專利名稱：用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，涉及一種檢測特定核酸、蛋白質、病原體和細胞的多孔微量反應板。
背景技術：
近年來，由于納米顆粒的有序陣列排布技術飛速發(fā)展，銀或金納米島的二維生物基底片的制備工藝迅速提高和成熟?；谶@類基底片的表面增強拉曼散射光譜檢測技術(SERS)以及表面增強熒光檢測技術的靈敏度和穩(wěn)定性也因此得到大幅度的提高，其理論檢測下限已經達到單分子和單細胞的檢測水平，因此極大地刺激了它們在醫(yī)學檢測和診斷領域的應用性研究。與目前使用的DNA、蛋白質和細胞檢測技術相結合后，這些物理學方法將有望成為高度特異、高度靈敏、多指標高通量、可定性和定量的新一代生物醫(yī)學檢測系統(tǒng)，從而替代或改進目前廣泛使用的DNA、蛋白質和細胞檢測方法，將對腫瘤、感染等多類疾病的臨床早期診斷帶來革命性影響。與目前常用來檢測DNA、蛋白質和細胞的聚合酶鏈反應、酶標記、熒光標記、化學發(fā)光標記、量子點標記以及放射標記等技術相比，基于二維銀生物納米基片的拉曼分子標記的SERS技術具有如下明顯優(yōu)勢(I)能將拉曼信號倍增IO6-1O14,從而達到單分子的檢測靈敏度，如果檢測人體體液或組織切片中稀有細胞的胞內或胞膜分子，則能達到單細胞的檢測水平；(2)拉曼光譜的激發(fā)波遠窄于熒光和化學光(<2nm)，因此在進行多種拉曼分子標記和多指標檢測時光譜干擾現象大為減弱，從而使結果判斷更加特異，使真正的多指標分析和高通量檢測成為可能；(3)拉曼信號不會發(fā)生熒光特有的淬滅現象，；(4)有多種多樣的可產生穩(wěn)定拉曼光譜的拉曼標記分子可供選擇，種類遠多于熒光蛋白；(5)只需單波長激發(fā)光即可檢測很多種拉曼標記分子的拉曼光譜；(6)拉曼光譜能很容易地與生物標本的自發(fā)背景熒光相區(qū)別?；谶@些優(yōu)點，近幾年來SERS在生物醫(yī)學檢測中的應用研究日益增多。在DNA和RNA檢測方面，用DNA探針固相化銀生物納米基片，同時用拉曼分子標記金或銀納米顆粒進行三明治夾心檢測靶向DNA片段是常用方法。Yunwei Cao用DNA探針固相玻片，Cy3標記寡核苷酸鏈，并用銀液增染玻片，到達20fM的DNA檢測下限。Ho Pui Ho利用銀納米島基片和金納米顆粒將DNA檢測下限進一步降為O. 4fM。Lan Sun報道了一種PCR-free的定量檢測多種RNA目的片段的SERS三明治法，在腫瘤細胞裂解液中檢測到2. 3pM的多種目的mRNA片段。這一結果真正提示了 SERS技術替代real-time PCR法定量檢測核酸的潛力。在蛋白質檢測方面，拉曼分子和蛋白探針(抗體)共標記金屬納米顆粒(如銀核金殼、銀核硅殼等)。目前已被報道的檢測下限有高有低，在l-100fg/ml范圍之內。在細胞檢測方面，血液中的循環(huán)腫瘤細胞、抗原特異性T細胞以及干細胞等的頻率都遠低于O. 1%，目前最先進的檢測方式是熒光染色加流式細胞儀分析。然而，當稀有靶細胞的頻率低于O. 1%時，流式細胞分析就不夠準確了，因此近年來人們開始探討用SERS技術檢測人體中的稀有細胞。MichadY.Sha利用自制的SERS檢測裝置對外周全血中的循環(huán)腫瘤細胞建立了 SERS—步檢測法，檢測下限達到10-50cellS/ml全血，從而可以有效提高臨床對腫瘤轉移的早期診斷率。這一檢測靈敏度提示了 SERS技術在檢測醫(yī)學稀有細胞領域中的巨大應用潛力。盡管應用前景很好，但是目前SERS技術在生物醫(yī)學領域中的應用仍處于模型研究階段，還未進入真實的臨床應用領域，主要原因有已商業(yè)化的納米生物基片較少。在物理制作工藝上，缺乏具有高度靈敏性和高度均一性的高質量生物納米基片，因此不少實驗室正加緊致力于基片制作工藝的提升；在醫(yī)學檢測上，缺乏與生物醫(yī)學領域專家的緊密合作，更缺乏與生物醫(yī)學檢測實驗室的大批量標本處理相配套的SERS檢測平臺。迄今為止，未見有將SERS檢測所用的生物納米基片與生物醫(yī)學檢測中常用的多孔微量反應板相結合的實驗報道，也未見本實用新型發(fā)明方案的知識產權情況。在擁有粗糙金屬表面的金\銀生物納米基片上，利用拉曼活性分子標記技術和表面增強拉曼散射光譜技術對特定的生物分子和生物細胞進行痕量檢測甚至單分子\單細胞檢測是一種正處于探索和快速發(fā)展階段的新一代生物檢測技術，還未真正進入生物醫(yī)學的廣泛應用階段，也缺乏與醫(yī)學檢測實驗室的大批量標本處理相匹配的檢測反應平臺。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明提供了一種使表面增強拉曼散射光譜分析(SERS檢測)微量化和高通量化，能夠減輕實驗人員工作量的用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，可以改變目前將單塊基片粘入單個反應盒中對單份標本進行單獨操作的局面，從而有利于促進SERS檢測技術在醫(yī)學和生命科學檢測領域的實際應用。技術方案本發(fā)明的用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，包括基板、生物納米基片和微量反應孔，微量反應孔以陣列方式排列在基板上，生物納米基片加載在微量反應孔的內底上，每個生物納米基片的上表面以陣列方式排列有納米級的凸起、小孔或條紋。本發(fā)明中，微量反應孔的截面可以為圓形或等邊多邊形。本發(fā)明中，生物納米基片可以為用于表面增強拉曼散射光譜分析的生物納米基片。本發(fā)明中，生物納米基片可以是直接以微量反應孔的孔底表面為界面，有序排布金銀納米顆粒而制成的。本發(fā)明以目前在醫(yī)學和生命科學檢測領域廣泛用于酶聯免疫反應檢測的多孔微量反應板為平臺，在其孔底加載擁有粗糙金銀表面特征的生物納米基片，或者直接在微量反應孔的底面有序排布金銀納米顆粒而制成納米基底孔。以本發(fā)明的用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板為標本的批量檢測平臺，利用各種拉曼活性分子標記技術和表面增強拉曼散射光譜技術(或表面增強熒光檢測技術)高度特異地、高度靈敏地檢測特定的核酸分子、蛋白質分子、病原體、血細胞和組織細胞等。有益效果本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)點(I)本發(fā)明提供了一種用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，使以金屬生物納米基片為反應界面的SERS檢測能夠做到標本用量的微量化和多標本同步檢測的高通量化，適用于生物醫(yī)學檢測實驗室對大批量標本的處理，能極大地降低實驗操作的工作量。本發(fā)明將能改變目前將單塊基片粘入單個反應盒中對單份標本進行單獨操作的局面，從而可以促進SERS檢測技術在醫(yī)學和生命科學檢測領域的實際應用。(2)本發(fā)明適用于利用SERS檢測技術對各種核酸分子、蛋白質分子、病原體、腫瘤細胞或其他靶細胞進行高度特異、高度靈敏、多標本的批量化檢測。應用范圍遍及醫(yī)學和生命科學的各個檢測領域，有著廣泛的應用前景。本發(fā)明通過納米微陣列排布技術制備而成的生物基片擁有粗糙的金屬表面，拉曼活性分子在其表面的特征性拉曼光譜能有效增強106—14，以此納米基片為反應界面的拉曼活性分子標記技術則可以用來痕量檢測甚至單分子/單細胞檢測特定的生物分子(如蛋白、核酸等)和生物細胞(如病原體、腫瘤細胞等)，此即目前正處于探索和快速發(fā)展階段的SERS檢測技術，在生命科學和醫(yī)學科學的檢測和診斷領域有著廣闊的應用前景；以此SERS多孔微量反應板為實驗平臺則可以使標本的檢測微量化和批量化，從而大大減少實驗操作·的工作量。


圖1為用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板的結構示意圖。圖2為生物納米基片的表面結構剖視圖。圖中有基板1、生物納米基片2、微量反應孔3、小孔21、凸起22、條紋23。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。本發(fā)明的用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，包括基板1、生物納米基片2和微量反應孔3，微量反應孔3以陣列方式排列在基板I上，生物納米基片2加載在微量反應孔3的內底上，每個生物納米基片2的上表面以陣列方式排列有納米級的小孔21、凸起22或條紋23。本發(fā)明的一個實施例中，微量反應孔3的截面為圓形或等邊多邊形。本發(fā)明的一個實施例中，生物納米基片2為用于表面增強拉曼散射光譜分析的生物納米基片。本發(fā)明的一個實施例中，生物納米基片2是直接以微量反應孔3的孔底表面為界面，有序排布金銀納米顆粒而制成的。本發(fā)明的用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板的具體制備工藝步驟為I)選用以下形式和特征的用于酶聯免疫反應檢測的多孔微量反應板，包括用聚丙乙烯、聚氯乙烯或其他材料制成的圓形孔或多邊形孔的多孔微量反應板；每孔的容量為50 μ 1-350 μ I ;12孔/條、10孔/條、8孔/條、6孔/條等的微孔反應條板；24孔/塊、48孔/塊、96孔/塊、384孔/塊等的微孔反應板。2)利用常規(guī)的納米微陣列排布技術制備用于表面增強拉曼散射光譜分析的金屬生物納米基片，包括以玻璃片、鋁片、半導體或其他材料為載體，在其表面有序組裝金或銀納米顆粒，使該金屬表面呈二維的有序的粗糙特征，如呈微陣列方式排布的納米級凸起(island)、小孔(bottle or cavidity)或條紋等。每塊基片的面積大小和形狀被裁剪成與微量反應孔的孔徑和孔形一致。3)用化學粘附劑、硅膠等將上述SERS生物納米基片加載固定在上述微量反應孔的孔底面即成SERS多孔微量反應板。在一個實施例中，步驟2)中制備金屬納米基底孔時，可以直接以微量反應孔的孔底面為載體，利用納米微陣列排布技術在其表面有序排布金或銀納米顆粒，使該金屬表面呈二維的有序的粗糙特征，如呈微陣列方式排布的納米級凸起(i s I and )、小孔(bott I e orcavidity)或條紋等，制備呈金屬納米基底孔，即成另一種形式的SERS多孔微量反應板。在一個實施例中，制備SERS生物納米基片或納米基底孔時，在其金屬表面進行化學基團的修飾，使之能與核酸、蛋白質等生物大分子共價結合而將該生物大分子固定于其金屬表面，有利于生物檢測。下面以利用SERS銀生物納米基片對乙型肝炎病毒DNA進行痕量檢測為例，敘述本 發(fā)明的
具體實施例方式( I)制備二維結構的銀生物納米基片采用傳統(tǒng)的兩步氧化法制備高度有序的多孔氧化鋁模板將鋁箔在O. 5mol/L的草酸中以直流電壓40V進行氧化2h，溫度維持在10° C，然后浸于75° C的鉻酸(1.8wt.%)和磷酸(6wt. %)的等體積比的混合溶液中兩個小時以去除氧化層。然后在同條件下進行第二步氧化2h，得到有序的多孔氧化鋁模板。通過普通的恒流磁控濺射方法將銀濺射到多孔氧化鋁模板上獲得二維銀島膜。(2)選用醫(yī)學檢測用的96孔酶標反應板，將生物納米基片裁剪成直徑與96孔板孔徑一致的圓形基片，利用硅膠將基片平鋪于每個孔的孔底表面，待硅膠凝固后將微孔板置封口膜中抽真空封閉，保存?zhèn)溆谩?3)商業(yè)化合成乙肝病毒DNA特異性的一對DNA探針在正向探針的5’端偶聯上特定的拉曼活性分子，如熒光素6-FAM，而后HPLC純化收集探針；另外在反向DNA探針的3’端連接上巰基(-SH)，HPLC純化和收集探針。(4)將反向DNA探針固相化于銀生物納米基片表面用O. 15M Nacl-1OmM PBS(pH6. 5)稀釋反向DNA探針至I μ M，在銀生物納米基片多孔微量反應板中每孔加入20 μ I的反向DNA探針，置濕盒中室溫反應5-6h，使反向探針通過其3’端的巰基與基片上的銀結合而固定在基片表面。用O. 75MNacl-10mM PBS-0. 02%Tween20緩沖液洗漆微孔板20min,再用ddH20洗漆IOmin,再在通風櫥中抽干。(5)用MCH封閉銀生物納米基片用ddH20稀釋MCH(6-mercapto-l_hexanol)至ImM，加入多孔微量反應板中，每孔200μ 1，至室溫反應lh，然后同上用O. 75M Nacl-1OmM PBS-0. 02%Tween 20緩沖液洗滌微孔板20min,再用ddH20洗漆IOmin,再在通風櫥中抽干。(6 )血清病毒DNA提取用血清病毒DNA小量提取試劑盒提取患者血清中DNA，用O. 75M Nacl-1OmMPBS(PH7.0)稀釋保存待檢。(7)在銀生物納米基片上進行三明治式DNA雜交檢測取血清DNA樣品，950C加熱變性lOmin，然后點樣于96孔微量反應板中的基片上，每孔20 μ 1，置濕盒中37° C孵育過夜，同上用O. 75Μ Nacl-1OmM PBS-0. 02%Tween 20緩沖液洗漆微孔板20min,再用ddH20洗漆lOmin,在通風櫥中抽干。(8)用 0.75M Nacl-1OmM PBS (ρΗ7· O)稀釋 FAM 標記的正向 DNA 探針至 I μ M，加入微量反應板中的基片上，每孔20 μ 1，置濕盒中37° C孵育4-6h。(9)按以下順序洗滌多孔微量反應板用O. 75M Nacl-1OmM PBS-O. 02%Tween 20 洗板 2Omin ；用O. 75M NaNO3-1OmM PBS 洗板 2Omin ；用ddH20洗板IOmin ;置通風櫥中抽干。(10)用拉曼光譜檢測儀(如Renishaw MicroRaman system)于檢測每孔中基片 表面的拉曼散射光譜，根據6-FAM所特有的拉曼散射光譜的有無來判斷標本中有無乙肝病毒特異的 DNA。檢測條件為514nm excitation wave, 5mff power, IOseconds, Ramanrange:200-2000cm 1。
權利要求
1.一種用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，其特征在于，該反應板包括基板(I)、生物納米基片(2 )和微量反應孔(3 )，所述微量反應孔(3 )以陣列方式排列在基板(I)上，所述生物納米基片(2 )加載在微量反應孔(3 )的內底上，每個所述生物納米基片(2)的上表面以陣列方式排列有納米級的小孔(21)、凸起(22)或條紋(23)。
2.根據權利要求1所述的用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，其特征在于，所述微量反應孔(3)的截面為圓形或等邊多邊形。
3.根據權利要求1所述的用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，其特征在于，所述生物納米基片(2)為用于表面增強拉曼散射光譜分析的生物納米基片。
4.根據權利要求1所述的用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，其特征在于，所述生物納米基片(2)是直接以微量反應孔(3)的孔底表面為界面，有序排布金銀納米顆粒而制成的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于表面增強拉曼散射光譜分析的多孔微量反應板，以廣泛用于酶聯免疫反應檢測的多孔微量反應板為平臺，在其孔底加載擁有粗糙表面特征的金銀納米生物基片，或者直接在孔底表面有序排布金銀納米顆粒而制成納米基底孔。本發(fā)明的反應板不但可以使被檢標本的使用微量化，而且可以使多標本的高通量檢測在一塊板中同步完成，使操作步驟簡單方便，工作量大為減輕，將能改變目前將單塊基片粘入單塊反應盒中對單份標本進行單獨操作的局面，有利于SERS檢測技術的實際應用。
文檔編號G01N21/65GK102998297SQ201210532340
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權日2012年12月11日
發(fā)明者沈傳來, 邱騰 申請人:東南大學