專利名稱:一種人氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及使用方法、用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及ー種檢測(cè)試劑盒,具體涉及檢測(cè)待檢樣本中OxLDL含量的試劑盒。
背景技術(shù):
冠心病,冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病,其診斷主要根據(jù)為病人的典型病史、臨床癥狀,并結(jié)合儀器和生化檢查進(jìn)行。目前常用的檢查手段有常規(guī)心電圖、心電圖負(fù)荷試驗(yàn)、超聲心動(dòng)圖、螺旋CT和超高速CT、冠狀動(dòng)脈超聲顯像、血管內(nèi)超聲、核素心肌顯像和選擇性冠狀動(dòng)脈造影,以及實(shí)驗(yàn)室檢查包括心肌酶學(xué)檢查、肌鈣蛋 白、C反應(yīng)蛋白、血脂和脂蛋白檢查等。以上檢查手段中,大多數(shù)是以檢測(cè)心肌缺血或者心肌梗死后的心電信號(hào)變化(各種心電圖)和心室壁運(yùn)動(dòng)形態(tài)變化(超聲心動(dòng)圖,心臟放射性核素檢查,螺旋CT和超高速CT,磁共振成像)為基礎(chǔ)進(jìn)行冠心病的診斷,若冠狀動(dòng)脈狹窄程度尚未引致心肌缺血,以上檢測(cè)手段往往不能有助于診斷冠心病。選擇性冠狀動(dòng)脈造影可以直接了解冠狀動(dòng)脈狹窄的程度,目前被認(rèn)為是診斷冠心病的金標(biāo)準(zhǔn),但它屬于創(chuàng)傷性檢查,有一定的危險(xiǎn)性,需要住院,而且價(jià)格昂貴,對(duì)于需要行外科治療或者內(nèi)科介入治療的患者是必需的檢查,而對(duì)于輕癥冠心病患者或者懷疑有冠心病的患者,往往難以接受,需要尋找創(chuàng)傷性小的檢測(cè)方法。研究表明,氧化低密度脂蛋白OxLDL與冠心病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),通常認(rèn)為可以通過(guò)檢測(cè)待檢樣本血清中氧化低密度脂蛋白OxLDL的含量,來(lái)評(píng)估患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)?,F(xiàn)有技術(shù)中,已經(jīng)公開了ー些相關(guān)的檢測(cè)方法,如專利申請(qǐng)?zhí)?3109935. 1,發(fā)明名稱用抗磷酸膽堿抗體對(duì)氧化低密度脂蛋白的定量測(cè)定及其在診斷動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用。該發(fā)明公開的定量檢測(cè)方法包括下列步驟(a)將抗磷酸膽堿的抗體與含有OxLDL的樣品接觸;(b)使所述抗體與OxLDL結(jié)合;(c)測(cè)定所述抗體與OxLDL的結(jié)合量;(d)依據(jù)以磷酸膽堿為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線,定量OxLDL含量。因抗原抗體反應(yīng)很復(fù)雜,與很多因素有夫,雖然磷酸膽堿的抗原決定族與低密度脂蛋白經(jīng)氧化修飾后表面呈現(xiàn)的抗原決定族相同,但是抗磷酸膽堿抗體與氧化低密度脂蛋白的抗原抗體反應(yīng)的特異性程度難以預(yù)測(cè),用抗磷酸膽堿抗體檢測(cè)氧化低密度脂蛋白的準(zhǔn)確度不夠高,難以應(yīng)用于臨床檢測(cè)。申請(qǐng)?zhí)枮?00710202084. 7,發(fā)明名稱ー種間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)微量氧化低密度脂蛋白膠體金試紙條,公開了ー種半定量檢測(cè)微量氧化低密度脂蛋白交替金試紙條,包括基本支持片,該試紙條包括基本支持片,以及在基本支持片一次排列的吸水墊,層析膜,金墊和樣品吸收墊,其特征在于固定只能結(jié)合約600μ g濃度的金標(biāo)抗體于金墊上,采用間接競(jìng)爭(zhēng)法,是固定于層析膜上的氧化低密度脂蛋白與待檢樣品中的氧化低密度脂蛋白競(jìng)爭(zhēng)顯色。該檢測(cè)方法為半定量檢測(cè),難以準(zhǔn)確檢測(cè)氧化低密度脂蛋白含量,更難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)待檢樣本患冠心病的可能性。因此,目前臨床上還沒(méi)有ー種簡(jiǎn)便、快捷、無(wú)創(chuàng)傷、價(jià)格低廉且準(zhǔn)確性高的冠心病診斷產(chǎn)品,發(fā)展新的冠心病檢查手段非常必要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種人氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,用以進(jìn)ー步診斷冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病。本發(fā)明的另ー技術(shù)方案提供了該試劑盒的使用方法和用途?!N人氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,它包含如下成分( I)包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板;(2)人氧化低密度脂蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品I :甸升標(biāo)準(zhǔn)品I含有20g牛血清白蛋白、50g鹿糖;標(biāo)準(zhǔn)品2 :每升標(biāo)準(zhǔn)品2含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和IU氧化低密度脂蛋白;標(biāo)準(zhǔn)品3 :每升標(biāo)準(zhǔn)品3含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和2U氧化低密度脂蛋白;標(biāo)準(zhǔn)品4 :每升標(biāo)準(zhǔn)品4含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和4U氧化低密度脂蛋白;標(biāo)準(zhǔn)品5 :每升標(biāo)準(zhǔn)品5含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和8U氧化低密度脂蛋白;標(biāo)準(zhǔn)品6 :每升標(biāo)準(zhǔn)品6含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和16U氧化低密度脂蛋白;(3)酶標(biāo)記抗體為過(guò)氧化物酶或辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗人載脂蛋白B抗體;(4)稀釋液;(5)洗滌液;(6)底物液;(7)終止液。 其中,所述試劑盒還包括質(zhì)控物高質(zhì)控物每升高質(zhì)控物含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和13U氧化低密度脂蛋白;低質(zhì)控物每升低質(zhì)控物含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和I. 5U氧化低密度脂蛋白。其中,步驟(I)所述的包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板是按照如下方法制備的a、抗體稀釋用pH為8. O的50mM的Tris-HCl緩沖溶液將抗人氧化低密度脂蛋白單克隆抗體稀釋到2. 5 20μ g/ml,得包被液;b、包被取微孔板,用洗滌液洗滌3次,加入上述含抗人氧化低密度脂蛋白單克隆抗體的包被液,每孔100 μ I/孔,4°C孵育12小時(shí);C、封閉傾去包被液,置于吸水紙上輕拍幾次,去除殘液,加入含1%牛血清白蛋白和5%蔗糖的濃度為50mmol/L的Tris-HCl封閉液,其pH為8. 0,300 μ I/孔,,室溫,I小吋;d、真空干燥,密封,即得包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板。優(yōu)選地,所述的抗人氧化低密度脂蛋白單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCCN0:C200304的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。
其中,所述的氧化低密度脂蛋白的制備方法如下i、取低密度脂蛋白,溶于IOmM磷酸鹽緩沖液中,其中,低密度脂蛋白的濃度為5mg/ml ;ii、取步驟i的磷酸鹽緩沖液,加入硫酸銅,使其終濃度為2ymol/L,37°C反應(yīng)2小時(shí);iii、再加入こニ胺四こ酸,使其終濃度為O. 01%(w/v),終止反應(yīng),透析,即得氧化低
密度脂蛋白。其中,所述稀釋液是每升含NaCl 40g, NaH2PO4 · 2H20 I. 184g,Na2HPO4 · 12H20 11. 6g,牛血清白蛋白50g的水溶液;所述洗滌液是每升含NaCl 68g,NaH2PO4 · 2H20 6. 22g,Na2HPO4 · 12H2061g,Tween-202 Iml 的水溶液;所述底物液包含底物液A和底物液B,底物液A是含有TMB的水溶液,底物液B是含有H2O2的水溶液;所述終止液是每升含有濃硫酸108ml的水溶液。本發(fā)明還提供了前述的試劑盒的使用方法,它包含下列步驟I、樣品前處理;II、用前述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè);III、結(jié)果處理與分析。優(yōu)選地,它包含下列步驟①樣品稀釋用稀釋液將待測(cè)樣品稀釋4倍;②溶液配制取標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品,復(fù)溶;酶標(biāo)記抗體工作液用稀釋液將酶標(biāo)記抗體稀釋125 1000倍;③取包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板,用洗滌液洗滌3次,備用;④加樣取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控物和待測(cè)樣品分別加入微孔板,每孔100 μ I ;37°C下孵育2小時(shí);用洗滌液洗板5次;⑤加入酶標(biāo)抗體以與抗人氧化低密度脂蛋白單克隆抗體垂直的方向,加入稀釋后的酶標(biāo)抗體,100 μ I/孔,37°C下孵育I小時(shí),用洗滌液洗板5次;⑥加入底物液取等體積的底物液A和底物液B,共100 μ I/孔,37°C避光孵育15分鐘;⑦加入終止液,50 μ I/孔;⑧測(cè)定光吸收值啟動(dòng)酶標(biāo)儀,于終止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)讀數(shù),測(cè)定波長(zhǎng)450nm。其中,步驟②所述酶標(biāo)記抗體稀釋125倍。本發(fā)明還提供了該試劑盒在制備冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒提供了良好的參照-人氧化低密度脂蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)品,為準(zhǔn)確檢測(cè)待檢樣本中氧化低密度脂蛋白提供了可能,并對(duì)抗氧化低密度脂蛋白抗體以及其他溶液均作了優(yōu)選,提高試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確度。本發(fā)明提供的試劑盒可以達(dá)到很好的線性范圍(相關(guān)系數(shù)(R)不低于O. 99)和很好的精密性(本品分析內(nèi)精密性CV%不高于15% ;分析間精密性CV%不高于20%),說(shuō)明其準(zhǔn)確度高,且臨床檢測(cè)能準(zhǔn)確將冠心病患者和正常受試者分開,具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。顯然,根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容,按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段,在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下,還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
,對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)ー步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的組成及其使用方法I、試劑盒的組成
( I)包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板;(2)人氧化低密度脂蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品I :甸升標(biāo)準(zhǔn)品I含有20g牛血清白蛋白、50g鹿糖;標(biāo)準(zhǔn)品2 :每升標(biāo)準(zhǔn)品2含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和IU氧化低密度脂蛋白;標(biāo)準(zhǔn)品3 :每升標(biāo)準(zhǔn)品3含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和2U氧化低密度脂蛋白;標(biāo)準(zhǔn)品4 :每升標(biāo)準(zhǔn)品4含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和4U氧化低密度脂蛋白;標(biāo)準(zhǔn)品5 :每升標(biāo)準(zhǔn)品5含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和8U氧化低密度脂蛋白;標(biāo)準(zhǔn)品6 :每升標(biāo)準(zhǔn)品6含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和16U氧化低密度脂蛋白;(3)酶標(biāo)記抗體為過(guò)氧化物酶或辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗人載脂蛋白B抗體;(4)稀釋液每升含 NaCl 40g, NaH2PO4 · 2Η201· 184g, Na2HPO4 · 12Η2011· 6g,牛血清白蛋白50g的水溶液;(5)洗滌液每升含 NaCl 68g, NaH2PO4 · 2H20 6. 22g, Na2HPO4 · 12H2061g,Tween-202 Iml 的水溶液;(6)底物液包含底物液A和底物液B,底物液A是含有TMB的水溶液,底物液B是含有H2O2的水溶液;(7)終止液每升含有濃硫酸108ml的水溶液;(8)質(zhì)控物高質(zhì)控物每升高質(zhì)控物含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和13U氧化低密度脂蛋白;低質(zhì)控物每升低質(zhì)控物含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和I. 5U氧化低密度脂蛋白。商品化試劑盒的組成見表I (96人份/盒)表I本發(fā)明試劑盒主要組成成份
權(quán)利要求
1.一種人氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,其特征在于它包含如下成分 (1)包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板; (2)人氧化低密度脂蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品I :每升標(biāo)準(zhǔn)品I含有20g牛血清白蛋白、50g鹿糖; 標(biāo)準(zhǔn)品2 :每升標(biāo)準(zhǔn)品2含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和IU氧化低密度脂蛋白; 標(biāo)準(zhǔn)品3 :每升標(biāo)準(zhǔn)品3含有20g牛血清白蛋白、50g鹿糖和2U氧化低密度脂蛋白; 標(biāo)準(zhǔn)品4 :每升標(biāo)準(zhǔn)品4含有20g牛血清白蛋白、50g鹿糖和4U氧化低密度脂蛋白; 標(biāo)準(zhǔn)品5 :每升標(biāo)準(zhǔn)品5含有20g牛血清白蛋白、50g鹿糖和8U氧化低密度脂蛋白; 標(biāo)準(zhǔn)品6 :每升標(biāo)準(zhǔn)品6含有20g牛血清白蛋白、50g鹿糖和16U氧化低密度脂蛋白; (3)酶標(biāo)記抗體為過(guò)氧化物酶或辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗人載脂蛋白B抗體; (4)稀釋液; (5)洗滌液; (6)底物液; (7)終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒,其特征在于所述試劑盒還包括質(zhì)控物 高質(zhì)控物每升高質(zhì)控物含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和13U氧化低密度脂蛋白; 低質(zhì)控物每升低質(zhì)控物含有20g牛血清白蛋白、50g蔗糖和I. 5U氧化低密度脂蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒,其特征在于步驟(I)所述的包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板是按照如下方法制備的 a、抗體稀釋用pH為8.O的50mM的Tris-HCl緩沖溶液將抗人氧化低密度脂蛋白單克隆抗體稀釋到2. 5 20ii g/ml,得包被液; b、包被取微孔板,用洗滌液洗滌3次,加入上述含抗人氧化低密度脂蛋白單克隆抗體的包被液,每孔IOOiU/孔,4°C孵育12小時(shí); C、封閉傾去包被液,置于吸水紙上輕拍幾次,去除殘液,加入含1%牛血清白蛋白和5%蔗糖的濃度為50mmol/L的Tris-HCl封閉液,其pH為8. 0,300 U I/孔,室溫,I小時(shí);d、真空干燥,密封,即得包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒,其特征在于所述的抗人氧化低密度脂蛋白單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC NO C 200304的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或者2所述的試劑盒,其特征在于所述的氧化低密度脂蛋白的制備方法如下 i、取低密度脂蛋白,溶于IOmM磷酸鹽緩沖液中,其中,低密度脂蛋白的濃度為5mg/ml ; ii、取步驟i的磷酸鹽緩沖液,加入硫酸銅,使其終濃度為2u mol/L, 37V反應(yīng)2小時(shí); iii、再加入乙二胺四乙酸,使其終濃度為0.01%(w/v),終止反應(yīng),透析,即得氧化低密度脂蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒,其特征在于 所述稀釋液是每升含 NaCl 40g, NaH2PO4 2H201. 184g,Na2HPO4 12H2011. 6g,牛血清白蛋白50g的水溶液; 所述洗滌液是每升含 NaCl 68g,NaH2PO4 2H20 6. 22g,Na2HPO4 12H2061g,Tween-202 Iml 的水溶液; 所述底物液包含底物液A和底物液B,底物液A是含有TMB的水溶液,底物液B是含有H2O2的水溶液; 所述終止液是每升含有濃硫酸108ml的水溶液。
7.權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的試劑盒的使用方法,其特征在于它包含下列步驟 I、樣品前處理; II、用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè); III、結(jié)果處理與分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的使用方法,其特征在于它包含下列步驟 ①樣品稀釋用稀釋液將待測(cè)樣品稀釋4倍; ②溶液配制 取標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品,復(fù)溶; 酶標(biāo)記抗體工作液用稀釋液將酶標(biāo)記抗體稀釋125 1000倍; ③取包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板,用洗滌液洗滌3次,備用; ④加樣取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控物和待測(cè)樣品分別加入微孔板,每孔IOOiU;37°C下孵育2小時(shí);用洗滌液洗板5次; ⑤加入酶標(biāo)抗體以與抗人氧化低密度脂蛋白單克隆抗體垂直的方向,加入稀釋后的酶標(biāo)抗體,IOOul/孔,37°C下孵育I小時(shí),用洗滌液洗板5次;⑥加入底物液取等體積的底物液A和底物液B,共100iil/孔,37 °C避光孵育15分鐘; ⑦加入終止液,50iil/孔; ⑧測(cè)定光吸收值啟動(dòng)酶標(biāo)儀,于終止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)讀數(shù),測(cè)定波長(zhǎng)450nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用方法,其特征在于步驟②所述酶標(biāo)記抗體稀釋125倍。
10.權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的試劑盒在制備冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人氧化低密度脂蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,它包含如下成分(1)包被有抗人氧化低密度脂蛋白抗體的酶標(biāo)板;(2)人氧化低密度脂蛋白系列標(biāo)準(zhǔn)溶液;(3)酶標(biāo)記抗體;(4)稀釋液;(5)洗滌液;(6)底物液;(7)終止液。本發(fā)明還提供了該試劑盒的使用方法和用途。本發(fā)明與傳統(tǒng)的冠心病檢測(cè)手段相比,該試劑盒具有無(wú)創(chuàng)傷、簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高、價(jià)格低廉的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102680710SQ20121016079
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月22日
發(fā)明者萬(wàn)方, 徐燕華, 陳英 申請(qǐng)人:成都華神生物技術(shù)有限責(zé)任公司