發(fā)熒光半導體納米晶體的制作方法
【專利摘要】本文提供發(fā)熒光半導體納米晶體及其組合物，包括試劑盒、測定體系以及它們的制備和使用方法。
【專利說明】發(fā)熒光半導體納米晶體
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年6月7日提交的美國臨時申請?zhí)朜0.61 / 494，255和2012年I月23日提交的美國臨時申請?zhí)朜0.61 / 589,725的優(yōu)先權，這兩篇臨時申請的公開內容在此通過引用全文并入。
【技術領域】
[0003]提供可用在包括生物、分析和組合化學、醫(yī)療診斷、基因和蛋白質分析、以及單分子光譜學在內的各種領域中的發(fā)熒光(fluorogenic)半導體納米晶體；本文還提供包含發(fā)熒光半導體納米晶體的組合物、試劑盒和測定系統(tǒng)，以及它們的制備方法和使用方法。
【背景技術】
[0004]光活性半導體納米晶體在許多光學和電子應用領域受到關注。半導體納米晶體往往包括半導體核和鈍化半導體殼。其帶隙高于核材料的殼材料可以使深陷阱發(fā)射位點最少，并且可以提高納米晶體粒子的量子產率和穩(wěn)定性。在與金屬原子接觸時熒光納米晶體的光學性質和穩(wěn)定性可能受損。在存在金屬(例如，金屬離子或金屬底物)下，半導體納米晶體的熒光發(fā)射強度可以顯著降低。一旦淬滅(quench)，納米晶體的熒光發(fā)射往往不可能再生。這種對金屬的敏感性嚴重限制了半導體納米晶體在要求接觸金屬離子或金屬(例如，催化劑和金屬底物)的應用中的使用。因此，需要開發(fā)用于恢復被淬滅的納米晶體的熒光強度的材料和方法。

【發(fā)明內容】

[0005]本文提供發(fā)熒光半導體納米晶體、包含這種納米晶體的試劑盒和組合物、以及這種納米晶體的制備方法和使用方法。本文所述的納米晶體可用在各種領域。這些納米晶體理想地適用在生物和診斷應用中，但它們也可以用在許多其它的非生物應用中。代表性的應用包括例如分析和組合化學、醫(yī)療診斷、基因和蛋白質分析。由于它們卓越的光學性質，這些納米晶體可以在從細胞和組織染色(例如FISH)、細胞跟蹤、數(shù)字光譜、免疫測定、蛋白質的Western blot檢測、細胞遷移可視化、單分子檢測、流式細胞術分析至體內成像的各種生命科學應用中用作有效的檢測工具。本文提供的發(fā)熒光納米晶體還可以構成許多類型的電子器件如LED、太陽能電池、晶體管和二極管激光器中的基礎組件，并且具有許多非生物應用如用于無機化合物的傳感器。此外，提供便于在含金屬(例如，金屬基底和金屬催化劑)的環(huán)境中使用半導體納米晶體的組合物和方法。本文提供的納米晶體組合物和方法克服與常規(guī)熒光半導體納米晶體有關的許多缺點，并且為半導體納米晶體提供以前不可能的新的使用機會。
[0006]一方面，本文提供包括熒光半導體納米晶體和與該半導體納米晶體締合的淬滅基團的納米晶體。熒光半導體納米晶體在不存在淬滅基團下具有初始熒光強度(Ftl),發(fā)熒光半導體納米晶體具有經淬滅的熒光強度(Fq)，其中Fq / Ftl小于約1.0。在一些實施方案中，F(xiàn)q / Ftl小于約0.50。熒光半導體納米晶體可以為非發(fā)射性的(即Fq / F0=O)或基本非發(fā)射性的(即納米晶體可以發(fā)射檢測閾值以下的某些光)。熒光半導體納米晶體在不存在淬滅基團下可以發(fā)射可見光或近IR光譜范圍的光。多個淬滅基團可以與納米晶體締合(例如，多達約3000個淬滅基團)。在某些實施方案中，多于50個淬滅基團與納米晶體締合。在某些實施方案中，約50至約3000、或約50至約1000、或約1000至約2000、或約2000至約3000個淬滅基團與納米晶體締合。
[0007]另一方面，提供包括如本文所述多個發(fā)熒光半導體納米晶體的發(fā)熒光納米晶體群。該發(fā)熒光納米晶體群在不存在多個淬滅基團下的量子產率可以大于約10%、或約25%、或約50%、或約75%。
[0008]又一方面，提供包含如本文所述的發(fā)熒光半導體納米晶體群和水性或有機介質或固體載體的組合物，其中納米晶體與固體載體(如果存在)締合。該組合物可以配制用在體外或體內生物測定中。在某些實施方案中，納米晶體群分散在有機介質中。在其它實施方案中，組合物是發(fā)熒光半導體納米晶體(沒有團聚)在水性介質中的穩(wěn)定分散體。在某些實施方案中，組合物包含小于3.0XlO7M的淬滅基團。組合物還可以包含如本文所述其量足以激活熒光納米晶體熒光發(fā)射(例如，使得Fa /匕為10:1或更大)的活化劑。又一方面，提供用于制備發(fā)熒光納米晶體或其群的方法。所提供的代表性方法包括a)提供包含熒光半導體納米晶體和至少一種溶劑的反應混合物；以及b)向反應混合物中加入其量足以減少半導體納米晶體熒光發(fā)射的淬滅基團(或多個淬滅基團)。在加入淬滅基團之后熒光發(fā)射信號可以減少至少50%。熒光半導體納米晶體在不存在淬滅基團下可以具有初始熒光強度(Ftl),發(fā)熒光半導體納米晶體可以具有經淬滅的熒光強度(Fq)，其中Fq / Ftl小于約
0.50。通常10_8M至約1°_3M的淬滅基團存在于反應混合物中。在某些實施方案中，該方法還包括向反應混合物中加入針對每個納米晶體多于50個淬滅基團(即淬滅基團與納米晶體之比為50:1或更大)。在某些實施方案中，該比例是約50至約3000、或約50至約1000、或約1000至約2000、或約2000至約3000。
[0009]在某些方法中，熒光半導體納米晶體是水分散性的。或者，可以使用疏水性納米晶體。在一些實施方案中，該方法還可以包括在加入淬滅基團之后用使得納米晶體呈水分散性的親水性化合物處理半導體納米晶體。某些方法還包括使有機分子(例如，生物分子)結合到納米晶體上。
[0010]又一方面，提供發(fā)熒光納米晶體群，其中納米晶體根據(jù)本文所述的任意方法制備。
[0011]本文還提供使用納米晶體群的試劑盒和方法。因此，又一方面，提供一種用于激活經淬滅的半導體納米晶體的試劑盒。示例性的試劑盒包括:a)如本文所述的發(fā)熒光納米晶體群jPb)活化劑。試劑盒還可以包括可以釋放氰化物或異腈源的生氰底物。試劑盒還可以包括生氰酶，所述生氰酶能夠切割生氰底物以釋放含氰根離子或異腈基團的化合物。
[0012]因此，另一方面，提供包括a)如本文公開的發(fā)熒光納米晶體群；b)生氰酶；和c)生氰底物的試劑盒。又一方面，提供包括a)熒光納米晶體群；b)銅源；c)生氰酶；和d)生氰底物的試劑盒。生氰酶可以與抗體或固體載體(例如，載片、微芯片、珠粒、纖維、微孔板、納米孔、磁盤或磁帶)締合。在某些試劑盒中，納米晶體群中的每個納米晶體可以與第一結合基團(例如，抗體)締合，生氰酶與第二結合基團(例如，抗體)締合，其中第一和第二結合基團不同。[0013]另一方面,提供用于進行點擊環(huán)加成反應(click cycloaddition reaction)的試劑盒。示例性的試劑盒包括a)熒光半導體納米晶體群，其中半導體納米晶體每個都包含炔反應性基團或疊氮化物反應性基團山)銅源(Cu(I)或Cu(II)離子)；和(3)至少一種活化劑。
[0014]在本文所提供的任一試劑盒中，納米晶體群可以懸浮在水性介質或與固體載體或抗體締合。某些試劑盒使用兩種或更多種不同的納米晶體群。
[0015]又一方面，提供用于激活發(fā)熒光半導體納米晶體的方法。代表性方法包括:a)提供如本文所述的發(fā)熒光半導體納米晶體；和b)使納米晶體與活化劑接觸，其中發(fā)熒光半導體納米晶體在與活化劑接觸后的熒光強度增加。在一些實施方案中，納米晶體與活化劑在PH為7或更高下接觸。納米晶體在與活化劑接觸后可以具有經激活的熒光強度(Fa)，其中FA/FQ大于I。在某些方法中，F(xiàn)A/FQS 10或更大。在某些方法中，在與活化劑接觸后淬滅化合物可以從納米晶體表面脫附。
[0016]某些方法還包括使納米晶體與能夠釋放異腈或氰化物基團的生氰底物接觸。某些方法還包括水解底物以釋放氰根離子。底物可以是生氰酶底物(例如，生氰葡糖苷)。用在所公開方法中的底物例子包括苦杏仁苷、野黑櫻苷(prunasin)、蜀黍苷、巢菜苷、亞麻苦苷、百脈根苷、氰醇、氰醇酯、氰醇酰胺、丙酮氰醇、苯乙醇腈和?；杌?。
[0017]某些方法還包括使生氰酶底物與能夠切割生氰底物以釋放含異腈基團或氰化物基團的化合物的生氰酶接觸。生氰酶可以是葡糖苷酶。例如，生氰酶可以是杏仁葡糖苷酶、苦杏仁苷酶和亞麻仁苷酶。某些方法還包括使生氰酶底物與裂解酶(例如α-羥基腈裂解酶)、酯酶、蛋白酶或半乳糖酶接觸。某些方法還包括使發(fā)熒光納米晶體與金屬螯合劑(例如EDTA)接觸。
[0018]還提供根據(jù)本文所公開的任一種方法制備的經激活的發(fā)熒光納米晶體群。經激活的發(fā)熒光納米晶體群的量子產率可以大于約10%、或約25%、或約50%、或約75%。
[0019]本文還提供使用所公開的發(fā)熒光納米晶體的方法。例如，提供用于檢測樣品中被分析物(例如生物分子、細胞或小的無機或有機分子)的存在的方法。采用本文所提供方法可以檢測的生物分子的例子包括蛋白質、肽、核酸、寡核苷酸、適配體(aptamer)、脂蛋白、糖蛋白、碳水化合物、脂質、磷脂、氨基聚糖、酶和抗原。在某些實施方案中，被分析物是經翻譯后修飾(例如磷酸化、糖基化等)的蛋白質。采用所公開方法可以檢測的代表性無機或有機分子包括例如藥物、毒素和金屬離子。
[0020]代表性方法包括a)提供能夠釋放氰化物源(例如，氰根離子或異腈基團)的生氰底物山)使樣品與如本文公開的發(fā)熒光半導體納米晶體接觸，其中納米晶體與第一結合基團締合；c)使樣品與第二結合基團接觸，其中第二結合基團與生氰酶締合，其中第一和第二結合基團不同，并且第一和第二結合基團結合被分析物(如果存在)；d)使生氰酶與生氰底物接觸，由此從生氰底物釋放氰化物源；以及e)檢測發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號強度的增加表示樣品中存在被分析物。
[0021]還提供一種檢測樣品中被分析物的存在的方法，包括a)提供i)能夠釋放氰化物源(例如，氰根離子或異腈基團)的生氰底物和ii)如本文所述的發(fā)熒光納米晶體；b)使樣品與結合基團和第二結合基團接觸，其中第一結合基團和第二結合基團不同，其中第一和第二結合基團結合被分析物(如果存在)，其中第一結合基團與生氰酶締合；c)使生氰酶與生氰底物接觸以在納米晶體存在下釋放氰化物源；以及d)檢測發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號強度的增加表示樣品中存在被分析物。第一結合基團可以與第三結合基團締合，其中第三結合基團與生氰酶締合。任選地，第二結合基團可以經由第三結合基團間接與被分析物締合。
[0022]還提供一種檢測樣品中被分析物的存在的方法，包括a)提供固體載體，其中載體與第一結合基團和生氰酶締合山)使固體載體與樣品和第二結合基團接觸，其中第一和第二結合基團結合被分析物(如果存在)，其中第二結合基團與根據(jù)權利要求1所述的發(fā)熒光半導體納米晶體締合，并且其中第一結合基團和第二結合基團不同；c)使生氰酶與生氰底物接觸以釋放氰化物源(例如，氰根離子或異腈基團)；以及d)檢測發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號強度的增加表示樣品中存在被分析物。任選地，第二結合基團可以經由第三結合基團間接與被分析物締合。
[0023]在本文提供的任一種方法中，第一、第二和/或第三結合基團(如果存在)可以是抗體、寡核苷酸、適配體或化學結合基團?；瘜W結合基團包括例如聚合物、金屬配體、蛋白質結合劑等。在某些實施方案中，第一結合基團與固體載體締合，并且該方法還任選包括在加入生氰底物之前洗滌固體載體。
[0024]又一方面，提供檢測樣品中核酸的存在的方法。代表性方法包括a)使樣品與如本文所述的發(fā)熒光半導體納米晶體接觸，其中納米晶體與具有已知序列的第一核酸締合山)使樣品與具有已知序列的第二核酸締合，其中第二核酸與生氰酶締合；c)使生氰酶與生氰底物接觸，由此從生氰底物釋放氰化物源(例如，氰根離子或異腈基團)4Pe)檢測發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號強度的增加表示存在具有能夠與第一和第二核酸鏈雜交的序列的核酸鏈。
[0025]又一方面，提供一種激活半導體納米晶體的方法，包括a)提供如本文所公開的至少一種熒光半導體納米晶體或發(fā)熒光納米晶體山)使該半導體納米晶體與化合物接觸以調節(jié)納米晶體的至少一種光學性質；和c)確定納米晶體的位置。在某些方法中，納米晶體的位置可以通過成像確定。所確定的第一納米晶體和第二納米晶體的位置的準確度可以小于第一和/或第二納米晶體所發(fā)射的光的波長。
[0026]又一方面，提供一種檢測樣品中氰根離子的方法，包括a)提供樣品；b)使樣品與如本文公開的發(fā)熒光半導體納米晶體接觸，其中淬滅基團能夠與氰根離子絡合；和c)檢測納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號強度的增加表示樣品中存在氰根離子。
[0027]又一方面，提供增強半導體納米晶體的亮度的方法。代表性方法包括a)提供熒光半導體納米晶體；和b)使納米晶體與活化劑接觸，以使得納米晶體群的熒光發(fā)射強度增加至少10%。
[0028]又一方面，提供使化合物結合到半導體納米晶體上的方法。代表性方法包括a)接觸包含炔反應性基團或疊氮化物反應性基團的熒光半導體納米晶體；b)使納米晶體與包含以下基團的反應性材料接觸，所述基團在Cu(I)或Cu(II)離子存在下能夠與化合物的炔反應性基團或疊氮化物反應性基團反應；和c)使納米晶體與活化劑接觸，其中在與活化劑接觸后納米晶體的熒光發(fā)射強度增加。在某些實施方案中，納米晶體是如本文所公開的發(fā)熒光半導體。某些方法還包括使納米晶體與反應性材料在至少一種還原劑存在下接觸。反應性材料可以包括選自氨基酸、肽、蛋白質(例如，酶或抗體)、碳水化合物、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、藥物、脂質和合成聚合物的分子。反應性材料可以與固體載體(共價或非共價)締合。某些方法還包括監(jiān)測納米晶體的熒光發(fā)射強度，其中在加入活化劑后發(fā)射強度增加至少10%。
[0029]本文還提供發(fā)熒光測定體系。本文所提供的代表性發(fā)熒光測定體系包含a)如本文所公開的發(fā)熒光半導體納米晶體，其中納米晶體與第一結合基團締合山)與第二結合基團締合的生氰酶，其中第二結合基團與所述結合基團不同，且其中第一和第二結合基團與被分析物締合；和c)在與生氰酶接觸后能夠釋放釋放氰化物源(例如，氰根離子或異腈基團)的生氰底物。該測定體系中的生氰酶和/或第二結合基團可以與固體載體締合。
[0030]又一方面，提供一種鑒別樣品中的細胞或細胞組分的方法。用于鑒別細胞或細胞組分的通用方法包括a)使樣品中的細胞或細胞組分與如本文所述的發(fā)熒光半導體納米晶體在其中納米晶體被輸送通過細胞膜的條件下接觸以提供經標記的細胞或細胞組分；b)將經標記的細胞或細胞組分暴露于激發(fā)能量源以激活半導體納米晶體，使得經激活的納米晶體具有熒光強度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;和c)檢測經激活的納米晶體的熒光發(fā)射，由此鑒別樣品中的細胞或細胞組分。
[0031]又一方面，提供一種鑒別細胞混合群中的細胞的方法，包括:a)使第一細胞與如本文所述的發(fā)熒光半導體納米晶體在其中納米晶體與細胞締合的條件下接觸以提供第一經標記的細胞(例如，納米晶體可以輸送通過細胞膜，與細胞膜締合，或可以被吞噬進細胞內)；b)使第一經標記的細胞與和第一細胞不同的第二細胞混合以形成細胞混合群；c)培養(yǎng)細胞混合群；d)將經標記的細胞暴露于激發(fā)能量源以激活半導體納米晶體，使得經激活的納米晶體具有熒光強度(Fa)，其中FA/FQ大于I ;和f)檢測經激活的納米晶體的熒光發(fā)射，由此鑒別細胞混合群中的第一經標記的細胞。該方法還可以包括在將經標記的細胞或細胞組分暴露于激發(fā)能量源之前或期間使經標記的細胞或細胞組分接觸活化劑。
[0032]本文提供的方法可以實現(xiàn)鑒別任意類型的細胞，包括但不限于哺乳動物或酵母細胞。在一些實施方案中，細胞是活細胞。
[0033]又一方面，提供用于檢測熒光納米晶體的方法，包括:a)將如本文所述的發(fā)熒光納米晶體置于光子晶體傳感器的表面上山)用光照射光子晶體傳感器，由此使得傳感器表現(xiàn)出引出共振(extraction resonance)模式,該模式所具有的光譜與發(fā)突光納米晶體的發(fā)射光譜至少部分重疊，其中照射和引出共振模式激活發(fā)熒光納米晶體，使得經激活的納米晶體具有熒光強度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;和c)檢測經激活的納米晶體的發(fā)射光，由此檢測發(fā)熒光納米晶體。該方法還可以包括使發(fā)熒光納米晶體與活化劑接觸，由此提高激活速率和/或熒光強度。
[0034]在本文提供的組合物、試劑盒、體系或方法的任一個中，發(fā)熒光納米晶體可以包括半導體核和設置在半導體核上的半導體外殼層。納米晶體核和/或殼層(如果存在)可以包含I1-VI族、I1-V1-VI族、I1-11-VI族或II1-V族的半導體材料。例如，在某些實施方案中，核包含CdSe。殼層可以包含選自CdZnS、ZnS、CdS、CdSeS、ZnSeS、CdZnSeS、ZnSe及其組合的半導體材料。
[0035]在本文提供的組合物、試劑盒、體系或方法的任一個中，半導體納米晶體可以是疏水性的或可水分散的。例如，納米晶體可以還包括在半導體納米晶體表面上使得納米晶體可水分散的親水性層。納米晶體可以還包含連接到半導體納米晶體或親水層上的生物分子(例如核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、氨基酸、多肽、蛋白質、多糖、脂質和生物素）。
[0036]在本文提供的組合物、試劑盒、體系或方法的任一個中，淬滅基團可以是金屬源。 金屬源可以是包含或能夠提供金屬原子的任何化合物。金屬源可以是或包括金屬原子、金 屬離子、金屬鹽或含金屬化合物。例如，淬滅基團可以是或包括過渡金屬離子或非過渡金 屬離子。淬滅基團可以是或包括選自Cu(I)、Cu(II)、Ag(I)、Hg(I、II)、Pb(II)、Pb(IV)、 Fe(II)、Fe(m)、Co(II)、Ni(II)和 Cr (I、II、III、IV、V 或 VI)的金屬離子。淬滅基團可 以是例如S2_、Se2_、F_、Cl_、Br_、1_、Te2_、As3_或膦酸根的陰離子。在一些實施方案中，淬滅 基團是或包括金屬鹽。淬滅基團可以是包括硫醇或硫醇鹽基團的有機配體。在某些實施方 案中，淬滅劑是二氫硫辛酸（DHLA)。在某些實施方案中，淬滅基團是銅源。銅源可以是提供 銅原子的任何化合物。銅源可以是銅離子例如Cu(I)或Cu(II))。在其它實施方案中，淬滅 化合物不是Cu (II)離子。
[0037]在本文提供的組合物、試劑盒、體系或方法的任一個中，活化劑可以是還原劑、氧 化劑、質子或金屬離子結合化合物。在一些實施方案中，活化劑是金屬螯合劑。示例性的 活化劑可以選自氰化物、腈、異腈、疊氮化物、硫氰酸酯/鹽、胺、咪唑、硫醇鹽、羧酸酯/鹽、 N0、C0、鹵化物（例如氟化物）、過氧化物、反應性氧清除劑（R0S)和氫氧化物。在某些實施 方案中，活化劑包括氰化物、異腈或腈源。例如，氰化物源可以是氰根離子、氰化物鹽或有機 氰化物化合物。在本文提供的某些組合物、試劑盒、體系或方法中，活化劑是蛋白質（例如， 胎牛血清、牛血清白蛋白、酪蛋白、山羊血清、魚血清等）或聚合物（例如，聚乙烯亞胺、多 肽、聚乙二醇、聚丙烯酸或其衍生物）。
[0038]本文描述這些和其它特征、方面和實施方案。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]為更全面地理解本文所公開的原理及其優(yōu)點，現(xiàn)在結合附圖提及下面的詳述內 各，附圖中：
[0040]圖1示出采用如本文所公開的發(fā)熒光納米晶體的同源鄰近測定。
[0041]圖2示出采用如本文所公開的發(fā)熒光納米晶體的ELISA測定。
[0042]圖3示出采用如本文所公開的發(fā)熒光納米晶體的鄰近ELISA測定。
[0043]圖4是表示銅離子對納米晶體熒光發(fā)射的影響的圖。
[0044]圖5是表示三氟甲磺酸銅對納米晶體熒光發(fā)射的影響的圖。
[0045]圖6是表示氰根離子對納米晶體熒光發(fā)射的影響的圖。
[0046]圖7是表示有和沒有氰化物處理下納米晶體的熒光恢復圖。
[0047]圖8是在生氰酶和底物存在下被激活的納米晶體的滴定曲線。
[0048]圖9是表示化學切換實驗中單個納米晶體的熒光響應圖。
[0049]圖10示出單個納米晶體在光激活之前（A)和之后（B)的圖像。
[0050]圖11 是比較用(A) 20W / cm2、(B) 40W / cm2、(C) 80W / cm2 照射和(D) 20W / cm2 照射和2mM KCN的納米晶體的熒光響應的圖。
[0051]圖12是表示發(fā)熒光納米晶體在照射和氰化物處理后的量子產率增強的柱狀圖。
[0052]圖13是比較經銅淬滅的納米晶體樣品在HPSS或MEM和FBS(10% )中培育或成像 的發(fā)熒光響應的柱狀圖。[0053]圖14是表示經銅淬滅的納米晶體樣品在⑷FBS (20 % ),⑶MEM (60 % )和FBS(20% ), (C)MEM(60% )、或(D)單獨的緩沖液中激活和成像的發(fā)熒光響應的圖。
[0054]圖15是表示發(fā)熒光納米晶體在有(A)和沒有(B) LED照射下在不同苯乙醇腈濃度下的發(fā)熒光響應與苯乙醇腈濃度的函數(shù)關系圖。
[0055]圖16是表示經銅淬滅的納米晶體發(fā)熒光響應與IL-6濃度的函數(shù)關系圖。
【具體實施方式】
[0056]參照下面實施方案的詳述和本文所包括的實施例可以更容易地理解本文所述的實施方案。要理解本文所用術語僅用于描述具體實施方案，而并非限制。
[0057]本公開內容所提及的每一專利、專利申請、出版物和文獻的全文都在此通過引用整體并入，包括所有的表、附圖和數(shù)字。
[0058]除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員慣常理解的相同意義。
[0059]如本文所用的，"一個"或"一種"表示"至少一個"或"一個或多個"、"至少一種"或"一種或多種"。
[0060]如本文所用，"約"指數(shù)值是近似的，并且小變化不會明顯影響本文所提供的組合物和方法的使用和實施。如果使用數(shù)值限制范圍，除非上下文另外指明，否則"約"表示該數(shù)值可以變化± 10%，并且保持在所公開實施方案的范圍內。
[0061]如本文所用的“納米晶體”指具有納米尺寸范圍的至少一個主尺寸(其最大尺寸為約Inm至約IOOOnm)并且由無機物質制成的具有有序晶體結構的粒子。納米晶體可以由以下材料制備，所述材料本體是半導體或絕緣材料并且具有在近紫外(UV)至遠紅外(IR)范圍的可調光物理性質。由這種材料制備的納米晶體本文稱作“半導體納米晶體”。納米晶體可以包含由晶體材料如半導體材料制備的核，并且納米晶體核可以被由一種或多種類型的絕緣或半導體材料形成的一個或多個外殼層包圍。沒有施加殼的半導體納米晶體本文稱作“核納米晶體”或“半導體核納米晶體”，而具有半導體殼的半導體納米晶體核本文稱作“核/殼納米晶體”或“半導體核/殼納米晶體”。納米晶體如核或核/殼納米晶體可以與粒子表面上的有機覆層或配體或其它材料締合，例如三辛基膦(TOP)、三辛基氧化膦(TOPO)、油酸、辛基膦酸(OPA)、乙基膦酸(EPA)、十四烷基膦酸(TDPA)或通過普通溶劑化不容易從表面除去的其它材料。在某些實施方案中，粒子表面上的有機覆層或配體層是交聯(lián)的。這些表面覆層或層可以改變粒子性質，例如增加或減小在水或其它溶劑中的溶解性。
[0062]"水溶性"或“水分散性”本文用來表示所述物品在水性條件下可以溶解或不會附聚，例如在水或水基溶液或緩沖液中，包括本領域技術人員已知的在生物或分子檢測系統(tǒng)中使用的那些。雖然按術語用于描述單個溶劑化小分子的意義而言，水溶性納米晶體并沒有真正溶解，但它們溶劑化(例如，經由氫鍵、靜電或其它合適的物理/化學結合)和懸浮在與其外表面層相容的溶劑中，因此容易分散在水中的納米晶體視為水溶性或水分散性。水溶性納米晶體也可以視為親水性的，因為它的表面與水相容和具有水溶性。
[0063]如本文所用的“群”指多個納米晶體并且該納米晶體可以具有類似物理和/或光學性質。“群”可以指具有多于一個納米晶體的溶液或結構。在某些實施方案中，溶液或結構中的納米晶體處于適合單一分子分析的濃度。[0064]如本文所用的“發(fā)熒光(fluOTogenic) ”指其中產生或增強熒光信號的過程。該術語還指將弱或非熒光基團轉化為熒光基團的化學、電化學或光化學反應。在分析測定的上下文中，熒光量可以量化并與被分析物的量相關。
[0065]如本文所用的“發(fā)熒光納米晶體”或“發(fā)熒光半導體納米晶體”指其熒光性質可以經由化學反應或輻射調節(jié)的半導體納米晶體。表現(xiàn)一些可檢測的熒光并且光學性質(例如，發(fā)射強度或量子產率)能夠表現(xiàn)出增強的熒光納米晶體本文也稱作“發(fā)熒光納米晶體”。
[0066]如本文所用的“發(fā)熒光底物”指通過另一化合物作用后產生熒光化合物的非熒光材料或可以激活或增強另一化合物(例如，半導體納米晶體)的熒光的化合物。發(fā)熒光底物可以產生可以激活(例如，“打開”)或增強另一化合物的光學性質的物質(本文稱作“活化劑”)。在某些情形中，活化劑可以經歷進一步反應以產生或釋放活化物質?？梢员惶囟缸饔玫陌l(fā)熒光底物本文稱作“發(fā)熒光酶底物”?？梢员磺懈钜葬尫徘杌镌?例如，氰根離子或有機氰化物化合物)的發(fā)熒光底物本文稱作“生氰底物”。如果切割可以通過酶實現(xiàn)，發(fā)熒光底物也可以稱作“生氰酶底物”。
[0067]如本文所用的“淬滅劑”指以下化合物或基團，所述化合物或基團可以將發(fā)射性半導體納米晶體轉化為在發(fā)射性納米晶體在用淬滅劑處理之前發(fā)射的光譜范圍內的光學上無活性物質。納米晶體與淬滅劑之間的相互作用可以是永久的或瞬變的，并且可以不同程度地減小光學性質。淬滅劑可以是化學基團(或多個基團)，這種情況下淬滅劑也可以稱作
“淬滅基團”。
[0068]如本文所用的“淬滅”指減小或改變半導體納米晶體的至少一種光學性質的過程。這種光學性質包括熒光發(fā)射強度、發(fā)射波長、量子產率或放射持續(xù)時間。半導體納米晶體淬滅可以產生“經淬滅的”半導體納米晶體。淬滅可以是因納米晶體與化學基團(或多個基團)的接觸或相互作用所致，所述化學基團(或多個基團)本文稱作“淬滅基團”或“淬滅劑”。
[0069]如本文所用的“活化劑”指可以恢復或增強半導體納米晶體的至少一種光學性質(例如熒光發(fā)射)的化合物、基團或能量場?；罨瘎┛梢允腔瘜W基團(或多個基團)或氧化還原載體如電子或空穴，這種情況下活化劑也可以稱作“活化基團”?；蛘?，光可以充當活化劑。
[0070]如本文所用的“激活”指恢復或增強半導體納米晶體的至少一種光學性質(例如，熒光發(fā)射強度、量子產率等)的過程。激活可以是半導體納米晶體與“活化劑”之間的接觸或相互作用所致。半導體納米晶體激活可以產生“經激活的”半導體納米晶體。如同淬滅一樣，納米晶體與活化劑之間的相互作用可以是永久的或瞬變的。激活可以使用化學活化基團或通過用光照射納米晶體來實現(xiàn)。光激活可以使用光源來實現(xiàn)，并且可以單獨使用或與化學活化基團組合使用?；瘜W激活和/或光激活可以在用淬滅基團處理之前或之后作用給納米晶體，并且可以不同程度地增強光學性質。
[0071]本文公開了發(fā)熒光半導體納米晶體及其制備和使用方法。還提供恢復和增強發(fā)熒光半導體納米晶體的一種或多種光學性質(例如發(fā)射強度或量子產率)的方法和這種納米晶體的應用。
[0072]本文提供的半導體納米晶體包括半導體性，任選活性核。該核可以被一個或多個半導體殼層包圍。半導體殼可以在光學活性核與周圍介質之間提供物理屏障。殼基本均勻地覆蓋在核周圍并且基本沒有缺陷。殼可以采取多種形式。例如，殼可以是多層殼或成合金的殼。在某些實施方案中，殼在核周圍形成基本同心的外覆層。在某些實施方案中，殼可以包括在核周圍形成洋蔥狀外覆層的多個層。外殼的存在可以減小納米晶體對環(huán)境變化的敏感度，減少光氧化，并且可以幫助鈍化表面捕集態(tài)(surface trap state)以顯著提高突光量子產率。
[0073]納米晶體核和殼可以由已知用于形成半導體納米晶體的任何合適的金屬和非金屬原子制備。用于核和/或殼的合適半導體材料包括但不限于包括基于2-16、12-16、13-15和 14 族元素的半導體的那些，例如 ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InP、InAs, InSb, AlAs, A1P、AlSb, PbS, PbSe, Ge和Si及其混合物。在一些實施方案中，核/殼納米晶體的核和殼由不同半導體材料組成，這意味著核/殼的核的半導體材料的至少一種原子類型不同于核/殼納米晶體的殼中的原子類型。
[0074]用于殼的合適材料通常包括帶隙能比半導體納米晶體核高的半導體材料，但是其它設置也可以。除了具有比半導體納米晶體核高的帶隙能以外，在某些實施方案中，用于殼的合適材料相對于核半導體納米晶體可以具有良好的導帶和價帶偏移。因此，導帶如期望地高于核半導體納米晶體，而價帶如期望地低于核半導體納米晶體。通常選擇殼材料和核材料以使晶格不匹配最小。對于在可見光(例如CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、GaP、GaAs, GaN)或近IR(例如InP、InAs, InSb、PbS、PbSe)發(fā)射能量的半導體納米晶體核，可以使用在紫外區(qū)具有帶隙能的材料。示例性材料包括CdS、CdSe, InP、InAs、ZnS、ZnSe、ZnTe、GaP, GaN以及鎂硫屬化物如MgS、MgSe和MgTe。對于在近IR發(fā)射的半導體納米晶體核，也可以使用在可見光具有帶隙能的材料，例如CdS或CdSe。本領域還理解特定納米晶體核的實際熒光波長取決于核尺寸及其組成，因此以上分類是大概性的，描述為在可見光或近IR發(fā)射的納米晶體核實際可以根據(jù)核尺寸以更長或更短波長發(fā)射。
[0075]在某些實施方案中，核和/或殼包含至少一種II族元素和至少一種VI族元素的混合物(例如CdSe或CdTe或其混合物)或I1-V1-VI族或I1-11-VI族半導體材料。在一些實施方案中，半導體納米晶體包括CdSe核。在某些實施方案中，所提供的發(fā)熒光納米晶體不包含CdTe。在其它實施方案中，核包含至少一種III族元素和至少一種V族元素的混合物(例如GaAs、InGaAs、InP、InAs或InGaP或其混合物)。在某些實施方案中，半導體殼層可以包含CdZnS、ZnS、CdS、CdSeS、ZnSeS、CdZnSeS、ZnSe或這些材料的組合。在某些結構中，殼層還可以包含稀土金屬、Cu、Mg、Ag、Hg、Pb、Mn、N1、Co、Fe、Au、Be、Cr、P、B、N、O、Ge、Ga或Si原子。
[0076]如本文公開的納米晶體可以吸收寬光譜范圍的波長，并發(fā)射相對窄范圍波長的光。激發(fā)和發(fā)射波長通常不同，并且不重疊。半導體納米晶體的顏色(即所發(fā)射的光)可以通過改變粒子的尺寸和組成來"調節(jié)(tune)"。根據(jù)納米晶體核的尺寸，這些納米晶體可以在電磁波譜的UV、可見光或IR部分發(fā)射。所公開的納米晶體或其群的發(fā)射峰可以一般在約200nm至約2500nm的任何波長處。在某些實施方案中，所提供的納米晶體在電磁波譜的UV或可見光范圍(約SOOnm以下)發(fā)射。在其它實施方案中，納米晶體群在光譜的近IR區(qū)域(例如約700nm至約2500nm)發(fā)射。通常納米晶體的尺寸要在電磁波譜的UV-1R部分提供熒光，因為該范圍適合用于監(jiān)測相關介質中的生物事件。
[0077]所公開的納米晶體可以具有任何直徑，其中直徑沿納米晶體的最短軸測量。納米晶體的直徑可以為約Inm至約lOOOnm。通常納米晶體的直徑為約Inm至約IOOnm,或約Inm至約20nm,或約Inm至約15nm,或約Inm至約IOnm,或在這些值的任意兩個之間的直徑。
[0078]在某些實施方案中，本文所公開的納米晶體群可以包括多個具有基本相同尺寸和形狀的單個納米晶體。這種粒子集合有時稱作"單分散的"群。可以制備能夠發(fā)射單顏色光的納米晶體的單分散群(也稱作單顏色制備)。本領域普通技術人員將實現(xiàn)可以獲得納米晶體的特定尺寸作為粒子尺寸分布。因此，本文還提供納米晶體群，其中群中大于75%(例如大于80%,或大于85%,或大于90%,或大于95% )的納米晶體具有基本相同的直徑。
[0079]本文所述的納米晶體群的特征可以在于它們可以產生具有相對窄波長帶的熒光發(fā)射，這表明群具有類似尺寸的(即單分散的)納米晶體。整體發(fā)射帶的寬度在室溫測量時通常小于約60nm半峰全寬(FWHM)、或小于約50nm FWHM、或小于約40nm FWHM、或小于約30nm FWHM或小于約20nm FWHM。所發(fā)射的光優(yōu)選具有對稱(例如Gaussian)的單峰發(fā)射帶。本文提供的某些材料表現(xiàn)出高度單分散群標志的令人驚奇的顏色純度(例如小于約30nm FWHM)，以及有利的光學性質(例如最小的間歇閃爍、高消光系數(shù)、高量子產率、光穩(wěn)定性或兩種或更多種這些性質的組合)。
[0080]本文所提供的某些納米晶體在不存在淬滅基團下可以具有高消光系數(shù)和高量子產率。消光系數(shù)可以在各種波長測量，但一般最實用的是采用405nm激發(fā)波長(即許多商用激光器中所用的波長)。在該激發(fā)波長，某些所公開的納米晶體的消光系數(shù)通常為約3，000，OOOcnr1Ir1至約30，000，OOOcnr1Ir1。例如，本文所述的納米晶體在405nm激發(fā)波長測量表現(xiàn)出的消光系數(shù)可以為約3，000, OOOcnTt1至約10，000, OOOcnT1M'或約10，000, OOOcnr1Ir1 至約 20，000, OOOcnr1Ir1,或約 20，000, OOOcnr1Ir1 至約 30，000, OOOchT1Mq
[0081]本文所公開的某些納米晶體在不存在淬滅基團下還可以表現(xiàn)出高量子產率(即發(fā)射光子與吸收光子之比)。這種納米晶體的量子產率(QY)可以為至少約10%、至少約20 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %、至少約95%、至少約98%。量子產率可以在水性或有機介質中測量。本文提供的某些納米晶體(或其群)在水性或有機介質(例如溶劑)中測量時表現(xiàn)出約60%或更大、或約70%或更大、或約80%或更大、或約85%或更大的QY0
[0082]本文提供的納米晶體還可以包括直接接觸外殼層的表面覆層，其可以賦予納米晶體某些物理/化學特性，保護納米晶體以免分解，和/或允許納米晶體結合到生物分子上。通常納米晶體在留在納米晶體表面上的疏水性有機溶劑中制備。發(fā)熒光納米晶體可以由這種疏水性納米晶體制備。但是，在一些實施方案中，所公開的納米晶體包括在半導體納米晶體表面上添加各種官能團的覆層，這些官能團使得納米晶體可水分散或可溶于水性溶液中。在某些實施方案中，納米晶體包括在半導體納米晶體表面上使得納米晶體可水分散的未水層O
[0083]存在可以施用到納米晶體上以在納米晶體表面上形成親水層的許多合適包覆材料。通常這些包覆材料包含用以附著到納米晶體表面上的基團和親水性基團如羧酸、羥基、胺等。包覆材料附著到納米晶體表面上可以涉及任意形式的共價或非共價締合。在某些實施方案中，包覆材料可以包含小的有機配體，其包含親水性組分。
[0084]許多合適的表面包覆材料可以用來允許所述納米晶體具有水分散性，包括但不限于脂質、磷脂、脂肪酸、聚核酸、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、RAFT聚合物、含硫醇聚合物、含咪唑聚合物、含肽聚合物和多肽。在某些實施方案中，表面覆層提供由兩性聚合物如丙烯酸基聚合物形成的親水層。
[0085]其它包覆材料包括含硫醇的化合物(例如巰基羧酸如巰基十一烷酸MUA)、二齒硫醇(例如二氫硫辛酸DHLA)、三齒硫醇、寡肽(例如二肽)、含胺或羧酸的有機分子(例如十六烷胺HDA)、官能化的有機磷化合物(例如膦酸、次膦酸)、親水性膦酸、或具有膦酸酯、亞膦酸酯、胺、羧酸酯、硫醇、咪唑、膦、腈或異腈官能團的親水性低聚物。在某些實施方案中，無機(非半導體)殼層如氧化鋯、氧化鈦、二氧化硅、ZnS、ZnO或MgO可以施用到半導體殼層上以賦予納米晶體有益的表面性質。
[0086]另一方面，納米晶體可以還包括一種或多種連接到半導體納米晶體的表面覆層上的生物學分子(即生物分子)。在某些實施方案中，多個生物分子連接到半導體納米晶體上。對于某些應用，可能期望使額外的有機分子或生物分子連接到納米晶體表面上或親水層上。例如，納米晶體可以包括能夠連接生物分子或其它類型有機分子的表面覆層。生物分子包括例如核酸聚合物、低聚核苷酸、適配體、核苷酸、蛋白質、抗體、酶、肽、碳水化合物、氨基酸、多肽、蛋白質、多糖、脂質、生物素、抗生蛋白鏈菌素等。其它有機分子包括例如染料、淬滅劑(例如甲基紫精(methylviologen))、金屬配體(例如NTA)等。
[0087]在某些實施方案中，半導體納米晶體與包含如本文所公開的活化基團或多個活化基團的配體或多個配體締合。例如，納米晶體可以包括在納米晶體表面上的多官能聚合物覆層，其中覆層可以包含活化劑(例如，異腈基團)。含活化劑的覆層可以促進激活而不需要在單獨步驟中加入活化劑。
[0088]在其它實施方案中，納米晶體綴合到包含組氨酸基團的分子上。例如，覆有DHLA的納米晶體可以綴合到His6-改性的蛋白質(例如聚合酶或葡糖苷酶)上，任選包含包覆蛋白質如BSA或惰性His6-改性的蛋白質。
[0089]在其它實施方案中，納米晶體包括包含一種或多種反應性基團如氨基、疊氮化物、炔、環(huán)炔、膦、羧酸、馬來酰亞胺(maleimido)、硫醇和琥珀酰亞胺酯的表面層。在某些實施方案中，表面層包含炔反應性基團(例如疊氮基團)或疊氮化物反應性基團(例如端炔)。這種反應性基團可以綴合到各種類型的分子上。例如，納米晶體可以提供有疊氮化物反應性基團或炔反應性基團用以在1，3-偶極環(huán)加成反應(例如點擊反應)中與反應配偶體綴合。納米晶體表面上的反應性基團可以連接到各種類型的材料上以形成綴合物，包括但不限于本文所述的任何生物分子和有機分子。
[0090]可以用在本文所述組合物和方法中的可商購半導體納米晶體的例子包括LifeTechnologies Corporation (Carlsbad, CA)的任意 QDOT 納米晶體(例如，在 525、545、565、585、605、625、655、705或800nm具有熒光發(fā)射的納米晶體)，包括但不限于QDOT納米晶體綴合物(例如抗生蛋白鏈菌素綴合物)和官能化納米晶體。合適納米晶體的其它例子包括由羧基、氨基(PEG)基團和脂族烴基衍生的那些(以商品名QDOT Innovator的Toolkit (ITK)可得)，以及反應性納米晶體如QDOT抗體綴合試劑盒、QTRACKER細胞標識試劑盒和Non-Targeted Quantum Dot (非祀向量子點)中提供的。[0091]發(fā)熒光半導體納米晶體可以包括熒光半導體納米晶體和一種或多種與半導體納米晶體締合的淬滅基團。發(fā)熒光半導體納米晶體包括光學活性的半導體核，并且通常包括設置在半導體核材料上的半導體殼層。在不存在淬滅基團下，半導體納米晶體呈光學活性，并且能夠經在合適波長下激發(fā)而發(fā)熒光。這種熒光納米晶體通常發(fā)射在可見光或近IR光譜范圍的光。與淬滅基團締合，熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射強度減小或甚至完全淬滅。如果完全淬滅，發(fā)熒光納米晶體或其群不發(fā)射光或所發(fā)射光的水平低于檢測儀的檢測限度，則納米晶體或其群視為非發(fā)射性的。
[0092]淬滅劑可以是在與半導體納米晶體締合后能夠減小納米晶體的熒光發(fā)射強度的任何基團或化合物。淬滅基團可以與納米晶體以永久或可逆方式締合。在某些實施方案中，淬滅基團可以是金屬源。金屬源的例子包括金屬原子或金屬離子或可以是含金屬化合物的組分如有機金屬化合物或金屬鹽。淬滅基團可以是或包括過渡或非過渡金屬離子如Cu(I)、Cu (II)、Ag (I)、Hg (1、II)、Pb (II)、Pb (IV)、Fe (II)、Fe (III)、Co (II)、Ni (II)和 Cr (1、I1、
II1、IV、V或VI)。在某些實施方案中，淬滅基團包括銅源(例如Cu⑴或Cu(II)離子)。在某些實施方案中，可能期望的是淬滅基團不包括Cu(II)離子。在其它實施方案中，淬滅基團是陰離子如F_、Cl_、S2_、Se2_、I_、Br_、02_、含氧酸根陰離子(oxyanion)(例如硫酸根、磷酸根、硼酸根、硅酸根、硝酸根等)，反應性氧物質(例如OH基、過氧化物、單氧等)，還原劑(例如抗壞血酸鹽、二茂鈷、低價金屬如Cu、Ag、Fe等)或氧化劑(例如Br2、12、Cl2、F2、二茂鐵鐵離子(ferrocinium)、亞硝鐵離子(nitosonium)、一氧化氮等)。
[0093]本文提供的發(fā)熒光半導體納米晶體可以包含至少一種淬滅基團，但通常多個淬滅基團與納米晶體締合。與半導體納米晶體締合的淬滅基團的數(shù)量可以為單個基團至數(shù)千個的這種基團。淬滅基團的數(shù)量通常小于約5000、或小于約4000、或小于約3000。例如,淬滅基團的數(shù)量可以為約I至約50、或約50至約100、或約100至約500、或約500至約1000、或約1000至約1500、或約1500至約2000、或約2000至約2500、或約2500至約3000。在某些實施方案中，與納米晶體締合的淬滅基團的數(shù)量大于50(例如50至約3000)。
[0094]淬滅基團在與熒光納米晶體締合后導致在與淬滅基團締合前的熒光納米晶體所表現(xiàn)出的熒光發(fā)射強度減小。發(fā)射強度可以以不同程度減小。通過比較熒光納米晶體在與淬滅基團締合前的初始熒光強度(Ftl)和納米晶體在與淬滅基團締合后的熒光強度(Fq)來描述所實現(xiàn)的淬滅量。該關系表示為Fq / Ftl之比，本文稱作“淬滅比”。淬滅比的值取決于熒光半導體納米晶體的組成以及與納米晶體締合的淬滅基團的數(shù)量和類型。淬滅比可以為O至1.0，其中淬滅比為O表示納米晶體沒有表現(xiàn)出可檢測的發(fā)射(即非發(fā)射的)。淬滅比大于O但采用標準方法不容易檢測的納米晶體可以視為基本非發(fā)射的。發(fā)熒光納米晶體的淬滅比通常小于1.0、或小于0.90、或小于0.80、或小于0.70、或小于0.60、或小于0.50、或小于0.40、或小于0.30、或小于0.20、或小于0.10。對于許多應用，淬滅比通常小于0.50。
[0095]本文還提供包含如本文所述的發(fā)熒光納米晶體或其群的組合物和試劑盒。在某些實施方案中，納米晶體配制用在體外或體內生物測定中。這種組合物可以是納米晶體的水性或有機分散體(例如膠態(tài)分散體)。發(fā)熒光納米晶體群可以分散在水性介質(例如水或緩沖液)或有機介質(例如有機溶劑或聚合物)中。該介質可以呈液體或固體形式。在一個實施方案中，本文提供發(fā)熒光半導體納米晶體在水性介質中的穩(wěn)定(沒有團聚的)分散體。在某些實施方案中，發(fā)熒光半導體納米晶體可以與固體介質締合。在一些實施方案中，納米晶體與固體載體如玻璃、聚合物或金屬締合。合適的載體包括例如珠粒(例如聚合物、磁性或玻璃珠粒)、微球、載片、纖維、微芯片、微流體通道、微孔板、納米孔、磁盤或磁帶。本文還提供用于將這種組合物施加到這種載體上的方法。在某些實施方案中，如下討論的，組合物還可以包含活化劑如氰化物源(例如氰化物鹽或有機氰化物化合物)。
[0096]本文還公開制備發(fā)熒光半導體納米晶體及其群的方法。一般而言，發(fā)熒光納米晶體可以通過如下制備:將熒光半導體納米晶體與一種或多種淬滅基團締合以減小熒光納米晶體的熒光發(fā)射強度。在通用的方法中，提供包括至少一種熒光半導體納米晶體和至少一種溶劑的反應混合物。本文所述的任意熒光半導體納米晶體可以用在所述方法中。同樣，任何合適的溶劑可以用于分散反應混合物中的納米晶體。然后將一種或多種淬滅基團以足以減小半導體納米晶體的熒光發(fā)射的量加入反應混合物中。本文所述的任何淬滅基團可以用在所公開的方法中。通常反應混合物中所用的溶劑也能夠溶解或分散反應混合物中的淬滅基團。
[0097]通常加入反應混合物中的淬滅基團的量要足以將納米晶體在加入淬滅基團后的熒光發(fā)射信號減小至少50%。加入反應混合物中的淬滅基團的濃度取決于期望與每個半導體納米晶體締合的淬滅基團的量。淬滅基團在反應混合物中的濃度通常為約KT8M至約10_3M。例如，淬滅基團可以以使得多于50個淬滅基團與每個納米晶體(即50:1淬滅基團與納米晶體之比)締合的量加入反應混合物中。在某些制備物中，反應混合物中所存在的淬滅基團/納米晶體之比為約50至約3000、或約50至約1000、或約1000至約2000、或約2000 至約 3000。
[0098]淬滅基團可以在熒光納米晶體存在下培育足以使淬滅基團與半導體納米晶體締合的時間。培育可以在室溫或升高的溫度下進行。溫度可以選擇成優(yōu)化淬滅基團在納米晶體表面上受控沉積并使納米晶體和/或淬滅基團最少團聚。
[0099]本文所述方法可以在溶劑或溶劑混合物中進行。溶劑類型取決于納米晶體的表面性質。疏水性納米晶體容易分散或溶解在與水不混溶的溶劑如己烷、甲苯等中，而不容易分散在水中?；蛘?，親水性納米晶體可以分散在水性溶劑(例如水或緩沖液)中。
[0100]一旦淬滅基團和半導體納米晶體結合，即培育反應混合物。通常培育在室溫下進行，但升高的溫度也可以采用?？梢怨庾V方式監(jiān)測淬滅反應的進行。當納米晶體實現(xiàn)特定的最小發(fā)射強度(發(fā)射強度是淬滅基團與納米晶體表面締合的標記)時，反應可以停止。在某些實施方案中，一旦納米晶體不再表現(xiàn)出熒光發(fā)射，即停止反應。在某些實施方案中，當發(fā)射達到初始熒光強度的約50%、或約40%、或約30%、或約20%、或約10%時停止反應。
[0101]本文所公開的方法可以應用于任何類型的疏水性或親水性熒光半導體納米晶體。當使用疏水性納米晶體時，該方法還可以包括在加入淬滅基團后用使得納米晶體可水分散的親水性化合物處理半導體納米晶體。而且，可以任選包括如本文所公開的一種或多種反應性基團的有機分子如生物分子可以在用淬滅劑處理納米晶體之前或之后連接到納米晶體上。
[0102]本文提供的新材料提供獨特的光譜發(fā)射性質，這允許這些材料實現(xiàn)用在各種基于熒光的測定中，例如免疫吸收測定(ISA)、酶聯(lián)免疫吸收測定(ELISA)、蛋白質免疫印跡(Western blot)、ELISP0T、熒光原位雜交(FISH)、基因檢測和PCR。其它應用包括DNA序列分析；流式細胞術、熒光激活細胞分選測定；生物體系中的診斷、體外和體內成像(例如細胞成像)、單分子顯微術和高通量篩選應用。此外，提供化學開關方法用以實現(xiàn)對半導體納米晶體光學性質的受控操作。如本文所公開的化學開關方法便于納米晶體用在寬范圍的新型發(fā)熒光和數(shù)字顯微測定中。
[0103]本文提供的材料和方法還允許半導體納米晶體與通常使半導體納米晶體熒光淬滅的金屬離子(例如銅催化劑)和金屬底物一起使用。因此，還提供用于在半導體納米晶體上進行金屬催化綴合的材料和方法。
[0104]本文提供的發(fā)熒光納米晶體的一種應用是它們用作檢測并量化生物和非生物被分析物(例如核酸、抗體、蛋白質、肽、碳水化合物等)的發(fā)熒光探針。
[0105]因此一方面，提供檢測生物和非生物樣品中被分析物的方法。在這種方法中，樣品與如本文所述的發(fā)熒光半導體納米晶體(或其群)或納米晶體組合物接觸足以使納米晶體結合樣品中被分析物(如果存在)的時間。接著檢測半導體納米晶體的熒光發(fā)射。由于發(fā)熒光納米晶體的熒光發(fā)射已經淬滅，這種方法可以使用活化劑來恢復(即重新激活)半導體納米晶體的熒光發(fā)射。
[0106]因此，本文還提供激活發(fā)熒光半導體納米晶體的方法以及通過這種方法產生的經激活發(fā)熒光納米晶體群。在這種激活方法中，發(fā)熒光半導體納米晶體或其群與一種或多種活化劑接觸直至發(fā)熒光半導體納米晶體或群的光學性質(例如熒光強度)增強。在加入活化劑的情況下，本文提供的某些測定中的激活速率和終點熒光強度可以顯著增大。不希望囿于理論，與活化劑接觸后，淬滅基團可以從納米晶體表面脫附，由此恢復半導體納米晶體的熒光。但是，淬滅基團脫附不是激活進行的必須要求。
[0107]又一方面，本文提供用于在存在某些活化劑下，即使半導體納米晶體上不存在淬滅基團下，增強熒光半導體納米晶體的光學性質(例如量子產率)的方法。
[0108]本文公開的激活方法通常在室溫下進行，但是激活溫度可以為約15°C至約60°C。通常激活在中性或輕堿性pH(例如pH大于7)下進行。激活可以在例如pH為約8-10、或約
8、或約9、或約10下進行。
[0109]發(fā)熒光納米晶體的發(fā)射強度可以以不同程度增加?？梢酝ㄟ^比較發(fā)熒光納米晶體(發(fā)熒光納米晶體可以是經淬滅或未經淬滅的熒光納米晶體)在與活化劑接觸前的初始熒光強度(Fq)和在與活化劑締合后的經激活納米晶體的熒光強度(Fa)來描述所實現(xiàn)的激活量。該關系可以表示為Fa / Fq之比，本文稱作“發(fā)熒光比”。
[0110]發(fā)熒光比一般大于1，其中發(fā)熒光比為I表示經淬滅和經激活的半導體納米晶體的熒光發(fā)射沒有可檢測的變化。發(fā)熒光比約為I的發(fā)熒光納米晶體視為沒有激活的，而發(fā)熒光比大于I的發(fā)熒光納米晶體視為激活的。經激活的納米晶體的發(fā)熒光比可以大于1.0、或大于10、或大于100、或大于1000、或大于10，000，但是也可以是更高的比例。對于許多應用，發(fā)熒光比大于10。
[0111]發(fā)熒光比的值取決于熒光半導體納米晶體的組成、與納米晶體締合的淬滅基團的數(shù)量和類型以及用于激活經淬滅納米晶體的熒光發(fā)射的活化劑的數(shù)量和類型。
[0112]在已知方法中，發(fā)熒光納米晶體與活化劑或多個活化劑接觸，以使得納米晶體群的熒光發(fā)射強度增加至少10%、或至少25%、或至少50%。
[0113]在另一方法中，將親水性熒光納米晶體(例如連接到多齒硫醇配體的納米晶體)與活化劑或多個活化劑接觸，使得納米晶體群的熒光發(fā)射強度增加至少10%、或至少25%、或至少50%。
[0114]除了熒光強度增強之外，經激活的納米晶體的量子產率可以保持較高，并且往往與納米晶體淬滅之前的相等。像這樣，經激活的半導體納米晶體群的量子產率可以為約10%或更大、或約25%或更大、或約50%或更大、或約75%或更大。
[0115]各種類型的活化劑可以用在本文提供的組合物和方法中，活化劑的具體類型取決于特定納米晶體制備中所用的半導體納米晶體和/或淬滅基團的性質?；罨瘎┛梢灾苯蛹尤?例如通過向包含經淬滅的納米晶體的反應混合物中加入活化劑溶液)。作為替代，或除此之外，化合物可以以休眠或受保護狀態(tài)加入，接著在納米晶體存在下脫保護以釋放活化齊U?；罨瘎┩ǔ＿x擇成不在與納米晶體(例如在可見光和近IR區(qū)域)相同的光譜范圍發(fā)射可檢測的熒光。
[0116]活化劑的例子包括還原劑、氧化劑、金屬離子清除劑和金屬螯合劑，但是許多其它類型的活化劑可以用在本文提供的組合物和方法中。活化劑也可以組合使用(例如作為混合物)以恢復或增強半導體納米晶體的光學性質?；罨瘎┑拇硇岳影ㄙ|子和各種類型的有機陰離子如氰根離子、硫醇鹽離子、羧酸根、鹵離子(例如氟離子)、焦磷酸根和氫氧根離子；以及有機化合物例如包含腈、異腈、疊氮化物、硫氰酸酯、胺或咪唑基團的化合物?；罨瘎┑钠渌影∟O、CO、反應性氧物質(ROS)和過氧化物。
[0117]在某些實施方案中，活化劑是氰化物源。氰化物源可以是包含或能夠提供氰化物基團的任何化合物。氰化物源可以是氰根離子或氰化物鹽例如NaCN、KCN、LiCN或烷基氰化銨(例如四丁基氰化銨)。在其它實施方案中，氰化物源是有機氰化物化合物。有機氰化物化合物的例子包括對甲苯磺酰甲基異氰化物(TOSMIC)、羥基腈(例如苯乙醇腈、丙酮氰醇等)、酰氰和烷基氰酯?；蛘?，氰化物源可以是包含可以在合適條件下產生氰根離子的基團的化合物。這種化合物包括例如異腈和含腈化合物，其中異腈和腈可以水解釋放氰根離子。
[0118]活化劑可以是結合金屬離子或將其轉化為穩(wěn)定絡合物的金屬離子清除劑。在金屬離子清除劑存在下，痕量的金屬離子可以隔離或除去，以使得半導體納米晶體的熒光可以保持。
[0119]在其它實施方案中，活化劑可以是可以與金屬離子形成配合絡合物的金屬螯合齊U。金屬螯合劑可以包含至少2個有機酸基團如羧酸(COO—)和膦酸(PO/—)。金屬螯合劑可以還包含具有孤對電子的額外官能團如胺(包括伯胺、仲胺或叔胺)、羥基(-0H)或硫醇(-SH)基團。
[0120]金屬螯合劑的例子包括(乙二胺)四乙酸(EDTA)、丁二胺四乙酸、(1，2_環(huán)己二胺)四乙酸(CyDTA)、二乙烯三胺五乙酸、乙二胺四丙酸、(羥乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、N，N，N'，N'-乙二胺四(亞甲基膦酸)(EDTMP)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、1，3-二氨基-2-羥基丙烷-N，N，N'，N'-四乙酸(DHPTA)、甲基亞氨基二乙酸、丙烯二胺四乙酸、1，5，9-三氮雜環(huán)十二烷-N，K，N"-三(亞甲基膦酸)(DOTRP)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N'，N"，N"'-四(亞甲基膦酸)(DOTP)、次氮基三(亞甲基)三膦酸、二乙烯三胺五(亞甲基膦酸)(DETAP)、氨基三(亞甲基膦酸)、1_羥亞乙基-1，1-二膦酸、二(六亞甲基)三胺膦酸、1，4，7_三氮雜環(huán)壬烷-N，N'，N"-三(亞甲基膦酸(N0TP)、2-膦?；⊥?1，2，4-三羧酸、次氮基三乙酸(NTA)、檸檬酸、酒石酸、乙醇酸、糖酸、甘油酸、草酸、鄰苯二甲酸、馬來酸、苦杏仁酸、丙二酸、乳酸、水楊酸、5-硫代水楊酸、兒茶酚、沒食子酸、丙基沒食子酸、連苯三酚、8-羥基喹啉、半胱氨酸、組氨酸和多肽。
[0121]在某些實施方案中，金屬螯合劑如EDTA與活化劑(例如氰化物源)組合使用。EDTA是可以與金屬離子形成2-6配位鍵并且可以與各種金屬離子如Cu2+、Fe3+和Co2+形成穩(wěn)定絡合物的多功能螯合劑。
[0122]活化劑可以是聚合物或蛋白質。可以用作活化劑的聚合物例子包括聚乙烯亞胺、多肽、聚丙烯酸(包括其化學改性的衍生物)、RAFT聚合制得的聚合物和聚乙二醇。在某些測定中，可以期望的是使用含胺聚合物作為活化劑?？梢杂米骰罨瘎┑牡鞍踪|的例子包括由血漿如胎牛血清(FBS)及其組分(例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、山羊血清、魚血清如虹蹲鮭魚血清(例如來自 Thermo Fischer Scientific Inc.，Rockford, IL 的 SEA BLOCKBlocking Buffer)、抗體、抗生蛋白鏈菌素、激酶、細胞因子、細胞間蛋白質、膜蛋白質和細胞外蛋白質)衍生得到的那些。
[0123]活化劑可以與發(fā)熒光或熒光納米晶體直接接觸或可以原位生成。在一些實施方案中，激活發(fā)熒光納米晶體可以在存在氰化物源(例如氰根離子)下實現(xiàn)。例如，氰根離子可以以氰化物鹽如KCN的形式遞送給納米晶體?；蛘咔韪x子可以原位生成(例如通過由生氰底物釋放氰化物源(例如異腈或氰根離子))。在特定方法中，氰根離子通過水解含腈和異腈化合物來產生。
[0124]生氰底物包括有機化合物如如上所述的異腈和腈以及生氰酶底物。生氰酶底物包括可以充當催化劑如酶(例如生氰酶)的底物的任意化合物，其中酶能夠切割底物以釋放氰根離子或包含腈或異腈基團的化合物。
[0125]合適的生氰底物包括生氰葡糖苷。生氰底物的例子包括葡糖苷(例如苦杏仁苷、野黑櫻苷、蜀黍苷、巢菜苷、亞麻苦苷、百脈根苷)、氰醇、氰醇酯、氰醇無機磷酸鹽、氰醇酰胺、羥基腈(例如丙酮氰醇、苯乙醇腈、?；杌锖颓杌姿狨?。本文提供的生氰底物可以與生氰酶一起使用。生氰酶通常對特定的生氰底物具有特異性。示例性的生氰酶包括糖苷酶、葡糖苷酶(例如α和β-葡糖苷酶)、酯酶、羥基腈裂解酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷
酶、蛋白酶、磷酸酶和內酰胺酶。葡糖苷酶的例子包括苦杏仁苷酶(例如杏仁β~-葡糖
苷酶)和亞麻仁苷酶。酯酶的例子包括豬肝酯酶和胰酯酶。
[0126]在某些實施方案中，該方法還包括在用生氰酶處理之后水解生氰底物。例如，某些生氰酶底物可以釋放氰化物源如異腈基團，并且可能需要進一步水解以釋放氰根離子。在此方面可以使用的化合物的例子包括裂解酶(例如α-羥基腈裂解酶)、酯酶、蛋白酶或半乳糖酶。
[0127]熒光納米晶體的激活可以作為各種類型的發(fā)熒光測定的基礎。以此方式使用，本文提供的發(fā)熒光納米晶體可以充當發(fā)熒光探針或指示器。本文所公開的發(fā)熒光測定可以用于檢測各種類型的被分析物。例如，被分析物可以是生物分子如蛋白質(包括翻譯后修飾的蛋白質)、肽、核酸、寡核苷酸、適配體、脂蛋白、糖蛋白、碳水化合物、脂質、磷脂、氨基聚糖、酶、或抗原、細胞、或小無機或有機分子(例如藥物、毒素和金屬離子)。通常這種測定使用一種或多種能夠結合待檢測被分析物的結合基團。結合基團的例子包括但不限于抗體、寡核苷酸、適配體和其它類型的化學結合基團(聚合物、金屬配體、蛋白質結合化學物質和活性探針)。
[0128]用于檢測樣品中存在目標被分析物的示例性發(fā)熒光測定是酶基同源鄰近測定。參照圖1，樣品101 (例如生物樣品)與發(fā)熒光半導體納米晶體102接觸，該納米晶體102與能夠結合樣品(如果存在)中被分析物104 (例如抗原)的第一結合基團103 (例如抗體)締合。將樣品與不同于第一結合基團并且也能結合相同被分析物104的第二結合基團105 (例如第二抗體)進一步接觸。在某些測定中，第二結合基團與生氰酶106締合。接著將能夠釋放氰化物源(例如氰根離子或異腈基團)的生氰底物(未示出)加入樣品中。當靠近生氰酶106時，生氰酶使生氰底物釋放氰化物源，由此激活發(fā)熒光納米晶體。檢測測定過程中經激活的半導體納米晶體107的熒光發(fā)射，其中納米晶體的熒光發(fā)射信號強度增加(通常至少25% )表示樣品中存在被分析物。
[0129]本文所公開的發(fā)熒光半導體納米晶體也可以用在各種類型的ELISA測定中。參照圖2所示的示例性測定，使含待檢測被分析物201 (例如抗原)的樣品與兩種不同類型的結合基團(例如抗體)接觸，這兩種基團都能結合被分析物。其中一個結合基團202可以與固體載體203 (例如珠?；虬?締合。第二結合基團204與生氰酶205或者直接或者間接通過第三結合基團206 (例如抗體)締合。將發(fā)熒光半導體納米晶體207或其群加入樣品中，并使樣品與一種或多種生氰底物208接觸?？梢栽诩尤肷璧孜锴斑M行洗滌步驟以除去固體載體上未結合的物質。一旦靠近酶，底物即釋放氰化物源209以激活納米晶體。雖然氰化物源代表性的是多個氰根離子，但任何氰化物源都可以用在所述的測定中。檢測測定過程中經激活的納米晶體210的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號強度增加(通常至少25% )表示樣品中存在被分析物。
[0130]本文所公開的發(fā)熒光納米晶體也可以在鄰近ELISA測定中實現(xiàn)。參照圖3，提供其上已結合有第一結合基團302(例如抗體)和生氰酶303的固體載體301。第一結合基團和酶可以任選連接。將固體載體與疑似包含被分析物304的樣品和不同的第二結合基團305 (例如第二抗體)接觸，其中這兩個結合基團都能結合樣品中被分析物(如果存在)。第二結合基團305與發(fā)熒光納米晶體306或者直接(如圖3所示)或者通過不同的第三結合基團(例如抗體)締合。接著用生氰底物(未示出)處理該結構?？梢栽诩尤肷璧孜锴霸龠M行洗滌步驟以除去固體載體上未結合的物質。一旦與生氰酶接觸，底物即釋放氰化物源(未示出)，由此激活經淬滅的納米晶體的熒光以產生經激活的納米晶體307。熒光發(fā)射信號強度的增加(通常至少25% )表示樣品中存在被分析物。
[0131]本文所公開的發(fā)熒光半導體納米晶體還可以用于檢測核酸。一種通用方法包括將樣品與締合有具有已知序列的第一核酸的發(fā)熒光半導體納米晶體接觸。接著將樣品與具有已知序列的第二核酸接觸，其中第二核酸締合有生氰酶。接著將樣品與生氰底物接觸。一旦與生氰酶接觸，生氰底物即釋放氰化物源，由此激活發(fā)熒光納米晶體。熒光發(fā)射信號強度增加表示存在具有能夠雜交第一和第二核酸鏈的序列的核酸鏈。
[0132]本文還提供發(fā)熒光測定體系。示例性的體系可以包含發(fā)熒光半導體納米晶體或其群，其中納米晶體與第一結合基團締合。該體系還包含與第一結合基團不同的第二結合基團締合的生氰酶。第一和第二結合基團都締合有被分析物或者能夠與被分析物締合。該測定體系還可以包含生氰底物。生氰底物可以在與生氰酶接觸后能夠釋放氰化物源(例如氰根離子或異腈基團)。在某些實施方案中，生氰酶和/或第二結合基團與固體載體(例如珠?；蛭⒖?締合。本文所提供的結合基團、被分析物、氰化物源、底物和酶中的任一個都可以與發(fā)熒光測定體系一起使用。[0133]除了已經提及的使用，所公開的發(fā)熒光納米晶體存在許多其它應用。一種這樣的應用是用于鑒定樣品中細胞或細胞組分的方法。在某些方法中，不同類型的細胞混合物中的各個細胞群可以用發(fā)熒光納米晶體編碼。該方法還包括將樣品暴露于合適的激發(fā)能量源以激活與細胞或細胞組分締合的半導體納米晶體。檢測經激活的納米晶體的熒光發(fā)射可以用來鑒別和/或跟蹤樣品中的細胞或細胞組分。在某些方法中，激活速率和終點熒光還可以通過使用如本文所述的化學活化劑來增強。例如，樣品可以在檢測步驟過程中與聚合物或蛋白質(例如BSA、FBS或PEI)接觸以進一步加速并增強激活。
[0134]在代表性的方法中，將含至少一種細胞的樣品與發(fā)熒光半導體納米晶體在其中納米晶體與細胞締合的條件下接觸。納米晶體可以通過包含在細胞內的細胞核、細胞質或細胞器官中與細胞締合；整體或部分埋在細胞內的細胞質膜、細胞核膜或任意其它的膜中；結合到細胞內或細胞膜中的分子上；或以耐受環(huán)境或環(huán)境變化的方式固定到細胞上。
[0135]在本文所提供的細胞鑒定方法中，細胞可以是細胞群的成員，其中該群可以包括一種或多種類型的細胞。細胞可以是活的或死的；細胞可以是任意來源的，包括原核生物、真核生物或蛋白類毒性基(archeon)。細胞可以是培養(yǎng)的細胞系或原發(fā)隔離群，細胞可以是哺乳動物、兩棲動物、爬行動物、植物、酵母、細菌、螺旋原蟲或原生動物的。細胞可以是例如但不限于人類、鼠類、大鼠、倉鼠、雞、鵪鶉、山羊或狗細胞。細胞可以是正常細胞、變異細胞、遺傳控制的細胞、腫瘤細胞。
[0136]在某些方法中，該方法可以用于鑒定由一種或多種活細胞的初始樣品衍生得到的細胞群，在多次細胞分裂后經由其獨特的光譜識別標志進行鑒定。根據(jù)它們的光譜識別標志檢測由一些前體衍生得到的細胞群的能力非常有助于高處理量地分析許多體系。
[0137]本文還提供用于鑒定樣品中細胞或細胞組分的發(fā)熒光測定體系。示例性的體系可以包含發(fā)熒光半導體納米晶體或其群，其中每個納米晶體都與細胞或細胞組分締合。根據(jù)測定中所用發(fā)熒光納米晶體的類型，該體系還可以包含如本文所公開的化學活化劑(例如氰化物源和/或聚合物或蛋白質如BSA、FBS或PEI)，以進一步加速和增強發(fā)熒光納米晶體的激活。
[0138]所公開的發(fā)熒光納米晶體還可以充當敏感氰化物傳感器。由此，還提供檢測樣品(例如水或生物樣品如血、組織等)中氰根離子的方法。將疑似包含氰根離子的樣品與發(fā)熒光半導體納米晶體或其群接觸，其中發(fā)熒光納米晶體包含一個或多個能夠與氰根離子絡合的淬滅基團(例如Cu(I)或Cu(II)離子)。檢測測定過程中的熒光發(fā)射。熒光發(fā)射信號的強度增加表示樣品中存在氰根離子。
[0139]因此，本文還提供用于檢測樣品中氰根離子的熒光測定體系。示例性的體系可以包含發(fā)熒光半導體納米晶體或其群，其中每個納米晶體包含一個或多個能夠與氰根離子絡合的淬滅基團(例如Cu⑴或Cu(II)離子)。
[0140]本文公開的發(fā)熒光納米晶體也可以用在廣泛的數(shù)字檢測和量化技術中。在這些方法中，發(fā)熒光納米晶體的熒光可以在活化劑或淬滅基團的存在下化學切換“開”或“關”。在其它方法中，利用光脈沖切換“開”或“關”發(fā)熒光納米晶體。在其它方法中，通過對納米晶體施加電勢來切換“開”或“關”發(fā)熒光納米晶體。
[0141]檢測到納米晶體的熒光發(fā)射可以表示納米晶體的存在和位置，以及樣品中熒光物質的數(shù)量。在一種通用方法中，將熒光半導體納米晶體或其群或發(fā)熒光納米晶體或其群與用于調節(jié)納米晶體的至少一種光學性質(例如熒光發(fā)射)的化合物接觸。一旦激活，接著可以通過檢測納米晶體產生的熒光發(fā)射來確定納米晶體的位置。
[0142]本文提供的光學、化學和電學切換方法可以與各種顯微技術組合使用以便于檢測納米晶體。在某些實施方案中，可以采用所公開的切換方法在單分子水平檢測納米晶體。精確切換本文所提供的納米晶體的光學性質可以以數(shù)字形式改變單個納米晶體在受關注的特定區(qū)域中的熒光發(fā)射和其它光學性質。按此方式使用，本文所提供的發(fā)熒光納米晶體可以在許多類型的基于突光的數(shù)字生物測定包括數(shù)字蛋白質組(digital proteomics,例如鄰近免疫測定)、基因組和小分子檢測中實現(xiàn)應用。
[0143]在一個實施方案中，化學切換可以通過如本文所公開的使熒光或發(fā)熒光納米晶體與淬滅劑或活化劑接觸來實現(xiàn)，以使得納米晶體的熒光發(fā)射強度減小或增大。在使用發(fā)熒光納米晶體的實施方案中，可以接著用活化劑處理經淬滅的熒光納米晶體來恢復納米晶體的熒光，以使得納米晶體的熒光發(fā)射強度增大。在某些測定中，將納米晶體與活化劑和淬滅基團交替接觸來以數(shù)字方式切換發(fā)射“開”和“關”。對于某些測定，可以將納米晶體或其群結合到固體載體(例如玻璃載片)上以便于用活化劑和淬滅劑的溶液或其它洗滌溶液重復處理。接著可以以光譜方式檢測經激活或經淬滅的納米晶體以確定它存在(或不存在)和/或位置。在某些實施方案中，在淬滅劑存在下，納米晶體的熒光發(fā)射減少至少約50%。同樣，在活化劑存在下，經淬滅的納米晶體的熒光發(fā)射可以增加至少約50%，并往往恢復至其初始(即未經淬滅的)值。
[0144]在暴露于光輻射后，經淬滅和未經淬滅的納米晶體被化學活化劑激活的速率和程度可以進一步增強和加速。在某些實施方案中，即使不存在化學活化劑，單單光即可足以引起納米晶體發(fā)生相當可觀的激活。
[0145]在某些方法中，在不使用化學活化劑下實現(xiàn)顯著的光激活。例如，在適當波長下照射經淬滅的熒光納米晶體可以激活納米晶體的熒光，以使得納米晶體的熒光發(fā)射強度增大。在某些測定中，采用起到以數(shù)字方式切換發(fā)射“開”和“關”作用的光脈沖照射納米晶體。在某些測定中，可以切換光激活“開”和“關”來跟蹤細胞或細胞組分中的熒光納米晶體。
[0146]本文提供的發(fā)熒光納米晶體可以光激活。光激活可以利用任何合適的照射源如激光器、燈、發(fā)光二極管等來實現(xiàn)。在某些實施方案中，倏逝場(evanescent field)可以用來光激活結合到表面上的發(fā)熒光納米晶體。在其它實施方案中，光子帶隙結構用來光激活發(fā)熒光納米晶體?？梢杂萌魏螢榧{米晶體提供光譜信息的合適光檢測系統(tǒng)例如光柵光譜儀、棱鏡光譜儀、成像光譜儀、照相機等，或使用干涉(帶通)濾波器，來檢測所發(fā)射的光。使用二維區(qū)成像儀如CXD照相機，可以同時將許多物體成像。光譜信息可以通過經由不同帶通、長通或短通濾波器(例如干涉濾波器、有色玻璃濾波器或電子可調濾波器)收集一幅以上的圖像來產生。一旦已經收集數(shù)據(jù)，即可以經由標準圖像處理技術處理以生成關于圖像中物體或圖像中每個像素或像素群的光譜信息。
[0147]可以用來激活本文所公開的熒光和發(fā)熒光納米晶體和/或使其成像的成像儀器和技術的例子包括例如熒光顯微鏡、全內反射熒光(TIRF)顯微鏡、寬場熒光顯微鏡、共焦熒光顯微鏡、熒光微板讀取儀、高內涵成像系統(tǒng)、熒光相關光譜儀(FCS)、流式細胞儀包括基于珠粒的聲聚焦流式細胞儀如ATTUNE聲聚焦流式細胞儀(可從Life TechnologiesCorporation獲得)、光纖、波導、光盤、微流控和光子帶隙結構(例如光子晶體)。
[0148]在某些方法中，具有周期性光柵結構的光子晶體用來激活和/或檢測樣品中發(fā)熒光納米晶體的存在。樣品和/或發(fā)熒光納米晶體可以緊密鄰近光子晶體表面。通常發(fā)熒光納米晶體與晶體表面接觸。光子晶體在合適波長和入射角的照明可以誘導產生激發(fā)共振模式和引出共振模式，所述激發(fā)共振模式具有與發(fā)熒光納米晶體的激發(fā)光譜重疊的光譜，所述引出共振模式具有與納米晶體的發(fā)射光譜重疊的光譜。因照明所致的激發(fā)和引出共振模式激活發(fā)熒光納米晶體并導致納米晶體發(fā)光。當與本文提供的發(fā)熒光納米晶體一起使用時，光子晶體可以用于顯著增強所得納米晶體圖像的強度和/或分辨率。
[0149]本文提供的納米晶體還可以與超分辨率顯微(SRM)技術一起使用來使熒光物質以高于衍射極限的分辨率成像。例如，SRM方法可以期望用來精確地確定兩種不同納米晶體的位置，非常接近于小于第一和/或第二納米晶體所發(fā)射光的波長的準確度。各種高和超分辨率顯微(SRM)技術都是可得的，并且可以用來使本文提供的納米晶體成像，包括例如結構化照明顯微術(SM)、受激發(fā)射損耗(STED)、隨機光重建顯微術(STORM)、光激活定位顯微術(PALM)以及漂白/眨閃輔助定位顯微術。
[0150]本文提供的某些活化劑可以有效恢復經金屬淬滅的半導體納米晶體的經淬滅熒光發(fā)射的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在為半導體納米晶體提供用在各種要求與金屬和有機金屬化合物、底物(例如銅、黃銅、不銹鋼、青銅等)和金屬催化劑(例如Cu⑴和Cu(II))接觸的新領域的能力。
[0151]一種特別受關注的領域是將銅催化環(huán)加成反應如“點擊化學”用于官能化半導體納米晶體?！包c擊化學”通常指疊氮化物和炔之間的1，3_偶極環(huán)加成反應。該反應在銅催化劑(通常銅離子)存在下進行。
[0152]點擊化學是廣泛采用的有效綴合技術，尤其用于在水性介質中綴合。但是，利用銅催化點擊反應官能化半導體納米晶體迄今并沒有實踐，這是因為銅催化劑的存在導致納米晶體熒光發(fā)射發(fā)生不可逆的淬滅。本文提供的某些活化劑(例如氰根離子)的使用現(xiàn)在使得能夠將銅催化的綴合反應用于將分子接枝到半導體納米晶體表面上。
[0153]本文提供用于將銅催化點擊化學與半導體納米晶體一起使用的方法。在利用點擊化學使化合物附著到半導體納米晶體上的代表性方法中，將包含炔反應性基團或疊氮化物反應性基團的熒光半導體納米晶體與包含在銅催化劑(例如Cu(I)或Cu(II)離子)存在下能夠與炔反應性基團或疊氮化物反應性基團反應的反應性材料接觸。該納米晶體綴合物可以與如本文所公開的活化劑接觸，以使得納米晶體的熒光發(fā)射強度增加。
[0154]反應性材料的例子包括氨基酸、肽、蛋白質(包括酶(例如聚合酶)、抗體、抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白)、碳水化合物、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、藥物、脂質、合成聚合物、生物素和固體載體。
[0155]反應性材料可以還包括用于檢測的標記物(例如染料)。在本文所述利用“點擊”化學標記改性半導體納米晶體的方法的某些實施方案中，改性納米晶體可以具有疊氮化物基團，而標記物具有炔基團。在其它實施方案中，改性納米晶體可以具有炔基團，而標記物具有疊氮化物基團。
[0156]在某些實施方案中，炔或疊氮化物衍生化的納米晶體是可水分散的，以使得該反應可以在水性介質中進行。銅源通常以溶液形式加入。但是，在某些實施方案中，使用被銅離子淬滅的發(fā)熒光納米晶體。在這種方法中，表面結合的銅離子可以有助于催化該點擊反應，以使得可以減少額外銅離子的量；在一些方法中，可以完全不需要加入額外的銅離子。因此，任選地點擊反應可以在至少一種還原劑的存在下進行。
[0157]在本文所述利用“點擊”化學標記改性生物分子的方法的某些實施方案中，包含“點擊”化學反應物的溶液還包含Cu(I)離子；Cu⑴離子和銅螯合劑；Cu(II)離子和至少一種還原劑；或Cu(II)離子、至少一種還原劑和銅螯合劑。
[0158]綴合后，納米晶體綴合物的熒光發(fā)射通常減小或甚至完全淬滅。納米晶體與活化劑(例如含活化劑的溶液)接觸引起納米晶體的熒光發(fā)射強度增加。可用于恢復點擊綴合后納米晶體發(fā)射的代表性活化劑包括如本文所公開的氰化物源。在某些實施方案中，氰化物源包括如本文所公開的氰根離子、有機氰化物化合物(例如異腈)或生氰底物。用活化劑處理綴合納米晶體可以將納米晶體的熒光發(fā)射恢復至其初始值的至少50%、或至少60%、或至少70 %、或至少80 %、或至少90 %。 [0159]用作“點擊”化學反應催化劑的銅通常呈Cu(I)還原態(tài)。用在銅催化疊氮化物-炔環(huán)加成中的合適Cu(I)源可以是任何亞銅鹽，包括但不限于鹵化亞銅如溴化亞銅或碘化亞銅。區(qū)域選擇性環(huán)加成也可以在金屬催化劑和還原劑存在下進行。在某些實施方案中，在還原劑存在下銅可以以Cu(II)還原態(tài)(例如作為鹽，例如但不限于Cu(N03)2、Cu(OAc)2或CuSO4)提供，其中Cu(I)通過Cu(II)還原原位形成。這種還原劑包括但不限于抗壞血酸鹽、三(2-羧乙基)膦(1^^?)、應0!1、應0?!1、硫代硫酸鹽、金屬銅、氫醌、維生素1(1、谷胱甘肽、半胱氨酸、2-巰基乙醇、二硫代蘇糖醇、Fe2+、Co2+或施加電勢。在其它實施方案中，還原劑包括選自 Al、Be、Co、Cr、Fe、Mg、Mn、N1、Zn、Au、Ag、Hg、Cd、Zr、Ru、Fe、Co、Pt、Pd、N1、Rh 和 W的金屬。
[0160]銅(I)-催化疊氮化物-炔環(huán)加成可以在水和各種溶劑中進行，包括水和各種(部分)混溶有機溶劑包括醇、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、叔丁醇(tBuOH)和丙酮的混合物。
[0161]銅離子在水性溶劑中可以不穩(wěn)定。因此，穩(wěn)定化配體/螯合劑可以用于提高反應效率。在某些實施方案中，至少一種銅螯合劑用在本文所述方法中，其中這種螯合劑結合Cu(I)態(tài)的銅。在其它實施方案中，至少一種銅螯合劑用在本文所述方法中，其中這種螯合劑結合Cu(II)態(tài)的銅。在某些實施方案中，銅⑴螯合劑是含1，10-鄰二氮菲的銅⑴螯合劑。這種含鄰二氮菲的銅(I)螯合劑的非限制性例子包括但不限于紅菲繞啉二磺酸(4，7-二苯基-1，10-鄰二氮菲二磺酸)和浴銅靈二磺酸(BCS ;2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-鄰二氮菲二磺酸酯)。在其它實施方案中，銅(I)螯合劑是THPTA、N-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2，6- 二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、曲恩汀、四亞乙基多胺(TEPA)、N，N，N，，N，-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、EDTA、新亞銅試劑、N-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2，6- 二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、三-(芐基-三唑基甲基)胺(TBTA)或其衍生物。在某些實施方案中，EDTA用作螯合劑。在某些實施方案中，組氨酸用作螯合劑，而在其它實施方案中，谷胱甘肽用作螯合劑和還原劑。
[0162]本文所述“點擊”化學反應中所用還原劑的濃度可以在微摩爾至毫摩爾的范圍中。在某些實施方案中，還原劑的濃度為約100微摩爾至約100毫摩爾。在其它實施方案中，還原劑的濃度為約10微摩爾至約10毫摩爾。在其它實施方案中，還原劑的濃度為約I微摩爾至約I毫摩爾。
[0163]本文提供的半導體納米晶體也可以用在許多其它類型的綴合反應中，包括但不限于用以將分子接枝到納米晶體表面上的環(huán)加成反應。例如，可以為納米晶體提供疊氮化物和炔基團，以使得它們可以通過利用激活炔與疊氮化物的反應而經歷無催化劑的[3+2]環(huán)加成。炔可以通過環(huán)張力激活，例如僅作為例子的八元環(huán)結構，使吸電子基團附到這種炔環(huán)上，或炔可以通過加入路易斯酸例如僅作為例子的Au(I)或Au (III)來激活。
[0164]在利用本文所述激活炔標記改性納米晶體的方法的某些實施方案中，半導體納米晶體可以具有疊氮化物基團，而反應配偶體可以具有經激活的炔基團；在其它實施方案中，改性納米晶體可以具有經激活的炔基團，而反應配偶體具有疊氮化物基團。
[0165]或者，將分子綴合到本文提供的半導體納米晶體上也可以利用Staudinger連接反應來實現(xiàn)，該反應涉及三價磷化合物與有機疊氮化物之間的反應，這兩種物質都可以與半導體納米晶體締合。本文所述Staudinger連接方法中所用的膦包括但不限于環(huán)狀或無環(huán)的、鹵化的、雙磷或甚至聚合物的。類似地，疊氮化物可以是烷基、芳基、?；蛄柞；?。
[0166]在利用本文所述Staudinger連接標記改性納米晶體的方法的某些實施方案中，改性納米晶體可以具有疊氮化物基團，而反應配偶體具有膦基團，包括但不限于三芳基膦基團；而在其它實施方案中，改性反應配偶體可以具有膦基團，標記物具有疊氮化物基團。
[0167]本文所述的發(fā)熒光納米晶體和組合物還可以構成試劑盒的一部分。本文提供用于各種生物應用和測定的試劑盒。
[0168]本文所公開的任一試劑盒所用的試劑盒試劑可以以溶液形式封裝，可以作為液體介質(例如水或有機溶劑)中的懸浮液封裝，或者可以與固體載體(例如載片、微芯片、珠粒、纖維、微孔板、納米孔、磁盤或磁帶)締合。本文所公開的試劑盒還可以提供有關于使用試劑盒的說明書。
[0169]在一個實施方案中，試劑盒包括用于編碼細胞或細胞組分的發(fā)熒光納米晶體群?？捎糜谟眉{米晶體群編碼細胞的額外緩沖液或其它試劑也可以包括在試劑盒(例如洗滌緩沖液如PBS、培育緩沖液，活化劑包括蛋白質或聚合物用以增強激活)中。此外，試劑盒可以設計用于多樣應用，包含可用于同時編碼多個不同細胞群的多個發(fā)熒光納米晶體群。
[0170]本文所公開的試劑盒可以包括活化劑。例如，活化劑可以是氰化物源如氰化物鹽，有機氰化物化合物，或生氰酶底物，以及對生氰底物呈特異性并且能切割生氰底物以釋放氰根離子或異腈基團的生氰酶。
[0171]因此，一方面提供一種用于實施發(fā)熒光測定的試劑盒，包括如本文所公開的一個或多個發(fā)熒光納米晶體群和活化劑，其中活化劑激活并增強發(fā)熒光納米晶體的熒光發(fā)射。對于某些類型的試劑盒，發(fā)熒光納米晶體可以與一種或多種抗體或寡核苷酸締合。
[0172]還提供用于實施環(huán)加成反應例如點擊反應的試劑盒。用于實施銅催化環(huán)加成反應的試劑盒可以包括一個或多個被炔反應性基團(例如疊氮基)或疊氮化物反應性基團(例如端炔、環(huán)辛炔或膦)官能化的熒光半導體納米晶體群；可以包括例如作為Cu(I)或Cu(II)離子的銅源；至少一種活化劑如氰化物源(例如氰化物鹽或有機氰化物化合物)；和任選至少一種還原劑。
[0173]在用于實施環(huán)加成反應的另一類型試劑盒中，試劑盒包括至少一個被Cu(I)或Cu(II)離子淬滅并用炔反應性基團或疊氮化物反應性基團官能化的發(fā)熒光半導體納米晶體群。在某些包含發(fā)熒光、經銅淬滅的納米晶體的試劑盒中，不包括額外的銅源。
[0174]下面實施例用來舉例說明本文所述的實施方案，但并不限于這些實施方案。
實施例
[0175]實施例1
[0176]在水性溶劑中制備經淬滅的半導體納米晶體
[0177]如下確定銅離子濃度對親水性半導體納米晶體的熒光發(fā)射的影響:將硫酸銅
(II)在水或緩沖液中的溶液(IOOnM-1OmM)緩慢加入親水性半導體納米晶體(例如LifeTechnologies Corporation, Carlsbad, CA的QDOT羧基或氨基半導體納米晶體或QDOT抗生蛋白鏈菌素綴合物)的水性溶液(1ηΜ-500ηΜ)中。采用超濾濃縮該組合溶液，或利用尺寸排阻或離子交換色譜將其純化。如圖4所示，親水性納米晶體的熒光強度隨銅離子濃度增加而下降。
[0178]實施例2
[0179]在非水性溶劑中制備經淬滅的半導體納米晶體
[0180]將金屬化合物(例如三氟甲磺酸銅(II))在有機溶劑(例如THF)中的溶液(IOOnM-1OmM)緩慢加入疏水性核/殼半導體納米晶體在有機溶劑(例如氯仿)中的溶液(IOnM-1OuM)中。可以進一步處理疏水性經銅淬滅的粒子而使它們呈可水分散的。例如,可以使用醇沉淀離子，離心收集，接著再將其分散到所需的溶劑中?；蛘?，可以使用兩性聚合物將疏水性粒子交換到緩沖液中。圖5是包覆聚合物的納米晶體的熒光強度與淬滅溶液中銅離子濃度的函數(shù)關系圖。
[0181]實施例3
[0182]氰化物激活經淬滅的半導體納米晶體
[0183]將氰化物鹽(例如氰化鉀)在水或緩沖液中的溶液(10uM-500mM)緩慢加入如實施例1或實施例2所述制備的經銅淬滅的半導體納米晶體(Life TechnologiesCorporation的QD0T625ITK羧基納米晶體)在水或緩沖液中的(InM-1OOnM)溶液中。經銅淬滅的納米晶體的發(fā)熒光響應與KCN濃度的函數(shù)關系示于圖6。
[0184]實施例4
[0185]光激活經淬滅的半導體納米晶體
[0186]采用激光器照明(在405nm)來激活經銅淬滅的納米晶體的熒光。親水性納米晶體按實施例2所述使用兩性和PEG聚合物的組合制備。將納米晶體在pH為7.8或10的緩沖液中激活，可以經過和不經過氰化物處理。圖7示出所測試的各材料的發(fā)熒光響應:A)經照明的未經淬滅的熒光納米晶體(對照)；B)經淬滅的(pHIO，有照明);C)經淬滅的(pHIO，2mM KCN) ；D)經淬滅的(pHIO，有照明，2mM KCN) ；E)經淬滅的(pH7.8，有照明)JPF)經淬滅的(PH7.8，有照明，2mM KCN)。數(shù)據(jù)證實照射可以恢復經淬滅的納米晶體的熒光發(fā)射強度。此外，激活可以通過照射納米晶體與氰化物激活一起來顯著增強和加速。
[0187]實施例5
[0188]酶促激活經淬滅的半導體納米晶體
[0189]可以采用催化(例如酶促)、化學和光化學方法選擇性生成用于恢復經淬滅的發(fā)熒光納米晶體的熒光的活化劑。一旦納米晶體的熒光發(fā)射恢復，這些納米晶體可以用于利用許多類型的不同測定來檢測寬范圍的被分析物(例如蛋白質、寡核苷酸、小分子等)。
[0190]酶促激活納米晶體熒光可以在多孔板中得到證實。多孔板的每個孔包含在10至300mM 的 pH 為 6 至 9 的緩沖液(例如 MES、ACES、MOPS、HEPES 或 Tris.CHES)中的 I 至 50nM經銅淬滅的QD0T585或QD0T625納米晶體(例如按實施例1所述制備的)、10至200mM生氰底物(例如苦杏仁苷或野黑櫻苷)和O至10 μ M β-葡糖苷酶。每個孔中最終的溶液體積可以為約10至300yL。將所有組分加入每個孔中，其中酶最后加入以起動熒光恢復。測定可以在約15至約60°C的溫度下進行。根據(jù)測定約束條件，激活和讀出可以在相同或不同溫度和/或酸度下進行?？梢栽诟鞣N類型的儀器例如熒光讀取器(例如Tecan Group Ltd.(Switzerland)的 M1000 讀板器)或 qPCR 設備，例如 Applied Biosystems (Foster City,CA)的St印OnePlus?實時PCR系統(tǒng)上讀取測定結果。
[0191]實施例6
[0192]兩步生氰酶激活經淬滅的半導體納米晶體
[0193]按實施例1或實施例2所述淬滅QD0T625納米晶體(Life TechnologiesCorporation),并用通過在葡糖苷酶存在下水解苦杏仁苷生成的氰化物激活。將杏仁β -葡糖苷酶(Sigma ;St.Louis, MO)滴定成一系列樣品，每個樣品包含苦杏仁苷(Sigma)(IOOmM)。將酶、納米晶體和底物在pH6-8下培育0_3小時。培育后，將溶液在冰上冷卻，并加入在堿性緩沖液中的納米晶體，以使溶液的PH為10。這同時起動納米晶體激活并停止酶活性。使用 StepOnePlus? 實時 PCR 系統(tǒng)(Life Technologies Corporation)測量納米晶體隨時間的熒光發(fā)射。圖8所示的終點滴定曲線表明發(fā)熒光納米晶體激活發(fā)生在與生氰酶和底物生成的氰化物接觸后。
[0194]實施例7
[0195]數(shù)字檢測化學切換的半導體納米晶體
[0196]本實施例描述采用全內反射熒光顯微術在流動細胞模式化學切換納米晶體熒光和在單分子水平的數(shù)字檢測。用淬滅劑(例如Cu(II)鹽)和活化劑(例如KCN)的溶液交替洗滌表面結合的發(fā)熒光納米晶體，同時采集熒光顯微鏡上的圖像。用5pM至IOnM的QD0T625抗生蛋白鏈菌素納米晶體(Life Technologies Corporation)的含水溶液處理低密度生物素表面(例如MicroSurfaces，Inc.(Austin, TX)的BIO-Ol載片)以將納米晶體結合到載片上。在充分的培育時段后，用大量的緩沖液洗掉沒有結合的納米晶體，接著使IOOnM至10μ M的Cu(II)溶液流過表面以淬滅剩余表面結合的納米晶體的熒光。第二次洗滌除去多余的Cu(II)離子。通過用IOOyM至IOOmM KCN處理來激活經淬滅的納米晶體。在激活后，從納米晶體上洗去多余的KCN，并檢測405nm激發(fā)下的熒光發(fā)射(圖9)。
[0197]實施例8
[0198]數(shù)字檢測化學切換的半導體納米晶體
[0199]本實施例描述采用熒光顯微術在流動細胞模式光激活納米晶體熒光和在單分子水平的數(shù)字檢測。用405nm激光器照射表面結合的發(fā)熒光納米晶體，同時采集熒光顯微鏡上的圖像。如實施例7所述制備并處理低密度生物素表面。在充分的培育時段后，用大量的緩沖液洗掉沒有結合的納米晶體。以適當功率(I至100W / cm2)照射相關區(qū)域，同時成像。圖10示出以?20mW / cm2的功率照射之前(A)和之后(B)的經淬滅的納米晶體。以20W / cm2至80W / cm2的功率照射的經光激活的納米晶體的熒光響應示于圖11。加入KCNdOuMM IOOmM)明顯增大經淬滅的納米晶體的光激活速率。照射(20W / cm2)與2mMKCN處理組合的影響繪于圖11 (D)。
[0200]實施例9
[0201]增強量子產率
[0202]描述在不同反應條件下用氰化物處理親水性半導體納米晶體的效果。將硫醇包覆的納米晶體分散在含水緩沖液(pH7.5，50mM Tris、4mM NaCl)中。將在水中的0.5M KCN加入納米晶體分散液中以提供143mM KCN溶液，并培育反應混合物。在不同時間點后測量納米晶體的量子產率。圖12示出處理(A)前以及用氰化物培育(B) 12分鐘、(036分鐘和(D) 135分鐘后的量子產率圖。這些數(shù)據(jù)證實熒光納米晶體的量子產率可以通過用氰化物源處理顯著增強。
[0203]實施例10
[0204]光學檢測活細胞中的發(fā)熒光納米晶體
[0205]將活HeLa細胞用發(fā)熒光納米晶體編碼，并利用光激活恢復該活細胞中的發(fā)熒光納米晶體的熒光。通過將1-8 μ M按實施例2所述制備的，最大發(fā)射波長為625nm的親水性經銅淬滅的納米晶體與l-3mL新鮮生長介質或Ix HBSS (Life Technologies Corporation)混合來制備標記溶液。生長介質包括GIBCO最低必需介質(MEM) (Life TechnologiesCorporation)和 10%FBS(Life Technologies Corporation)。將該標記溶液加入在 35mm玻璃底盤傳代培養(yǎng)過夜的單層HeLa細胞上。在37°C和95%空氣、5% CO2的濕氣氛中培育45-120分鐘后，用新鮮的生長介質(包含MEM和10% FBS)或緩沖液(例如Ix PBS或IxHBSS)兩次洗滌細胞。
[0206]利用共焦顯微鏡，在整個細胞或細胞區(qū)域中，使用激光器照射(在405nm或458nm)激活經銅淬滅的納米晶體的熒光。測量激活前(即正好在照射開始之后)和一段長時間照射后(?7分鐘)的熒光強度。圖13示出針對在HPSS或生長介質中培育或成像的樣品采集的熒光數(shù)據(jù)。結果表明，發(fā)熒光響應對于在MEM和10% FBS存在下成像的納米晶體大部分增強。
[0207]實施例U
[0208]激活并檢測溶液中的發(fā)熒光納米晶體
[0209]利用LED (Mouser Electronics的UV VCC標準)對在96孔板中的經銅淬滅的納米晶體進行實時光激活和成像。通過將1-8 μ M按實施例2所述制備的，最大發(fā)射波長為625nm的親水性經銅淬滅的納米晶體與l_3mLGIBC0最低必需生長介質(60% MEM)和/或20% FBS混合來制備標記溶液。所有樣品包含50mM MES或HEPES緩沖液并且在pH6_8。
[0210]圖14 示出在(A) FBS (20% ), (B)MEM(60% ) FBS (20 % ), (C)MEM(60% )、或(D)單獨的緩沖液中激活和成像的樣品隨時間的發(fā)熒光響應。經淬滅的納米晶體的光激活動力學和終點熒光在FBS存在下顯著增強。當該實驗使用聚乙烯亞胺或BSA進行時還實現(xiàn)增強。
[0211]實施例12
[0212]苯乙醇腈激活經淬滅的半導體納米晶體
[0213]在IOOmM MES、pH6.0中制備一系列苯乙醇腈稀釋液。該系列稀釋液中苯乙醇腈濃度為40mM至0.68 μ M，并與僅有緩沖液的對比反應比較。將如本文所述制備的(20ηΜ，在IM CHES中、pHI0.0)經銅淬滅的核-殼半導體納米晶體加入苯乙醇腈稀釋液中，最終濃度為4nM。將反應物混合，并以IOOOXg離心I分鐘。在室溫用405nm LED照射一組激活反應物15分鐘。第二組反應在不存在任何照射下繼續(xù)并保護起來避光15分鐘。檢測激活實驗后的納米晶體的熒光(405nm激發(fā)/ 625nm發(fā)射)。經銅淬滅的納米晶體在(A) LED照射下和(B)沒有LED照射的發(fā)熒光響應與苯乙醇腈濃度的函數(shù)關系示于圖15。
[0214]實施例13
[0215]綴合和提純AbG-抗生蛋白鏈菌素用于ELISA
[0216]將杏仁的β -葡糖苷酶(AbG) (Sigma-Aldrich C0.，St.Louis, MO)溶解在 50mMM0PS、pH7.0和IOOmM NaCl中至最終濃度為25mg / mL。將該溶液裝載到4°C用50mM MOPS、ρΗ7.0 和 IOOmM NaCl 平衡的 SUPERDEX200 (GE Healthcare Bio-Sciences, AB, Sweden)尺寸排阻柱上。篩分洗脫級分(每個1.5mL)用于對硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷(pNPbG)水解。通過SDS-PAGE拆分水解陽性的級分，并合并包含純AbG的那些。對于抗生蛋白鏈菌素(SA)標記，將0.5mg AbG與10倍摩爾過量的SM(PEG)24交聯(lián)劑(Thermo Scientific,Rockford, IL)(溶解在純DMSO中)組合在pH為7.0的IOOmM磷酸鈉中。同時，使Img SA與10倍摩爾過量的Traut試劑(溶解在純DMS0)在pH為7.0的IOOmM磷酸鈉中反應。將這兩種反應體系在室溫搖動培育30分鐘，之后使用用IOOmM磷酸鈉、pH7.0和5mM EDTA平衡的 P30 脫鹽柱(Bio-Rad Laboratories 的 B10-SPIN30 柱)分離 AbG-PEG24-馬來酰亞胺和SA-SH。將從以上反應獲得的AbG-PEG24-馬來酰亞胺和SA-SH混合，并室溫搖動培育2小時。使用用50mM M0PS、pH7.0和IOOmM NaCl溶液平衡的P30脫鹽旋轉柱分離AbG-PEG24-SA綴合物。通過SDS-PAGE拆分確認綴合。在SUPERDEX200柱上通過尺寸排阻從游離抗生蛋白鏈菌素中提純綴合物。篩分柱級分用于用生物素包覆的96孔板(Thermo Scientific)的生物素結合。篩分來自板結合測定的結合和可溶物質用于PNPbG水解活性。將在結合相中而非在可溶相中包含水解活性的尺寸排阻級分合并并用于ELISA。
[0217]實施例14
[0218]經銅淬滅的半導體納米晶體和AbG-SA IL-6ELISA
[0219]利用人類IL-6 超靈敏 ELISA 試劑盒(KHC0064C ;Life Technologies, Carlsbad,CA)進行ELISA實驗。制備一系列2倍IL-6稀釋液，濃度覆蓋400pg / mL至6.25pg/mL的范圍。將含IL-6的反應體系與僅有緩沖液(不含IL-6)的陰性對照進行比較。對每個IL-6滴定點制備重復液(N=6)。按照制造商的規(guī)定形成抗IL-6免疫復合物。對于IL-6檢測，將AbG-PEG24-SA綴合物替代來自ELISA試劑盒的辣根過氧化物酶抗生蛋白鏈菌素綴合物(HRP-SA)加入。用免疫復合物將AbG-PEG24-SA(10皮摩爾、830ng/孔)綴合物在定軌搖床上室溫培育45分鐘。除去上清液，并通過用0.4mL ELISA試劑盒洗滌緩沖液清洗每個孔6次來洗掉未結合的AbG-PEG24-SA。通過加入IOOmM苦杏仁苷(Sigma-Aldrich)在5OmMMES、pH5.5中的溶液(50 μ L)并在50°C搖動培育2小時，使苦杏仁苷水解反應在ELISA板孔中進行。2小時后，將16 μ L的各水解反應體系轉移到新的96孔板中，并將其與20ηΜ如實施例2制備的親水性經銅淬滅的納米晶體(最終濃度為4ηΜ)(用PEG包覆)在IM CHES,pHI0.0 (最終濃度為200mM)的溶液(4 μ L)混合。用光學粘附膜密封該板，并在4°C用405nmLED照射激活反應體系30分鐘。檢測激活后的納米晶體熒光(405nm激發(fā)/ 625nm發(fā)射)。納米晶體的發(fā)熒光響應與IL-6濃度關系示于圖16。[0220]前面實施例舉例說明本發(fā)明的多個方面和本發(fā)明方法的實施。這些實施例并非意在提供對本發(fā)明許多不同實施方案的窮舉性描述。因此，雖然為了理解清楚已經通過舉例說明和實施例詳細地描述前面的發(fā)明，但是本領域普通技術人員將容易實現(xiàn)在不脫離下面各項和所附權利要求的精神或范圍下可以對其進行許多變化和修改。
[0221]實施方案可以符合下面編號的各項:
[0222]1.一種發(fā)熒光半導體納米晶體，包括:
[0223]熒光半導體納米晶體；和
[0224]與半導體納米晶體締合的淬滅基團，其中熒光半導體納米晶體在不存在淬滅基團下具有初始熒光強度(Ftl),發(fā)熒光半導體納米晶體具有經淬滅的熒光強度(Fq)，其中Fq /F。小于約1.0。
[0225]2.根據(jù)第I項的納米晶體，其中發(fā)熒光半導體納米晶體是基本非發(fā)射性的。
[0226]3.根據(jù)第I或2項的納米晶體，其中多于50個淬滅基團與納米晶體締合。
[0227]4.根據(jù)第1、2或3項的納米晶體，其中淬滅基團是或包括金屬源。
[0228]5.根據(jù)第1、2或3項的納米晶體，其中淬滅基團是或包括過渡或非過渡金屬離子。
[0229]6.根據(jù)第1、2或3項的納米晶體，其中淬滅基團是或包括選自Cu(I)、Cu(II)、Ag (I)、Hg (1、II)、Pb (II)、Pb (IV)、Fe (II)、Fe (III)、Co (II)、Ni (II)和 Cr (1、I1、II1、IV、V或VI)的金屬離子。
[0230]7.根據(jù)第1、2或3項的納米晶體，其中淬滅基團是或包括選自S2_、Se' F_、Cl'Br—、T、Te2-或As3—和膦酸根的陰離子；或包含硫醇或硫醇鹽基團的有機配體。
[0231]8.根據(jù)任一前項的納米晶體，還包括在半導體納米晶體表面上使得納米晶體可水分散的親水層
[0232]9.根據(jù)任一前項的納米晶體，還包括連接到半導體納米晶體或親水層上的生物分子，其中生物分子選自核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、氨基酸、多肽、蛋白質、多糖、脂質和生物素。
[0233]10.根據(jù)任一前項的納米晶體，其中納米晶體包括半導體核和設置在半導體核上的半導體外殼層。
[0234]11.一種納米晶體群，包括多個根據(jù)任一前項的發(fā)熒光半導體納米晶體。
[0235]12.—種組合物，包含:
[0236]第11項的發(fā)熒光半導體納米晶體群；和
[0237]水性或有機介質或固體載體，其中納米晶體與載體(如果存在)締合。
[0238]13.一種用于制備發(fā)熒光納米晶體的方法，包括:
[0239]a)提供包含熒光半導體納米晶體和至少一種溶劑的反應混合物；以及
[0240]b)向反應混合物中加入其量足以減小半導體納米晶體的熒光發(fā)射的淬滅基團。
[0241]14.根據(jù)第13項的方法，其中將多個淬滅基團加入反應混合物中。
[0242]15.根據(jù)第13或14項的方法，其中在加入淬滅基團后熒光發(fā)射信號減少至少50%。
[0243]16.根據(jù)第14或15項的方法，其中約10_8M至約10_3M淬滅基團存在于反應混合物中。
[0244]17.根據(jù)任一前項的方法，其中將多于50個淬滅基團/納米晶體加入反應混合物中。
[0245]18.根據(jù)任一前項的方法，其中淬滅基團是或包括金屬源。
[0246]19.根據(jù)任一前項的方法，其中淬滅基團是或包括過渡或非過渡金屬離子。
[0247]20.根據(jù)任一前項的方法，其中淬滅基團是或包括選自Cu(I)、Cu(II)、Ag(I)、Hg (I, II) >Pb(II) ,Pb(IV) ,Fe(II) ,Fe (III), Co (II) ,Ni(II)和 Cr (1、I1、II1、IV、V 或 VI)的金屬離子；或選自S2_、Se2_、F_、Cl_、Br_、r、Te2_*As3_和膦酸根的陰離子；或包含硫醇或硫醇鹽基團的有機配體。
[0248]21.根據(jù)任一前項的方法，其中熒光半導體納米晶體是可水分散的。
[0249]22.根據(jù)任一前項的方法，還包括在加入淬滅基團后用使得納米晶體可水分散的親水性化合物處理半導體納米晶體。
[0250]23.根據(jù)任一前項的方法，還包括將有機分子(例如生物分子)附著到納米晶體上。
[0251]24.一種根據(jù)任一前項的方法制備的發(fā)熒光納米晶體群。
[0252]25.一種激活發(fā)熒光半導體納米晶體的方法，包括:
[0253]a)提供根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光半導體納米晶體；
[0254]b)使納米晶體與活化劑接觸，其中發(fā)熒光半導體納米晶體在與活化劑接觸后的熒光強度增加。
[0255]26.根據(jù)第25項的方法，其中納米晶體在與活化劑接觸后具有經激活的熒光強度(Fa)，其中Fa / Fq大于I。
[0256]27.根據(jù)第25或26項的方法，其中Fa / Fq為10或更大。
[0257]28.根據(jù)第25、26或27項的方法，其中活化劑是還原劑、氧化劑、質子或金屬離子
結合化合物。
[0258]29.根據(jù)第25、26或27項的方法，其中活化劑選自氰化物、腈、異腈、疊氮化物、硫氰酸酯、胺、咪唑、硫醇鹽、羧酸鹽、NO、CO、鹵化物、過氧化物、ROS和氫氧化物。
[0259]30.根據(jù)第25、26或27項的方法，其中活化劑包括氰化物、異腈或腈源。
[0260]31.根據(jù)第25、26或27項的方法，其中活化劑是氰根離子、氰化物鹽或有機氰化物。
[0261]32.根據(jù)第25、26或27項的方法，還包括使納米晶體與能夠釋放異腈或氰化物基團的生氰底物接觸。
[0262]33.根據(jù)第32項的方法，還包括使底物水解以釋放氰根離子。
[0263]34.根據(jù)第32或33項的方法，其中底物是生氰酶底物。
[0264]35.根據(jù)第32、33或34項的方法，其中底物選自苦杏仁苷、野黑櫻苷、蜀黍苷、巢菜苷、亞麻苦苷、百脈根苷、氰醇、氰醇酯、氰醇酰胺、丙酮氰醇、苯乙醇腈和酰基氰化物。
[0265]36.根據(jù)第34或35項的方法，還包括使生氰底物與能夠切割生氰底物以釋放包含異腈基團或氰化物基團的化合物的生氰酶接觸。
[0266]37.根據(jù)第35或36項的方法，其中生氰酶是葡糖苷酶。
[0267]38.根據(jù)第35或36項的方法，其中生氰酶選自杏仁β -葡糖苷酶、苦杏仁苷酶和亞麻仁苷酶。
[0268]39.根據(jù)第34、35、36或37項的方法，還包括使生氰酶底物與裂解酶、酯酶、蛋白酶或半乳糖酶接觸。
[0269]40.根據(jù)任一前項的方法，還包括使發(fā)熒光納米晶體與金屬螯合劑接觸。
[0270]41.一種根據(jù)第25至40項中任一項的方法制備的經激活熒光納米晶體群。
[0271]42.一種檢測樣品中目標被分析物的存在的方法，包括:
[0272]a)提供能夠釋放氰化物源的生氰底物；
[0273]b)使樣品與根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光半導體納米晶體接觸，其中納米晶
體與第一結合基團締合；
[0274]c)使樣品與第二結合基團接觸，其中第二結合基團與生氰酶締合，并且第一和第二結合基團不同，其中第一和第二結合基團與被分析物(如果存在)結合；
[0275]d)使生氰酶與生氰底物接觸，由此從生氰底物釋放氰化物源；以及
[0276]e)檢測發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號的強度增加表示樣品中存在被分析物。
[0277]43.一種檢測樣品中被分析物的存在的方法，包括:
[0278]a)提供i)能夠釋放氰化物源的生氰底物，和ii)根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)突光納米晶體；
[0279]b)使樣品與結合基團和第二結合基團接觸，其中第一結合基團和第二結合基團不同，第一和第二結合基團與被分析物(如果存在)結合，其中第一結合基團與生氰酶締合；
[0280]c)使生氰酶與生氰底物接觸以在納米晶體存在下釋放氰化物源；以及
[0281]d)檢測發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號的強度增加表示樣品中存在被分析物。
[0282]44.根據(jù)第43項的方法，其中第一結合基團與第三結合基團締合，第三結合基團與生氰酶締合。
[0283]45.一種檢測樣品中被分析物的存在的方法，包括:
[0284]a)提供固體載體，其中載體與第一結合基團和生氰酶締合；
[0285]b)使固體載體與樣品和第二結合基團接觸，其中第一和第二結合基團與被分析物(如果存在)結合，第二結合基團與根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光半導體納米晶體締合，并且其中第一和第二結合基團不同；
[0286]c)使生氰酶與生氰底物接觸以釋放氰化物源；以及
[0287]d)檢測發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號的強度增加表示樣品中存在被分析物。
[0288]46.根據(jù)第42至45項中任一項的方法，其中第一和/或第二結合基團選自抗體、寡核苷酸、適配體和化學結合基團(例如聚合物、金屬配體、蛋白質結合化學物質、活性探針)。
[0289]47.根據(jù)第42至45項中任一項的方法，其中第一結合基團與固體載體締合，所述方法任選還包括在加入生氰底物之前洗滌固體載體。
[0290]48.根據(jù)第42至45項中任一項的方法，其中被分析物是生物分子、細胞或小的無機或有機分子。
[0291]49.一種檢測樣品中核酸的存在的方法，包括:
[0292]a)使樣品與根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光半導體納米晶體接觸，其中納米晶體與具有已知序列的第一核酸締合；
[0293]b)使樣品與具有已知序列的第二核酸接觸，其中第二核酸與生氰酶締合；
[0294]c)使生氰酶與生氰底物接觸，由此從生氰底物釋放氰化物源(例如氰根離子或異腈基團)；以及
[0295]e)檢測發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號的強度增加表示存在具有能夠與第一和第二核酸鏈雜交的序列的核酸鏈。
[0296]50.一種發(fā)突光測定體系,包括:
[0297]a)根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光半導體納米晶體，其中納米晶體與第一結合
基團締合；
[0298]b)與第二結合基團締合的生氰酶，其中第二結合基團不同于結合基團，并且其中第一和第二結合基團與被分析物締合；和
[0299]c)在與生氰酶接觸后能夠釋放氰化物源(例如氰根離子或異腈基團)的生氰底物。
[0300]51.根據(jù)第50項的測定體系，其中生氰酶和/或第二結合基團與固體載體締合。
[0301]52.一種激活半導體納米晶體的方法，包括:
[0302]a)提供至少一種根據(jù)第I至10項中任一項的熒光半導體納米晶體或發(fā)熒光納米晶體；
[0303]b)使半導體納米晶體與化合物接觸以調節(jié)納米晶體的至少一種光學性質；以及
[0304]c)確定納米晶體的位置。
[0305]53.根據(jù)第52項的方法，其中所確定的第一納米晶體和第二納米晶體的位置的準確度小于第一和/或第二納米晶體所發(fā)射的光的波長。
[0306]54.一種檢測樣品中氰根離子的方法，包括:
[0307]a)提供樣品；
[0308]b)使樣品與根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光半導體納米晶體接觸，其中淬滅基團能夠與氰離子絡合；以及
[0309]c)檢測納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號的強度增加表示樣品中存在氰根離子。
[0310]55.一種增強半導體納米晶體的亮度的方法，包括:
[0311]a)提供熒光半導體納米晶體；以及
[0312]b)使納米晶體與活化劑接觸，以使納米晶體群的熒光發(fā)射強度增加至少10%。
[0313]56.根據(jù)第55項的方法，其中活化劑包括氰化物源。
[0314]57.一種將化合物附著到半導體納米晶體上的方法，包括:
[0315]a)接觸包含炔反應性基團或疊氮化物反應性基團的熒光半導體納米晶體；
[0316]b)使納米晶體與包含能夠在Cu⑴或Cu(II)離子存在下與化合物的炔反應性基團或疊氮化物反應性基團反應的基團的反應性材料接觸；以及
[0317]c)使納米晶體與活化劑接觸，其中納米晶體在與活化劑接觸后的熒光發(fā)射強度增加。
[0318]58.—種試劑盒，包括:
[0319]a)根據(jù)第24項的發(fā)熒光納米晶體群；和[0320]b)活化劑。
[0321]59.—種試劑盒，包括:
[0322]a)根據(jù)第24項的發(fā)熒光納米晶體群；
[0323]b)生氰酶；和
[0324]b)生氰底物。
[0325]60.—種試劑盒，包括:
[0326]a)熒光納米晶體群；
[0327]b)銅源；
[0328]c)生氰酶；和
[0329]d)生氰底物。
[0330]61.—種試劑盒，包括；
[0331]a)熒光半導體納米晶體群，其中群中每個半導體納米晶體包含炔反應性基團或疊氮化物反應性基團；
[0332]b)銅源；和
[0333]c)至少一種活化劑。
[0334]62.一種鑒定樣品中細胞或細胞組分的方法，包括:
[0335]a)使樣品中的細胞或細胞組分與根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光半導體納米晶體在其中納米晶體被輸送通過細胞膜的條件下接觸以提供經標記的細胞或細胞組分；
[0336]b)將經標記的細胞或細胞組分暴露于激發(fā)能量源以激活半導體納米晶體，使得經激活的納米晶體具有熒光強度(FA)，其中FA/FQ大于I ;和
[0337]c)檢測經激活的納米晶體的熒光發(fā)射，由此鑒別樣品中的細胞或細胞組分。
[0338]63.一種鑒別細胞混合群中的細胞的方法，包括:
[0339]a)使第一細胞與根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光半導體納米晶體在其中納米晶體與細胞締合的條件下接觸以提供第一經標記的細胞；
[0340]b)使第一經標記的細胞與和第一細胞不同的第二細胞混合以形成細胞混合群；
[0341]c)培養(yǎng)細胞混合群；
[0342]d)將經標記的細胞暴露于激發(fā)能量源以激活半導體納米晶體，使得經激活的納米晶體具有熒光強度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;以及
[0343]e)檢測經激活的納米晶體的熒光發(fā)射，由此鑒別細胞混合群中的第一經標記的細胞。
[0344]64.根據(jù)第62或63項的方法，其中細胞是哺乳動物或酵母細胞。
[0345]65.根據(jù)第62、63或64項的方法，其中細胞是活細胞。
[0346]66.根據(jù)第62、63、64或65項的方法，還包括在將經標記的細胞或細胞組分暴露于激發(fā)能量源之前或過程中使經標記的細胞或細胞組分與活化劑接觸。
[0347]67.一種用于檢測發(fā)熒光納米晶體的方法，包括:
[0348]a)將根據(jù)第I至10項中任一項的發(fā)熒光納米晶體置于光子晶體傳感器的表面上；
[0349]b)用光照射光子晶體傳感器，由此使傳感器表現(xiàn)出引出共振模式，該模式所具有的光譜與發(fā)熒光納米晶體的發(fā)射光譜至少部分重疊，其中照射和引出共振模式激活發(fā)熒光納米晶體，使得經激活的納米晶體具有熒光強度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;和
[0350]c)檢測經激活的納米晶體的發(fā)射光，由此檢測發(fā)熒光納米晶體。
[0351]68.根據(jù)第70項的方法，還包括使發(fā)熒光納米晶體與活化劑接觸，由此提高激活速率和/或熒光強度。
[0352]69.根據(jù)任一前項的方法或試劑盒，其中活化劑是聚合物或蛋白質。
[0353]70.根據(jù)任一前項的方法或試劑盒，其中活化劑是胎牛血清、牛血清白蛋白、酪蛋白、山羊血清或魚血清。
[0354]71.根據(jù)任一前項的方法或試劑盒，其中活化劑是聚乙烯亞胺、多肽、聚乙二醇或聚丙烯酸或其衍生物。
[0355]72.根據(jù)任一前項的方法或試劑盒，其中活化劑是還原劑、氧化劑、質子或金屬離子結合化合物。
[0356]73.根據(jù)任一前項的方法或試劑盒，其中活化劑選自氰化物、腈、異腈、疊氮化物、硫氰酸酯、胺、咪唑、硫醇鹽、羧酸鹽、NO、CO、鹵化物、過氧化物、ROS和氫氧化物.[0357]74.根據(jù)任一前項的方法或試劑盒，其中活化劑包括氰化物、異腈或腈源。
[0358]75.根據(jù)任一前項的方法或試劑盒，其中活化劑是氰根離子、氰化物鹽或有機氰化物。
[0359]76.根據(jù)任一前項的發(fā)熒光半導體納米晶體用于鑒定樣品中細胞或細胞組分的用途。
[0360]77.根據(jù)任一前項的發(fā)熒光半導體納米晶體在生物測定中或用于檢測樣品中目標被分析物的用途。
[0361]78.根據(jù)任一前項的發(fā)熒光半導體納米晶體作為氰根離子傳感器的用途。
【權利要求】
1.一種發(fā)熒光半導體納米晶體，包括: 熒光半導體納米晶體；和 與所述半導體納米晶體締合的淬滅基團，其中所述熒光半導體納米晶體在不存在所述淬滅基團下具有初始熒光強度(Ftl),所述發(fā)熒光半導體納米晶體具有經淬滅的熒光強度(Fq)，其中Fq / F。小于約1.0。
2.根據(jù)權利要求1所述的納米晶體，其中所述發(fā)熒光半導體納米晶體是基本非發(fā)射性的。
3.根據(jù)權利要求1所述的納米晶體，其中多于50個淬滅基團與所述納米晶體締合。
4.根據(jù)權利要求1所述的納米晶體，其中所述淬滅基團是或包括金屬源。
5.根據(jù)權利要求1所述的納米晶體，其中所述淬滅基團是或包括過渡或非過渡金屬離子。
6.根據(jù)權利要求1所述的納米晶體，其中所述淬滅基團是或包括選自Cu(I)、Cu(II)、Ag (I)、Hg (1、II) 、Pb (II)、Pb (IV)、Fe (II)、Fe (III)、Co (II)、Ni (II)和 Cr (1、I1、II1、IV、V或VI)的金屬離子。
7.根據(jù)權利要求1所述的納米晶體，其中所述淬滅基團是或包括選自S2_、Se2_、F_、Cl_、Br、I、Te2-或As3—和膦酸根的陰離子；或包含硫醇或硫醇鹽基團的有機配體。
8.根據(jù)權利要求1所述的納米晶體，還包括在所述半導體納米晶體表面上使得所述納米晶體可水分散的親水層。
9.根據(jù)權利要求1或9所述的納米晶體，還包括連接到所述半導體納米晶體或親水層上的生物分子，其中所述生物分子選自核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、氨基酸、多肽、蛋白質、多糖、脂質和生物素。
10.根據(jù)權利要求1所述的納米晶體，其中所述納米晶體包括半導體核和設置在所述半導體核上的半導體外殼層。
11.一種納米晶體群，包括多個根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的發(fā)熒光半導體納米晶體。
12.—種組合物，包含: 根據(jù)權利要求11所述的發(fā)熒光半導體納米晶體群；和 水性或有機介質或固體載體，其中如果存在載體，所述納米晶體與所述載體締合。
13.一種用于制備發(fā)熒光納米晶體的方法，所述方法包括: a)提供包含熒光半導體納米晶體和至少一種溶劑的反應混合物；以及 b)向所述反應混合物中加入其量足以減小所述半導體納米晶體的熒光發(fā)射的淬滅基團或多個淬滅基團。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中在加入所述淬滅基團后所述熒光發(fā)射信號減少至少50%。
15.根據(jù)權利要求13所述的方法，還包括將多于50個淬滅基團/納米晶體加入所述反應混合物中。
16.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中約10_8M至約10_3M的淬滅基團存在于所述反應混合物中。
17.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述淬滅基團是或包括金屬源。
18.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述淬滅基團是或包括過渡或非過渡金屬離子。
19.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述淬滅基團是或包括選自Cu(I)、Cu(II)、Ag (I)、Hg (1、II)、Pb (II)、Pb (IV)、Fe (II)、Fe (III)、Co (II)、Ni (II)和 Cr (1、I1、II1、IV、V或VI)的金屬離子；或選自S2_、Se2-、F_、Cl' Br' I-、Te2_或As3_和膦酸根的陰離子；或包含硫醇或硫醇鹽基團的有機配體。
20.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述熒光半導體納米晶體是可水分散的。
21.根據(jù)權利要求13所述的方法，還包括在加入所述淬滅基團后用使得所述納米晶體可水分散的親水性化合物處理所述半導體納米晶體和/或將有機分子附著到所述納米晶體上。
22.一種根 據(jù)權利要求13至21中任一項所述的方法制備的發(fā)熒光納米晶體群。
23.一種激活發(fā)熒光半導體納米晶體的方法，所述方法包括: a)提供根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的發(fā)熒光半導體納米晶體； b)使所述納米晶體與活化劑接觸，其中所述發(fā)熒光半導體納米晶體在與所述活化劑接觸后的熒光強度增加。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述納米晶體在與所述活化劑接觸后具有經激活的熒光強度(Fa)，其中Fa / Fq大于I。
25.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中Fa/ Fq為10或更大。
26.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述活化劑是還原劑、氧化劑、質子或金屬離子結合化合物。
27.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述活化劑選自氰化物、腈、異腈、疊氮化物、硫氰酸酯、胺、咪唑、硫醇鹽、羧酸鹽、NO、CO、鹵化物、過氧化物、ROS和氫氧化物。
28.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述活化劑包括氰化物、異腈或腈源。
29.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述活化劑是氰根離子、氰化物鹽或有機氰化物。
30.根據(jù)權利要求23所述的方法，還包括使所述納米晶體與能夠釋放異腈或氰化物基團的生氰底物接觸。
31.根據(jù)權利要求30所述的方法，其中所述底物是生氰酶底物。
32.根據(jù)權利要求30所述的方法，其中所述底物選自苦杏仁苷、野黑櫻苷、蜀黍苷、巢菜苷、亞麻苦苷、百脈根苷、氰醇、氰醇酯、氰醇酰胺、丙酮氰醇、苯乙醇腈和酰基氰化物。
33.根據(jù)權利要求30或31所述的方法，還包括使所述生氰底物與能夠切割所述生氰底物以釋放包含異腈基團或氰化物基團的化合物的生氰酶接觸。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述生氰酶是葡糖苷酶。
35.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述生氰酶選自杏仁β-葡糖苷酶、苦杏仁苷酶和亞麻仁苷酶。
36.一種根據(jù)權利要求23至35中任一項所述的方法制備的經激活的發(fā)熒光納米晶體群。
37.一種檢測樣品中目標被分析物的存在的方法，所述方法包括: a)提供能夠釋放氰化物源的生氰底物；b)使所述樣品與根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的發(fā)熒光半導體納米晶體接觸，其中所述納米晶體與第一結合基團締合； c)使所述樣品與第二結合基團接觸，其中所述第二結合基團與生氰酶締合，并且所述第一和第二結合基團不同，其中如果存在被分析物，所述第一和第二結合基團與所述被分析物結合； d)使所述生氰酶與所述生氰底物接觸，由此從所述生氰底物釋放氰化物源；以及 e)檢測所述發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中熒光發(fā)射信號強度的增加表示所述樣品中存在所述被分析物。
38.一種檢測樣品中被分析物的存在的方法，所述方法包括: a)提供i)能夠釋放氰化物源的生氰底物，和ii)根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的發(fā)突光納米晶體； b)使所述樣品與結合基團和第二結合基團接觸，其中所述第一結合基團和所述第二結合基團不同，其中如果存在被分析物，所述第一和第二結合基團與所述被分析物結合，其中所述第一結合基團與生氰酶締合； c)使所述生氰酶與所述生氰底物接觸以在所述納米晶體存在下釋放所述氰化物源；以及 d)檢測所述發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中所述熒光發(fā)射信號強度的增加表示所述樣品中存在所述被分析物。
39.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中所述第一結合基團與第三結合基團締合，所述第三結合基團與所述生氰酶締合。
40.一種檢測樣品中被分析物的存在的方法，所述方法包括: a)提供固體載體，其中所述載體與第一結合基團和生氰酶締合； b)使所述固體載體與所述樣品和第二結合基團接觸，其中如果存在被分析物，所述第一和第二結合基團與所述被分析物結合，其中所述第二結合基團與根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的發(fā)熒光半導體納米晶體締合，并且其中所述第一和第二結合基團不同； c)使所述生氰酶與生氰底物接觸以釋放氰化物源；以及 d)檢測所述發(fā)熒光半導體納米晶體的熒光發(fā)射，其中所述熒光發(fā)射信號強度的增加表示所述樣品中存在所述被分析物。
41.一種發(fā)突光測定體系,包括: a)根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的發(fā)熒光半導體納米晶體，其中所述納米晶體與第一結合基團締合； b)與第二結合基團締合的生氰酶，其中所述第二結合基團不同于所述結合基團，并且其中所述第一和第二結合基團與被分析物締合；和 c)在與所述生氰酶接觸后能夠釋放氰化物源的生氰底物。
42.根據(jù)權利要求41所述的測定體系，其中所述生氰酶和/或所述第二結合基團與固體載體締合。
43.一種激活半導體納米晶體的方法，所述方法包括: a)提供至少一種根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的熒光半導體納米晶體或發(fā)熒光納米晶體；b)使所述熒光或發(fā)熒光半導體納米晶體與化合物接觸以調節(jié)所述納米晶體的至少一種光學性質；以及 C)確定所述納米晶體的位置。
44.根據(jù)權利要求43所述的方法，其中所確定的第一納米晶體和第二納米晶體的位置的準確度小于第一和/或第二納米晶體所發(fā)射的光的波長。
45.一種將化合物附著到半導體納米晶體上的方法，所述方法包括: a)接觸包含炔反應性基團或疊氮化物反應性基團的熒光半導體納米晶體； b)使所述納米晶體與包含能夠在Cu(I)或Cu(II)離子存在下與所述化合物的炔反應性基團或疊氮化物反應性基團反應的基團的反應性材料接觸；以及 c)使所述納米晶體與活化劑接觸，其中所述納米晶體在與所述活化劑接觸后的熒光發(fā)射強度增加。
46.一種試劑盒,包括: a)根據(jù)權利要求11所述的發(fā)熒光納米晶體群；和 b)活化劑。
47.—種試劑盒,包括； a)熒光半導體納米晶體群，其中所述群中每個半導體納米晶體包含炔反應性基團或疊氮化物反應性基團； b)銅源；和 c)至少一種活化劑。
48.一種鑒定樣品中細胞或細胞組分的方法，所述方法包括: a)使所述樣品中的細胞或細胞組分與根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的發(fā)熒光半導體納米晶體在其中所述納米晶體被輸送通過細胞膜的條件下接觸以提供經標記的細胞或細胞組分； b)將所述經標記的細胞或細胞組分暴露于激發(fā)能量源以激活所述半導體納米晶體，使得經激活的納米晶體具有熒光強度(Fa)，其中Fa/Fq大于I ;和 c)檢測所述經激活的納米晶體的熒光發(fā)射，由此鑒別所述樣品中的細胞或細胞組分。
49.一種鑒別細胞混合群中的細胞的方法，所述方法包括: a)使第一細胞與根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的發(fā)熒光半導體納米晶體在其中所述納米晶體與所述細胞締合的條件下接觸以提供第一經標記的細胞； b)使所述第一經標記的細胞與和所述第一細胞不同的第二細胞混合以形成所述細胞混合群； c)培養(yǎng)所述細胞混合群； d)將所述經標記的細胞暴露于激發(fā)能量源以激活所述半導體納米晶體，使得經激活的納米晶體具有熒光強度(Fa)，其中Fa / Fq大于I ;以及 e)檢測所述經激活的納米晶體的熒光發(fā)射，由此鑒別所述細胞混合群中的所述第一經標記的細胞。
50.根據(jù)權利要求48或49所述的方法，其中所述細胞是哺乳動物或酵母細胞。
51.根據(jù)權利要求48或49所述的方法，其中所述細胞是活細胞。
52.根據(jù)權利要求48或49所述的方法，還包括在將所述經標記的細胞或細胞組分暴露于所述激發(fā)能量源之前或過程中使所述經標記的細胞或細胞組分與活化劑接觸。
53.根據(jù)權利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根據(jù)權利要求41所述的測定，或根據(jù)權利要求46所述的試劑盒，其中所述活化劑是聚合物或蛋白質。
54.根據(jù)權利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根據(jù)權利要求41所述的測定，或根據(jù)權利要求46所述的試劑盒，其中所述活化劑是胎牛血清、牛血清白蛋白、酪蛋白、山羊血清或魚血清。
55.根據(jù)權利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根據(jù)權利要求41所述的測定，或根據(jù)權利要求46所述的試劑盒，其中所述活化劑是聚乙烯亞胺、多肽、聚乙二醇或聚丙烯酸或其衍生物。
56.根據(jù)權利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根據(jù)權利要求41所述的測定，或根據(jù)權利要求46所述的試劑盒，其中所述活化劑是還原劑、氧化劑、質子或金屬離子結合化合物。
57.根據(jù)權利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根據(jù)權利要求41所述的測定，或根據(jù)權利要求46所述的試劑盒，其中所述活化劑選自氰化物、腈、異腈、疊氮化物、硫氰酸酯、胺、咪唑、硫醇鹽、羧酸鹽、NO、CO、鹵化物、過氧化物、ROS和氫氧化物。
58.根據(jù)權利 要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根據(jù)權利要求41所述的測定，或根據(jù)權利要求46所述的試劑盒，其中所述活化劑包括氰化物、異腈或腈源。
59.根據(jù)權利要求23、37、38、40、48或49所述的方法，或根據(jù)權利要求41所述的測定，或根據(jù)權利要求46所述的試劑盒，其中所述活化劑是氰根離子、氰化物鹽或有機氰化物。
【文檔編號】G01N33/569GK103765215SQ201280028024
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年6月7日 優(yōu)先權日:2011年6月7日
【發(fā)明者】E.韋爾奇, D.布相, M.伊納蒂烏斯, L.格林菲爾德 申請人:生命科技公司