別為98.65%、98.21%和98.54%，RSD分別為 2.12%,2.32%和 1.91%。
[0013]半夏藥材含量測定:取供試品溶液，按上述的色譜條件測定，用外標法以峰面積計算，結果尿苷、鳥苷和腺苷的含量分別為0.016% (g/g),0.011% (g/g)和0.001% (g/g),RSD 分別為 0.88%、1.01%和 0.93%。
[0014]超高效液相色譜(UltraPerformance Liquid Chromatography),米用小粒徑填料色譜柱(小于2 μ m)和超高壓系統(tǒng)(大于105kPa)，可顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，特別適用于微量復雜混合物的分離和高通量研究，全面提升液相色譜的速度、靈敏度和分離度。目前國內(nèi)未見采用UPLC法對半夏藥材及飲片中核苷類成分測定的報道。從本文的研究結果可知，采用UPLC法測定半夏提取物中的核苷類成分快速，準確，分離效果好。
[0015]《中國藥典》2010版中半夏藥材的質(zhì)量控制是采取電位滴定法對醇提取物中有機總酸進行測定。而對水提取物的質(zhì)量控制還沒有明確規(guī)定，由于核苷的藥理活性明確，在半夏藥材和飲片中含量也較高，因此建立核苷類成分的測定方法對于半夏藥材和飲片質(zhì)量控制也非常重要，本文同時測定了半夏藥材和飲片提取物中的三種核苷，可為此提供參考依 據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]附圖是實施例1中半夏提取物的UPLC色譜圖。a尿苷、鳥苷和腺苷的對照品混合溶液；b半夏提取物；1尿苷，2鳥苷，3腺苷。
【具體實施方式】
[0017]為了進一步說明本發(fā)明及其優(yōu)點，給出了下列特定的實施例，應理解這些實施例僅有于具體說明而不是作為本發(fā)明范圍的限制。
[0018]實施例1:
[0019]供試品溶液的制備:半夏藥材80g粉碎成粗粉，另加干姜6.8g，粉碎成粗粉，加水6倍量，混勻，壓入隔膜壓濾機中，55°C加壓循環(huán)提取二次，每次30分鐘，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.10?1.20 (50°C )，加入2倍量乙醇使沉淀，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至40ml。每ml提取液相當于原藥材2g。精密吸取該濃縮液Iml于25ml容量瓶中，加水稀釋定容，0.22 μ m微孔濾膜濾過取續(xù)濾液即得供試品溶液。
[0020]半夏藥材中三種核苷類成分的含量測定:取供試品溶液，按上述的色譜條件(色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μ m，2.1 X 50mm);柱溫:30°C ;流動相為水-甲醇梯度洗脫(時間分別為0，1.1，2，3，4，7，8，8.5，11分鐘時水和甲醇的質(zhì)量百分比分別為100: 0，100: 0,98: 2，90: 10，85: 15,0: 100，O: 100，100: O ；100: O);檢測波長 254nm;流速0.5mL.min-1 ;進樣量5yL)測定，用外標法以峰面積計算，結果尿苷、鳥苷和腺苷的含量分別為 0.016% (g/g),0.011% (g/g) 0.001% (g/g)，RSD 分別為 0.88%、1.01%和
0.93%。
[0021]實施例2:
[0022]供試品溶液的制備:半夏飲片160g粉碎成粗粉，另加干姜13.6g，粉碎成粗粉，加水6倍量，混勻，壓入隔膜壓濾機中，45°C加壓循環(huán)提取二次，每次30分鐘，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.10?1.20 (500C )，加入2.5倍量乙醇使沉淀，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至160ml。每ml提取液相當于原藥材lg。精密吸取該濃縮液Iml于25ml容量瓶中，力口水稀釋定容，0.22 μ m微孔濾膜濾過取續(xù)濾液即得供試品溶液。
[0023]半夏飲片含量測定:取供試品溶液，按上述的色譜條件(色譜柱為ACQUITY UPLCBEH C18(1.7 μ m, 2.1 X50mm);柱溫:30°C ;流動相為水-甲醇梯度洗脫(時間分別為0，
1.1，2，3，4，7，8，8.5，11分鐘時水和甲醇的質(zhì)量百分比分別為100: 0,100: 0,98: 2，90: 10,85: 15,0: 100,0: 100，100: O ；100: O);檢測波長254nm ;流速0.5mL.mirT1 ;進樣量5 μ L)測定，用外標法以峰面積計算，結果尿苷、鳥苷和腺苷的含量分別為0.013%(g/g) >0.012% (g/g)和 0.0013% (g/g)，RSD 分別為 0.68%、0.91%和 0.95%。
【權利要求】
1.一種同時測定半夏提取物中尿苷、鳥苷和腺苷含量的超高效液相色譜法，其特征在于所用的色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μ m, 2.1X 50mm)，流動相為水-甲醇梯度洗脫，柱溫30°C，流速0.5mL.min-1，檢測波長為254nm，尿苷、鳥苷和腺苷分別在2.033~.20.33μ g.ι?ΙΛ 1.098 ~10.98 μ g.πι?Λθ.2012 ~2.012μ g.mL_1 濃度范圍內(nèi)藥物濃度與峰面積呈良好的線性關系，可用于尿苷、鳥苷和腺苷的定量測定。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種同時測定半夏提取物中尿苷、鳥苷和腺苷含量的超高效液相色譜法，其特征在于所述的流動相為水-甲醇梯度洗脫，時間分別為0，1.1,2,3,4,7,.8，8.5，11分鐘時水和甲醇的質(zhì)量百分比分別為100: 0,100: 0,98: 2，90: 10，85: 15，.O: 100,0: 100,100: O ；100: O。
【文檔編號】G01N30/02GK103926332SQ201310013570
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月15日 優(yōu)先權日:2013年1月15日
【發(fā)明者】張景勍, 何丹, 楊林 申請人:重慶醫(yī)科大學