專利名稱：一種基于表面等離子共振技術(shù)的種質(zhì)資源中特定dna序列鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種種質(zhì)資源中特定DNA序列鑒定技術(shù)，特別是基于表面等離子共振技術(shù)，核酸適配體與未標記和標記的樣品特異性競爭識別，采用免疫球蛋白E修飾的傳感元件間接鑒定種質(zhì)資源中特定DNA序列的方法。
背景技術(shù)：
種質(zhì)資源是國民經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)性戰(zhàn)略資源。然而，近年來，我國種質(zhì)資源流失嚴重，一方面我國擁有的人類遺傳資源、重要經(jīng)濟作物資源、藥用資源、工業(yè)微生物資源等通過非正當途徑大量流失到國外；另一方面一些發(fā)達國家在我國建立植物提取物粗加工基地，掠奪性地從我國引進優(yōu)等藥材和資源性提取物。此外，長期以來，我國種質(zhì)資源鑒 定通常是根據(jù)形態(tài)標記來進行的，如株高、穗長、粒色等。此種形態(tài)標記簡單直觀，但存在數(shù)少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件影響等缺點。因此，導(dǎo)致我國種質(zhì)資源保護工作面臨著巨大的挑戰(zhàn)，嚴重缺乏能滿足巨大數(shù)量和多種類型物種資源檢測鑒定的分析技術(shù)。近10年來，在人類基因組研究計劃的推動下，結(jié)合現(xiàn)代檢測鑒定技術(shù)，分子標記的研究與應(yīng)用得到了迅速的發(fā)展。熒光定量PCR技術(shù)可以通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，但該技術(shù)目前并不能準確地鑒定種質(zhì)資源；而建立在PCR基礎(chǔ)上直接測序的方法，成本昂貴，無法實現(xiàn)快速高通量檢測鑒定?？梢哉f，在物種遺傳標記等真實性檢測鑒定技術(shù)方面我國基本處于空白狀態(tài)。以表面等離子體共振譜儀為技術(shù)平臺，可以為種質(zhì)資源中特定DNA序列的快速鑒定提供一種簡便可靠的方法，大大縮短了檢測鑒定時間，有望發(fā)展成為種質(zhì)資源鑒定的標準化檢測平臺。但其存在傳感芯片檢測專一性和成本高問題。例如，采用表面等離子體共振原理檢測的儀器BIACore，其常用傳感器芯片SA芯片成本為3000多元人民幣。因此，如何實現(xiàn)同一傳感芯片檢測不同特定DNA序列已成為表面等離子體共振檢測領(lǐng)域熱點研究問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有特定DNA序列分析技術(shù)存在的耗材量大、造價昂貴等問題，同時滿足對種質(zhì)資源中各種DNA序列的鑒定要求，本發(fā)明提供了一種種質(zhì)資源中特定DNA的表面等離子體共振鑒定方法。該方法具有通用、高穩(wěn)定性、高靈敏度、操作簡單等優(yōu)點，滿足對種質(zhì)資源中特定DNA序列的鑒定要求。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種應(yīng)用表面等離子共振儀的種質(zhì)資源中特定DNA序列鑒定方法，利用同一傳感芯片對不同種質(zhì)資源中特定DNA序列進行鑒定；其特征在于包括以下步驟
(一)傳感芯片表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入5-50 μ L濃度為1-50 μ g/L已標記生物素的免疫球蛋白E適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上免疫球蛋白E適配體；(二)對特定單鏈DNA進行免疫球蛋白E標記，標記方法根據(jù)待測物基團不同；所述標記方法包括DNA的對苯二異硫氰酸酯修飾和與免疫球蛋白E的氨基偶聯(lián)。如將水稻一段SSR單鏈與對苯二異硫氰酸酯反應(yīng)后，再與免疫球蛋白E的氨基偶聯(lián)，形成通過對苯二異硫氰酸酯連接的免疫球蛋白E-SSR序列偶聯(lián)物，待用；
(三)標準溶液配制用O.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液配置免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液，濃度為O. Ing/mL至lmg/mL,加入等量特定單鏈DNA相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體充分混合，獲得特定單鏈DNA標準溶液，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還可以大于加入的適配體量；
(四)建立對照曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以O(shè).02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準，通過微泵通入5-100 μ L特定單鏈DNA標準溶液，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，獲得特定單鏈DNA表面溶液的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值A(chǔ) ； (五)檢測鑒定提取種質(zhì)資源總DNA，進行不對稱PCR擴增反應(yīng)，獲得單鏈DNA;對于待測單鏈DNA樣品進行一系列預(yù)處理，取待測單鏈DNA溶液與免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液充分混合后，競爭結(jié)合特定單鏈DNA相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還不少于加入的適配體量；采用表面等離子體共振檢測儀記錄待測單鏈DNA的光譜圖；通過檢測免疫球蛋白Ε，間接鑒定特定DNA是否存在；對比待測單鏈DNA樣品的譜圖穩(wěn)定值B與特定單鏈DNA的譜圖穩(wěn)定值Α，當B小于A時，說明種質(zhì)資源中含有特定DNA序列，當B等于A時，說明不含有特定DNA序列；
(六)通入O.01-0. 05mol/L (pH為2_3)的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗傳感芯片表面，進行傳感元件再生，用于其它種質(zhì)資源中特定DNA序列的鑒定。可以采用核酸適配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關(guān)。所述步驟(一)傳感器表面適配體固定，包括如下步驟
(1)將鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進行在線傳感表面修飾；
(2)通入O.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液；
(3)通入5-50μL濃度為1-50μ g/L生物素修飾的免疫球蛋白E適配體溶液，進行在線偶聯(lián)至基線穩(wěn)定；
(4)重復(fù)步驟(2)至(3)，獲得免疫球蛋白E適配體修飾的傳感芯片?？梢圆捎妹庖咔虻鞍譋標記待測物，與未標記樣品一起與核酸適配體發(fā)生特異性競爭識別。所述步驟(三)中納米粒子可以是金屬納米粒子或磁性納米粒子或高分子化合物。所述步驟(四)和(五)中通過檢測免疫球蛋白E的含量，間接鑒定特定DNA是否存在，提高表面等離子體傳感芯片的可重復(fù)利用性，適用于各種種質(zhì)資源中特定DNA序列的檢測。本發(fā)明的有益效果
(I)本發(fā)明解決種質(zhì)資源中特定DNA序列鑒定芯片的專一性差問題，引入免疫球蛋白E作為標記分子，采用生物素標記的適配體對表面等離子體共振傳感芯片進行修飾，將種質(zhì)資源中特定DNA序列的鑒定轉(zhuǎn)換為對免疫球蛋白E的測量，實現(xiàn)傳感芯片的通用性，使用同一傳感芯片對種質(zhì)資源中不同特定DNA序列進行鑒定。具體檢測原理見附圖I ;(2)本發(fā)明解決芯片穩(wěn)定性差問題，采用適配體作為芯片表面通用配體，再生容易?？芍貜?fù)使用性強，極大地延長了芯片的使用壽命，降低檢測成本；
(3)本發(fā)明解決試劑消耗量大問題，采用待測樣品中DNA序列和免疫球蛋白E標記的特定DNA序列競爭識別特定DNA的適配體時，相對于以往的競爭抑制結(jié)合思想，無須加入過量的適配體，既實現(xiàn)了響應(yīng)信號放大，也節(jié)省了試劑消耗；
(4)本發(fā)明提高了檢測靈敏度，操作中可選用納米粒子修飾的特定DNA適配體，基于表面等離子體共振檢測時，信號顯著增加。


圖I是本發(fā)明所述的種質(zhì)資源中特定DNA序列鑒定原理圖；其中 為特定DNA序列，為樣品中待鑒定DNA序列，b為免疫球蛋白E標記的特定DNA序列J為
特定DNA的適配體，_為免疫球蛋白E的適配體， 為納米粒子。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作以詳細描述。實施例選擇水稻顯性早熟基因Ehd的一段SSR序列為鑒定對象，具體操作步驟如下
(1)傳感器表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入20μ L濃度為30 μ g/L已標記生物素的免疫球蛋白E適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上免疫球蛋白E適配體；
(2)水稻顯性早熟基因Ehd特定SSR序列和免疫球蛋白E偶聯(lián)將特定SSR單鏈與對苯二異硫氰酸酯反應(yīng)后，再與免疫球蛋白E的氨基偶聯(lián)，形成通過對苯二異硫氰酸酯連接的免疫球蛋白E-特定SSR序列偶聯(lián)物，待用；
(3)標準溶液配制用O.02mol/L (pH = 7. 4)的HEPBS緩沖液配置免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液，濃度為O. Ing/mL至lmg/mL，加入等量特定單鏈DNA相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體充分混合，獲得特定單鏈DNA標準溶液，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還可以大于加入的適配體量；
(4)建立對照曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以O(shè).02mol/L的HEPBS緩沖液為測量基準，通過微泵通入30 μ L特定單鏈DNA標準溶液，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，獲得特定單鏈DNA表面溶液的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值A(chǔ) ；
(5)特定SSR單鏈鑒定方法
將處理后的樣品通過(I)修飾好的傳感芯片表面進行鑒定，具體步驟為
1)對待測單鏈DNA樣品進行一系列預(yù)處理，取待測單鏈DNA溶液與免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液充分混合后，競爭結(jié)合特定單鏈DNA相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還不少于加入的適配體量；
2)將處理后的待測溶液流過傳感芯片表面lOmin，記錄下工作通道和參比通道的表面等離子體共振儀光譜圖穩(wěn)定值B ；
3)對比待測單鏈DNA的譜圖穩(wěn)定值B與特定單鏈DNA的譜圖穩(wěn)定值A(chǔ);當B值小于A值時，種質(zhì)資源中存在特定DNA序列，否則反之；4)對傳感芯片進行再生，通入20mmol/L甘氨酸/鹽酸緩沖溶液lOmin，用以破壞免疫球蛋白E與芯片上適配體的結(jié)合，并通入緩沖液沖洗。本發(fā)明為了敘述的準確和方便，在實施例中以水稻顯性早熟基因Ehd的一段SSR序列進行詳細描述，但本發(fā)明同樣適用于其它種質(zhì)資源中特定DNA序列的鑒定。傳感器表面再生所用溶液選擇O. 02mol/L (pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液，但還可以選擇鹽溶液或弱酸弱堿溶液或高離子強度電解質(zhì)溶液，如O. 5mol/L氫氧化鈉溶液或10 mmol/L甘氨酸/鹽酸緩沖溶液，破壞凝血酶與適配體的結(jié)合，因此上述內(nèi)容均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。此外，根據(jù)實施例I的方法進行檢測樣品，與現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)相比，準確度提高疒10倍，探頭壽命延長10倍以上，現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)不能準確檢測的短鏈特定DNA序列等(小分子量〈1000 Da)，可以采用本 發(fā)明的方法獲得準確的檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用表面等離子體共振儀的種質(zhì)資源中特定DNA序列鑒定方法，利用同一傳感芯片對特定種質(zhì)資源或DNA序列進行鑒定；其特征在于包括以下步驟 (一)傳感芯片表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入5-50 ii L濃度為l-50ii g/L已標記生物素的免疫球蛋白E適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上免疫球蛋白E適配體； (二)對特定單鏈DNA進行免疫球蛋白E標記； (三)標準溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液配置免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液,濃度為0. Ing/mL至lmg/mL,加入等量特定單鏈DNA相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體充分混合，獲得特定單鏈DNA標準溶液，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還可以大于加入的適配體量； (四)建立對照曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準，通過微泵通入5-100 u L特定單鏈DNA標準溶液，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，獲得特定單鏈DNA表面溶液的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值A(chǔ) ； (五)檢測鑒定提取種質(zhì)資源總DNA，進行不對稱PCR擴增反應(yīng)，獲得單鏈DNA;對于待測單鏈DNA樣品進行一系列預(yù)處理，取待測單鏈DNA溶液與免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液充分混合后，競爭結(jié)合特定單鏈DNA相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還不少于加入的適配體量；采用表面等離子體共振檢測儀記錄待測單鏈DNA的光譜圖；通過檢測免疫球蛋白E，間接鑒定特定DNA是否存在；對比待測單鏈DNA樣品的譜圖穩(wěn)定值B與特定單鏈DNA的譜圖穩(wěn)定值A(chǔ)，當B小于A時，說明種質(zhì)資源中含有特定DNA序列，當B等于A時，說明不含有特定DNA序列； (六)通入0.01-0. 05mol/L (pH為2_3)的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗傳感芯片表面，進行傳感元件再生，用于其它種質(zhì)資源中特定DNA序列的鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(二)的標記方法包括DNA的對苯二異硫氰酸酯修飾和與免疫球蛋白E的氨基偶聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于當種質(zhì)資源為水稻，標記方法為將水稻一段SSR單鏈與對苯二異硫氰酸酯反應(yīng)后，再與免疫球蛋白E的氨基偶聯(lián)，形成通過對苯二異硫氰酸酯連接的免疫球蛋白E-SSR序列偶聯(lián)物，待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用核酸適配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關(guān)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(一)傳感器表面適配體固定，包括如下步驟 (1)將鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進行在線傳感表面修飾； (2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液； (3)通入5-50u L濃度為1-50 u g/L生物素修飾的免疫球蛋白E適配體溶液，進行在線偶聯(lián)至基線穩(wěn)定； (4)重復(fù)步驟(2)至(3)，獲得免疫球蛋白E適配體修飾的傳感芯片。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用免疫球蛋白E標記待測物，與未標記樣品一起與核酸適配體發(fā)生特異性競爭識別。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(三)中納米粒子可以是金屬納米粒子或磁性納米粒子或高分子化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(四)和(五)中通過檢測免疫球蛋白E的含量，間接鑒定特定DNA是否存在，提高表面等離子體傳感芯片的可重復(fù)利用性，適用于各種種質(zhì)資源中特定DNA序列的檢測。
全文摘要
一種基于表面等離子共振的種質(zhì)資源中特定DNA序列資源的鑒定方法，屬于種質(zhì)資源鑒定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括傳感表面適配體固定、樣品標記、樣品鑒定、傳感元件再生四個步驟，利用同一傳感芯片對不同DNA序列進行鑒定；其特征在于以免疫球蛋白E作為標記分子探針，將傳感芯片表面連接免疫球蛋白E適配體；對食品樣品進行一系列預(yù)處理，加入單鏈DNA的免疫球蛋白E標記物，混合后競爭結(jié)合金屬納米粒子修飾的單鏈DNA相應(yīng)的適配體；利用表面等離子體共振檢測儀檢測免疫球蛋白E的含量，間接鑒定特定單鏈DNA序列；并對傳感芯片進行再生，用于檢測其它特定DNA序列。本發(fā)明提供了一種種質(zhì)資源中特定DNA序列的有效鑒定方法，實現(xiàn)了同一表面等離子體共振傳感芯片對不同DNA序列的鑒定，具有極高的通用性。
文檔編號G01N21/55GK102661932SQ201210110730
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者于艷軍, 王利兵, 蘇榮欣 申請人:王利兵