專利名稱：一種水環(huán)境中雌激素結(jié)合體的共檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水環(huán)境中有機污染物的檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及自然水體樣品中痕量天然雌激素結(jié)合體的提取、凈化和儀器檢測方法。
背景技術(shù)：
由人或哺乳動物卵巢分泌的天然雌激素雌酮(Estrone，El)、17 β -雌二 醇(17 β-Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3)和人工合成雌激素乙炔基雌二醇(17 a -Ethinyl Estradiol, EE2)是最具潛在雌性化風(fēng)險的內(nèi)分泌干擾物(EndocrineDisrupting Compounds,EDCs),在水環(huán)境中ng/L濃度水平就會導(dǎo)致魚類的雌性化。雌激素排出時其雌激素分子結(jié)構(gòu)中C3-或者C7-位置的羥基多被硫酸鹽或者葡萄糖醛酸所取代，轉(zhuǎn)變成為無雌激素活性的結(jié)合體結(jié)構(gòu)，但在水體或污水處理廠生物酶的作用下，會轉(zhuǎn)化為其單體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)雌激素活性。近十年來雌激素作為典型的內(nèi)分泌干擾物受到廣泛關(guān)注。歐美等國對多家污水處理廠雌激素濃度及去除效率的調(diào)查結(jié)果顯示，在污水處理廠出水及受納水體中殘留著Hg/L濃度水平的雌激素。目前，國內(nèi)外關(guān)注自然水體、土壤中雌激素單體的研究比較多，對于環(huán)境介質(zhì)中雌激素結(jié)合體的調(diào)查研究相對較少，這也包括水環(huán)境中雌激素結(jié)合體的相關(guān)研究。這很大原因歸結(jié)為水環(huán)境中雌激素結(jié)合體痕量存在，易受水體基質(zhì)影響。因次，建立回收率高、重現(xiàn)性好的水環(huán)境中天然雌激素結(jié)合體分析方法，是進一步研究環(huán)境介質(zhì)中雌激素遷移轉(zhuǎn)化的前提條件。近年來，痕量有機物的儀器檢測技術(shù)有了很大的提高，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS/MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS/MS)等，具有較高的靈敏度和精確度。然而，對于實際環(huán)境樣品，比如自然水體樣品，由于基質(zhì)干擾作用，使分析方法的準確性和精密性大大降低。因此，如何將水環(huán)境中痕量存在的雌激素結(jié)合體富集并進行適當凈化，成了水環(huán)境中雌激素結(jié)合體分析的一個瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對水環(huán)境中雌激素結(jié)合體痕量存在、基質(zhì)干擾大、前處理技術(shù)難度大等問題，擬開發(fā)一種回收率高、靈敏度高、準確、快速的分析技術(shù)，實現(xiàn)對水環(huán)境樣品中四種雌激素結(jié)合體雌酮硫酸鹽結(jié)合體(Estrone-3-sulfate,E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸鹽結(jié)合體(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結(jié)合體(Estrone-3-glucuronide, E1-3G)、17 β -雌二醇葡萄糖苷酸結(jié)合體(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)的定量測定。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種檢測水環(huán)境樣品中痕量存在的雌酮硫酸鹽結(jié)合體(E1-3S)、17 0-雌二醇硫酸鹽結(jié)合體(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結(jié)合體(El-3G)、17i3-雌二醇葡萄糖苷酸結(jié)合體(E2-3G)的定量測定方法。附圖
I為分析方法具體步驟，其特征在于該方法包括如下部分(I)HLB 柱富集水樣采用GF/F玻璃纖維濾膜進行過濾，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH為3 ;利用固相萃取裝置活化Waters公司的HLB固相萃取柱(200mg,6cc),活化的順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及IOmL超純水，流速為lmL/min ;采用已活化的固相萃取柱對水樣進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min ;萃取結(jié)束后真空抽干5min,待凈化。⑵NH2柱凈化
將用5mL甲醇活化過的Waters公司的NH2柱(500mg,6cc)用固相萃取柱轉(zhuǎn)接頭接于干燥的HLB柱下方，接著用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串聯(lián)裝置，去除基質(zhì)干擾，再用6mL 2%氨水甲醇溶液洗脫NH2柱上的雌激素結(jié)合體，洗脫液收集于IOmL玻璃離心管中，控制流速為lmL/min,洗脫液在氮氣流下緩慢吹干,加入ImL乙腈/水(1/1, v/v)混合液，漩渦混合，冷藏等待濃度測定。(3)利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析雌激素結(jié)合體液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀器為=Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元輸液泵，美國Agilent公司的自動進樣器，3200QTRAP型液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst I. 4. I數(shù)據(jù)處理軟件；色譜柱Nova_PakC18 (3· 9_X 150_X 4 μ m), Waters 公司；離子源電噴霧離子化源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓-4500V ;溫度4500C ;源內(nèi)氣體I (GSl，N2)壓力45psi ;源內(nèi)氣體2(GS2，N2)壓力45psi ;氣簾氣體(N2)壓力20psi ;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM);碰撞氣(N2)壓力Medium。雌酮硫酸鹽結(jié)合體(E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸鹽結(jié)合體(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結(jié)合體(El-3G)、17i3-雌二醇葡萄糖苷酸結(jié)合體(E2-3G)進行分離的HPLC流動相梯度洗脫條件詳見表I和表2。表I測定雌酮硫酸鹽結(jié)合體(E1-3S)和17 β -雌二醇硫酸鹽結(jié)合體(E2-3S)流
動相梯度洗脫條件
權(quán)利要求
1.一種水環(huán)境中雌激素結(jié)合體的共檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟 (1)水環(huán)境樣品前處理 取4L水樣采用GF/F玻璃纖維濾膜進行過濾，并用4mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH為3 ;利用固相萃取裝置活化Waters公司的HLB固相萃取柱，活化的順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及IOmL超純水，流速為lmL/min ;采用已活化的固相萃取柱對水樣進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min ;萃取結(jié)束后真空抽干5min,待凈化；將用5mL甲醇活化過的Waters公司的NH2柱用固相萃取柱轉(zhuǎn)接頭接于干燥的HLB柱下方,接著用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串聯(lián)裝置，再用6mL 2%氨水甲醇溶液(v/v)洗脫NH2柱上的雌激素結(jié)合體，洗脫液收集于IOmL玻璃離心管中，控制流速為lmL/min，洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入ImL乙腈/水(1/1，v/v)混合液，漩渦混合，冷藏等待濃度測定； (2)利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析雌激素結(jié)合體 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀器為=Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元輸液泵，美國Agilent公司的自動進樣器，3200QTRAP型液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst I. 4. I數(shù)據(jù)處理軟件； 色譜柱Nova_Pak C18 (3. 9_X 150_X 4 U m), Waters公司；離子源電噴霧離子化源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓-4500V;溫度4500C ;源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力45psi ;源內(nèi)氣體2(GS2，N2)壓力45psi ;氣簾氣體(N2)壓力20psi ;掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM);碰撞氣(N2)壓力Medium ;雌酮硫酸鹽結(jié)合體(Estrone-3-sulfate,E1-3S)、17 0 -雌二醇硫酸鹽結(jié)合體(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結(jié)合體(Estrone-3-glucuronide, E1-3G)、170 -雌二醇葡萄糖苷酸結(jié)合體(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)進行分離的HPLC流動相梯度洗脫條件如表I和表2所示 表I測定雌酮硫酸鹽結(jié)合體(E1-3S)和17 3 -雌二醇硫酸鹽結(jié)合體(E2-3S)流動相梯度洗脫條件 #口時間流速乙腈氨水，196。，甲醇可minnL/min%%%00.006507.585.07.510.206507.585.07.521.2065010-080.01O-O32.0065015.070.015-043.0065049-02.049.056.1065050.00.050.066.206507-585.07-5710.006507.585.07.5 表2 測定雌酮葡萄糖苷酸結(jié)合體(E1-3G)和17 3-雌二醇葡萄糖苷酸結(jié)合體(E2-3G)流動相梯度洗脫條件
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水環(huán)境中雌激素結(jié)合體的共檢測方法，其中所述雌激素結(jié)合體為雌酮硫酸鹽結(jié)合體(Estrone-3-sulfate, E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸鹽結(jié)合體(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結(jié)合體(Estrone-3-glucuronide,E1-3G)、17 β -雌二醇葡萄糖苷酸結(jié)合體(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物的檢測技術(shù)，特別是涉及一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對水體樣品中雌激素結(jié)合體雌酮硫酸鹽結(jié)合體(Estrone-3-sulfate，E1-3S)、17β-雌二醇硫酸鹽結(jié)合體(Estradiol-3-sulfate，E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結(jié)合體(Estrone-3-glucuronide，E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸結(jié)合體(Estradiol-3-glucuronide，E2-3G)的共檢測方法。本方法將采集好的水體樣品，采用HLB固相萃取小柱富集其中的E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G，再將活化好的NH2柱接于HLB柱下方，用甲醇淋洗，最后用2％氨水甲醇溶液洗脫，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析。該方法環(huán)境友好、易于操作、且回收率較高，能夠快速分析水體樣品中痕量存在的雌激素結(jié)合體E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G。
文檔編號G01N30/88GK102636610SQ20121012753
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者劉曉薇, 史江紅, 吳唯, 張暉, 薄婷, 賈彥舶, 陳慶彩 申請人:北京師范大學(xué)