專利名稱：一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒。
背景技術(shù)：
α1-酸性糖蛋白，分子量約40000，是一種非特異性急性時相反應(yīng)蛋白，也是人類血清中含糖量最多(含糖約45%)、酸性最強(PI為2.7 3.5)的糖蛋白。α1-酸性糖蛋白主要由肝臟巨噬細胞和粒細胞產(chǎn)生，癌細胞也可合成。α1-酸性糖蛋白是目前較為敏感的急性期反應(yīng)的炎癥標(biāo)志物，是急性時相反應(yīng)物之一。其對炎癥、感染反應(yīng)早于體溫及白細胞數(shù)的變化，故廣泛用于臨床:(1) α -酸性糖蛋白含量升高:病理情況下，白介素I刺激吞噬細胞釋放出脂多聚糖，可促進α1-酸性糖蛋白的合成使血中水平升高，故α1-酸性糖蛋白是一種最穩(wěn)定的早期呈陽性的急性時相反應(yīng)物。如感染(炎癥)、外傷、燒傷、手術(shù)、急性心肌梗死時α1-酸性糖蛋白含量升高。另外類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克隆病、惡性腫瘤也增高，在癌轉(zhuǎn)移時升高更明顯。(2)α1-酸性糖蛋白濃度降低:肝細胞病變晚期、腎病綜合癥或其他原因所致尿中濾過的蛋白質(zhì)量丟失、遺傳因素和營養(yǎng)不良等疾病?，F(xiàn)有技術(shù)中常用的α1-酸性糖蛋白檢測方法是放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫法。這些技術(shù)存在諸多不足，如需要特殊的設(shè)備，樣本需要預(yù)處理，不能上全自動生化分析儀進行批量檢測分析等。放射免疫分析存在放射線輻射和污染等問題。酶聯(lián)免疫法應(yīng)用比較普遍，但該方法為非均相免疫檢測系統(tǒng)，測定過程較為繁瑣，耗時長，缺少單位測試運行時間；自動化程度不高，批間差和 重復(fù)性相對較大；需要配備多種專門設(shè)備，一定程度上增加了成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其操作簡單、重復(fù)性好、可進行批量樣本全自動化檢測，從而消除上述背景技術(shù)中缺陷。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，該試劑盒包括試劑R1、試劑R2和校準(zhǔn)品，其中:試劑Rl包含緩沖液10 500mM、表面活性劑0.5 50g/L、電解質(zhì)5 50g/L、高分子促進劑2 100g/L、穩(wěn)定劑5 50g/L、防腐劑I 10g/L ；試劑R2包含緩沖液10 500mM、抗人α1-酸性糖蛋白抗體15% 30% (w/v)、電解質(zhì)5 50g/L、防腐劑I 10g/L ；校準(zhǔn)品包含緩沖液10 500mM、α1-酸性糖蛋白抗原、穩(wěn)定劑5 50g/L、防腐劑I 10g/L、抗氧化劑0.01 10g/Lo
上述緩沖液10 500mM，也就是濃度為10 500mmo 1/L。抗人α1-酸性糖蛋白抗體15% 30% (w/v),也就是濃度為150 300g/L。其中，所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、TRIS緩沖液、CAPS0、M0PS、硼酸鹽緩沖液、Hepes緩沖液中的一種或幾種；緩沖液的pH范圍是5.5 9.0 ;所述表面活性劑選自Triton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯燒基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚一種或幾種；所述電解質(zhì)選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂一種或幾種；所述高分子促進劑選自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羥丙基甲基纖維素、羥甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉中的一種或幾種；所述穩(wěn)定劑選自甘露糖、葡萄糖、殼聚糖、山梨醇、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二鈉、果糖中的一種或幾種；所述防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸鈉中的一種或幾種；所述抗人α1-酸性糖蛋白抗體選自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、雞抗人、鴨抗人α1-酸性糖蛋白抗體中的一種或兩種；所述抗人α1-酸性糖蛋白抗體種類包括單克隆抗體和多克隆抗體；所述抗氧化劑選自丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、沒食子酸丙酯、特丁基對苯二酚、維生素系列中的一種或幾種。為了保證試劑R1、試劑R2的緩沖體系一致，作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述試劑Rl和試劑R2的緩沖液種類相同。作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述試劑盒中，試劑Rl 包含 pH 為 7.0 8.0 的 TRIS 緩沖液 10 50mM、Tween200.5 5g/L、氯化鈉5 15g/L、乙二醇聚氧乙烯醚50 100g/L、乙二胺四乙酸二鈉5 10g/L、疊氮鈉I 5g/L ；試劑R2包括包含pH為7.0 8.0的TRIS緩沖液10 50mM、羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗體15% 30% (w/v)、電解質(zhì)5 50g/L、防腐劑I 10g/L ；校準(zhǔn)品包括TRIS緩沖液10 500mM、α1-酸性糖蛋白抗原0.05 5.0g/L、乙二胺四乙酸二鈉5 50g/L、疊氮鈉I 10g/L、丁基輕基茴香醚0.01 10g/L。上述羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗體15% 30%(w/v)，也就是羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗體的濃度為150 300g/L。其中，所述校準(zhǔn)品中，α1-酸性糖蛋白抗原濃度優(yōu)選0.1 3.0g/L。所述校準(zhǔn)品可以制備成高濃度單點校準(zhǔn)品，在使用時用生理鹽水稀釋成6個不同濃度的參考校準(zhǔn)品，也可以直接制備成6個不同濃度的參考校準(zhǔn)品。本發(fā)明的免疫比濁法是抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定方法，其基本原理是:樣本中的α1-酸性糖蛋白抗原和試劑R2中的α1-酸性糖蛋白抗體發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，形成不溶性的抗原-抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液產(chǎn)生一定的濁度。反應(yīng)液中α1-酸性糖蛋白抗體過量時，形成的免疫復(fù)合物的量隨著樣本中α1-酸性糖蛋白抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也相應(yīng)增加。在特定波長下測定該復(fù)合物的吸光值，與校準(zhǔn)品標(biāo)定的校準(zhǔn)曲線比較，即可計算出樣本中的α1-酸性糖蛋白的含量。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明檢測試劑，使用操作簡單，可以應(yīng)用于多種機型的全自動生化分析儀和半自動生化分析儀，能夠滿足臨床快速、高通量檢測樣本的要求；重復(fù)性實驗表明試劑盒具有高精密度、準(zhǔn)確度高的特點；與進口試劑對比實驗表明本發(fā)明試劑盒相關(guān)性好，線性好，重復(fù)性高；試劑盒由于使用了篩選的最優(yōu)化試劑組合，使得試劑的穩(wěn)定性大大提高，2-8° C可以穩(wěn)定存放一年以上。因此本發(fā)明試劑盒具有很高的臨床應(yīng)用價值。


圖1為本發(fā)明實施例4檢測α 1_酸性糖蛋白含量的方法流程示意圖；圖2為本發(fā)明實施例4的α1-酸性糖蛋白校準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖3為本發(fā)明實施例6的本發(fā)明試劑和進口對比試劑的相關(guān)性曲線圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。實施例11.配制試劑:
試劑Rl:TRIS (緩沖液)IOOmMTween 20 (表面活性劑)2 g/L氯化鈉(電解質(zhì))8.5 g/L乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促進劑) 40 g/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)7 g/L疊氮鈉(防腐劑)3 g/LpH 值7.5試劑R2:
羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗體20% ( w/v ) TRIS (緩沖液)40 mM 氯化鈉(電解質(zhì))B.5 g/L疊氮鈉(防腐劑)7 g/L pH 值8.0校準(zhǔn)品:
CAPSO (緩沖液)50mM乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)7g/L疊氮鈉(防腐劑)6g/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)0.6 g/L按照需要的校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)量的α1-酸性糖蛋白抗原添加到上述溶液中，制備得到α1-酸性糖蛋白校準(zhǔn)品。該校準(zhǔn)品可以是高濃度單點校準(zhǔn)品，在使用時用生理鹽水稀釋成6個不同濃度的參考校準(zhǔn)品，也可以直接制備成6個不同濃度的參考校準(zhǔn)品。本實施例配制6個不同濃度的參考校準(zhǔn)品，分別為0g/L、0.15g/L、0.31g/L、0.62g/L、l.24g/L、
2.50g/L。然后用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，放置2 8°C保存。實施例21.配制試劑:試劑Rl:
石粦酸鹽(緩沖液)10 mM 聚氧乙烯壬基苯基醚(表面活性劑)0.5 g/L 氯化鉀(電解質(zhì))5 g/L 脂脒醇聚氧乙烯醚(高分子促進劑)2 g/L 牛血清蛋白(穩(wěn)定劑)5 g/L 疊氮鈉(防腐劑)I g/L pH 值9.0試劑R2:
兔抗人α -酸性糖蛋白單克隆抗體15% (w/v ) 磷酸鹽(緩沖液)500 mM 氯化鈉(電解質(zhì))50 g/L 疊氮鈉(防腐劑)10 g/L pH 值6.0 校準(zhǔn)品:TRIS (緩沖液)200 mM
乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)50 g/L
對羥基苯甲酸(防腐劑)10 g/L
二丁基羥基甲苯(抗氧化劑)O 01 g/L
od-酸性糖蛋白抗原2.7 g/L按照需要的校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)量的α1-酸性糖蛋白抗原添加到上述溶液中，制備得到α1-酸性糖蛋白校準(zhǔn)品。本實施例選用的是高濃度單點參考校準(zhǔn)品，α1-酸性糖蛋白抗原濃度為2.7g/L，然后用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，放置2 8°C保存。使用時用生理鹽水稀釋成5個不同濃度的參考校準(zhǔn)品，其中一個未添加α1-酸性糖蛋白抗原，作為空白試劑，α1-酸性糖蛋白抗原濃度分別為 0g/L、0.17g/L、0.34g/L、0.68g/L、l.35g/L、2.70g/L0實施例31.配制試劑:試劑Rl:
TRIS (緩沖液)500 mM
Tween 20 (表面 活性劑)40 g/L
氯化鈉(電解質(zhì))20 g/L
乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促進劑) 10 g/L 乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)30 g/L
疊氮鈉(防腐劑)2 g/L
pH 值5.5試劑R2:
羊抗人Cd-酸性糖蛋白多克隆抗體30% ( w/v )
TRIS (緩沖液)10 mM
氯化鈉(電解質(zhì))5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)10 g/L
pH 值8.5校準(zhǔn)品:CAPSO (緩沖液)200 mM
乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)5 g/L
丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)8 g/L按照需要的校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)量的α1-酸性糖蛋白抗原添加到上述溶液中，制備得到α1-酸性糖蛋白校準(zhǔn)品。本實施例配制6個不同濃度的參考校準(zhǔn)品，分別為Og/L、
0.15g/L、0.31g/L、0.62g/L、l.24g/L、2.50g/L。然后用 0.22 μ m 的濾膜過濾除菌，放置 2 8°C保存。實施例41.配制試劑:試劑Rl:
TRIS (緩沖液)50 mM
Tween 20 (表面活性劑)I g/L 氯化鈉(電解質(zhì))8.5 g/L
乙二醇聚氧乙烯醚(高分子促進劑)60 g/L
乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)5 g/L
pH 值8.0試劑R2:
羊抗人α -酸性糖蛋白多克隆抗體15% ( w/v )
TRIS (緩沖液)20 _
氯化鈉(電解質(zhì))8.5 g/L
疊氮鈉(防腐劑)5 g/L
pH 值7.5校準(zhǔn)品:
TRIS (緩沖液)40 mM
乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)6 g/L
疊氮鈉(防腐劑)5 g/L
丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)0.2 g/L
α -酸性糖蛋白抗原2.7 g/L
按照需要的校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)量的α1-酸性糖蛋白抗原添加到上述溶液中，制備得到α1-酸性糖蛋白校準(zhǔn)品。該校準(zhǔn)品可以是高濃度單點校準(zhǔn)品，在使用時用生理鹽水稀釋成6個不同濃度的參考校準(zhǔn)品，也可以直接制備成6個不同濃度的參考校準(zhǔn)品。本實施例選用的是高濃度單點參考校準(zhǔn)品，α1-酸性糖蛋白抗原濃度為2.7g/L，然后用0.22μπι的濾膜過濾除菌，放置2 8°C保存。使用時用生理鹽水稀釋成5個不同濃度的參考校準(zhǔn)品，其中一個未添加α1-酸性糖蛋白抗原，作為空白試劑，α1-酸性糖蛋白抗原濃度分別為 Og/L,0.17g/L、0.34g/L、0.68g/L、l.35g/L、2.70g/L。2.檢測:a1-酸性糖蛋白檢測方法如圖1所示，分析方法為兩點終點法，具體來說:樣本加樣量為12 μ 1，試劑Rl和R2加樣量分別為225 μ I和75 μ I ；225 μ I試劑Rl加入12 μ I樣本在37°C保溫5分鐘，記錄吸光度值ODl后，加入75 μ I試劑R2，37°C繼續(xù)保溫5分鐘后記錄吸光度值0D2 ;檢測波長分別為:主波長340nm，副波長660nm。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:采用本實施例試劑及上述測定方法，使用日立7080全自動生化分析儀測得的6個不同濃度a1-酸性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。X軸代表a1-酸性糖蛋白含量，Y軸代表吸光度值。該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于檢測標(biāo)本a1-酸性糖蛋白含量。實施例5采用實施例4的檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨機取一臨床血清樣本，使用日立7080全自動生化分析儀對同一樣本重復(fù)檢測10次，檢測結(jié)果如表I所示。表I檢測樣本a1-酸性糖蛋白濃度(10次)及變異系數(shù)
濃度~~I~ 2 ~3~ 4 ~5~~6~~~8~~9~I 10 I CV (g/L) I 31 1.3 I 29 I j1 I 3j I 31 I 27 1.32 I 29 I 31 L26%結(jié)果顯示，變異系數(shù)為1.26%，同時，采用實施例1-3所述試劑盒檢測結(jié)果的變異系數(shù)小于5%，表明本發(fā)明所述試劑盒具有較高精密度。實施例6分別使用本發(fā)明試劑和進口對比試劑(羅氏試劑)，使用日立7080全自動生化分析儀對50份臨床標(biāo)本按各自參數(shù)同時進行測定，對測定值進行線性回歸。本發(fā)明試劑參數(shù)見實施例4。線性回歸得到的回歸方程為Y=1.0106X-0.05118，相關(guān)系數(shù)R2=0.9924，如圖3所示。其中X為本發(fā)明試劑，Y為對比試劑。結(jié)果表明本發(fā)明試劑與對比試劑相關(guān)性很好，說明本發(fā)明試劑具有很好的特異性和準(zhǔn)確度。本發(fā)明試劑可以適用于日立、奧林巴斯、貝克曼、
雅培等系列的全自動和半自動生化分析儀，分析方法和參數(shù)可以根據(jù)不同機型進行適當(dāng)調(diào)
M
iF.0本發(fā)明不局限于上述具體實施方式
，一切基于本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思，所作出的結(jié)構(gòu)上的改進，均落入本發(fā)明的保護范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其特征在于:所述試 劑盒包括試劑R1、試劑R2和校準(zhǔn)品，其中: 試劑Rl包含緩沖液10 500mM、表面活性劑0.5 50g/L、電解質(zhì)5 50g/L、高分子促進劑2 100g/L、穩(wěn)定劑5 50g/L、防腐劑1 10g/L ； 試劑R2包含緩沖液10 500mM、抗人α1-酸性糖蛋白抗體150 300g/L、電解質(zhì)5 50g/L、防腐劑 1 10g/L ； 校準(zhǔn)品包含緩沖液10 500mM、α1-酸性糖蛋白抗原、穩(wěn)定劑5 50g/L、防腐劑I 10g/L、抗氧化劑 0.01 10g/L。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其特征在于:所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、TRIS緩沖液、CAPSO、MOPS、硼酸鹽緩沖液、Hepes緩沖液中的一種或幾種； 所述表面活性劑選自Tr iton系列、Tween系列、月桂醚、聚氧乙烯燒基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚一種或幾種； 所述電解質(zhì)選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂一種或幾種； 所述高分子促進劑選自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羥丙基甲基纖維素、羥甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉中的一種或幾種； 所述穩(wěn)定劑選自甘露糖、葡萄糖、殼聚糖、山梨醇、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸二鈉、果糖中的一種或幾種； 所述防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸鈉中的一種或幾種； 所述抗人α1-酸性糖蛋白抗體選自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、雞抗人、鴨抗人α1-酸性糖蛋白抗體中的一種或兩種； 所述抗氧化劑選自丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂酯、沒食子酸丙酯、特丁基對苯二酚、維生素系列中的一種或幾種。
3.如權(quán)利要求2所述的一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其特征在于:所述抗人α1-酸性糖蛋白抗體種類包括單克隆抗體和多克隆抗體。
4.如權(quán)利要求2所述的一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其特征在于:所述緩沖液的pH范圍是5.5 9.0。
5.如權(quán)利要求1 4任一項所述的一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其特征在于:所述試劑Rl和試劑R2的緩沖液種類相同。
6.如權(quán)利要求5所述的一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中， 試劑Rl包含pH為7.0 8.0的TRIS緩沖液10 50mM、Tween200.5 5g/L、氯化鈉5 15g/L、乙二醇聚氧乙烯醚50 100g/L、乙二胺四乙酸二鈉5 10g/L、疊氮鈉I 5g/L ； 試劑R2包括包含pH為7.0 8.0的TRIS緩沖液10 50mM、羊抗人α1-酸性糖蛋白多克隆抗體150 300g/L、電解質(zhì)5 50g/L、防腐劑I 10g/L ;校準(zhǔn)品包括TRI S緩沖液10 500mM、α1-酸性糖蛋白抗原0.05 5.0g/L、乙二胺四乙酸二鈉5 50g/L、疊氮鈉I 10g/L、丁基輕基茴香醚0.01 10g/Lo
7.如權(quán)利要求6所述的一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其特征在于:所述校準(zhǔn)品中，α1-酸性糖蛋 白抗原濃度為0.1 3.0g/L。
全文摘要
一種用免疫透射比濁法檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒，其試劑R1包含緩沖液10～500mM、表面活性劑0.5～50g/L、電解質(zhì)5～50g/L、高分子促進劑2～100g/L、穩(wěn)定劑5～50g/L、防腐劑1～10g/L；試劑R2包含緩沖液10～500mM、抗人α1-酸性糖蛋白抗體150～300g/L、電解質(zhì)5～50g/L、防腐劑1～10g/L；校準(zhǔn)品包含緩沖液10～500mM、α1-酸性糖蛋白抗原、穩(wěn)定劑5～50g/L、防腐劑1～10g/L、抗氧化劑0.01～10g/L。本發(fā)明使用簡便快速，能夠滿足臨床快速高通量檢測樣本的要求，檢測效率明顯提高，試劑穩(wěn)定，適合臨床推廣。
文檔編號G01N21/31GK103076456SQ201210576629
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者宿明明, 王慶國, 王愛龍 申請人:濰坊三維生物工程集團有限公司