專利名稱：一種三聯(lián)免疫膠體金速測(cè)卡及其制備、使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的速測(cè)卡及其使用方法，具體是一種同時(shí)檢測(cè)瘦肉精(鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇)的三聯(lián)免疫膠體金速測(cè)卡及其使用方法。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol)、萊克多巴胺(Ractopamine)、沙丁胺醇(Salbutamol)等β _腎上腺素受體激動(dòng)劑由于能促進(jìn)畜禽的生長，而后曾用于畜禽飼料添加劑，因?yàn)樾笄菔秤煤笤诖x過程中能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成以及脂肪的降解，提高畜禽的瘦肉率。20世紀(jì)90年代，我國錯(cuò)誤地將其作為科研成果開始以飼料添加劑引人并推廣，被俗稱為“瘦肉精”。該藥易在畜禽體內(nèi)特別是內(nèi)臟中殘留，特別是肺、肝、腎等內(nèi)臟里，并通過食物鏈進(jìn)入人體，其累積性殘留隨劑量和時(shí)間而增大；而且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，加熱到172°C時(shí)才分解。因此，一般的烹調(diào)加熱方法不能將其破壞掉。人食用含“瘦肉精”殘留量高的肉制品和內(nèi)臟后，就會(huì)引起中毒，出現(xiàn)全身肌肉顫抖、頭暈、嘔吐等中毒癥狀，嚴(yán)重危害人類健康，特別對(duì)于患有高血壓、心臟病的人來說危險(xiǎn)性就更大，直接危及生命安全。特別地，自從2011 “雙匯瘦肉精”事件爆發(fā)以來，全國范圍內(nèi)的豬肉制品都受到了不同程度地沖擊，這不僅損害了消費(fèi)者的權(quán)益，擾亂了社會(huì)的公信度，對(duì)我國食品安全整體形象也造成了極其惡劣的影響。目前，市場(chǎng)上檢出的“瘦肉精”類違禁藥物殘留主要為鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇以及三種物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國2010年生豬存欄量為4. 8億頭左右，出欄量為一億頭左右。對(duì)如此龐大數(shù)目的生豬養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)等進(jìn)行“瘦肉精”檢測(cè)成了一項(xiàng)浩大的工程。 一般常規(guī)的金標(biāo)卡僅僅能一次檢測(cè)一種“瘦肉精”類型，這嚴(yán)重阻礙了基層食品安全檢測(cè)部門的大范圍篩查。本發(fā)明提供了一種快速、現(xiàn)場(chǎng)、靈敏的檢測(cè)三種主要“瘦肉精”違禁藥物殘留的方法，可以在同一條檢測(cè)卡上同時(shí)檢測(cè)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇，為“瘦肉精”類違禁藥物殘留的快速篩查提供了一種低成本、高效的途徑。以側(cè)向流動(dòng)為檢測(cè)原理的金標(biāo)卡檢測(cè)方法已在我國畜禽產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。但未見針對(duì)同時(shí)檢測(cè)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等的快速檢測(cè)試紙條的公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備同時(shí)檢測(cè)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺以及沙丁胺醇的金標(biāo)卡檢測(cè)方法，并應(yīng)用其針對(duì)尿樣、組織類等樣品中“瘦肉精”類違禁藥物殘留的快速、現(xiàn)場(chǎng)和靈敏的檢測(cè)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的制備方法包括以下步驟I)在上層的塑料板有兩個(gè)的孔，分別為加樣孔和觀察孔，加樣孔大小為3_X7mm,觀察孔大小為4_X18mm。2)在塑料板下方從加樣孔往上依次為并排粘貼的玻璃纖維膜和的固定有膠體金標(biāo)記抗體的試紙條、NC膜、吸收墊。玻璃纖維膜大小為4_X 15mm ;金標(biāo)記抗體試紙條大小為3_X 4mm ;NC膜大小為4_X 28mm ;吸收塾大小為4_X19mm。3)金標(biāo)墊上每種單克隆抗體的量為5ng-50ng ；NC膜上抗原-BSA的量為
O.4 μ g-1. 2 μ go4)試紙條干燥溫度為37°C，時(shí)間為30min。本發(fā)明上述方法制備的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇三聯(lián)速測(cè)卡，實(shí)際豬尿和飼料樣品以及肉樣的快速檢測(cè)具體步驟如下首先于加樣孔中加入50 μ L樣品溶液并水平放置。樣品溶液會(huì)沿樣品墊滲透至膠體金標(biāo)記抗體的試紙條，并與NC膜上的特異性抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試紙條上固定的特異性單克隆抗體。8-lOmin后，于結(jié)果觀察孔中觀察顏色變化，作出判斷。 結(jié)果判斷完全陰性結(jié)果(出現(xiàn)I條C線+3條CLE/SAL/RAC的T線；陽性(+):只要任何一條鹽酸克倫特羅CLE/萊克多巴胺RAC/沙丁胺醇SAL的T線顯色不明顯或無顯色。本發(fā)明制得的新型瘦肉精三聯(lián)速測(cè)卡對(duì)豬肉制品、飼料樣品以及尿樣中的復(fù)雜基質(zhì)具有較好的抗干擾效果，可廣泛應(yīng)用于三種“瘦肉精”違禁藥物殘留的快速檢測(cè)。較現(xiàn)有的速測(cè)卡操作相此，具有以下特有優(yōu)勢(shì)。(I)同一張卡上能同時(shí)檢測(cè)克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇三種“瘦肉精”類殘留，而不是三張單種卡的簡(jiǎn)單物理性膠連，加樣僅需I次，而且反應(yīng)均在同一條件下進(jìn)行。(2)樣品前處理完全統(tǒng)一(克服了組織類樣品檢測(cè)中的不同處理方法)，操作簡(jiǎn)單，50微升樣品加樣量即可。通常地，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇單種卡在檢測(cè)組織類樣本時(shí)，樣品前處理的程序是不一樣的；如單種依次處理，存在時(shí)間長、操作繁瑣等缺陷。(3)檢測(cè)時(shí)間短(5-8min)、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。完全陰性結(jié)果(出現(xiàn)I條C線+3條CLE/SAL/RAC的T線；陽性⑴只要任何一條CLE/SAL/RAC的T線顯色不明顯或無顯色。本發(fā)明提供的同時(shí)檢測(cè)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的三聯(lián)免疫膠體金速測(cè)卡可為實(shí)際檢測(cè)部門提供了快速、現(xiàn)場(chǎng)和靈敏的檢測(cè)方法，主要應(yīng)用豬肉等組織類、飼料、豬尿等液體類樣品等。


圖1為三聯(lián)免疫膠體金速測(cè)卡平面圖I-結(jié)果觀察孔；2-C線、控制線；3-RAC線；4_SAL線；5_CLE線；6_加樣孔
具體實(shí)施例方式結(jié)合本發(fā)明的內(nèi)容提供以下實(shí)施例(I) “瘦肉精”三聯(lián)速測(cè)卡的制作在上層的塑料板卡條上有兩個(gè)孔,加樣孔和觀察孔,加樣孔大小為3mmX7mm,觀察孔大小為4mmX18mm。在塑料卡條下方并排粘貼的樣品墊和固定有膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體的金標(biāo)墊、NC膜以及吸收墊。在金標(biāo)墊上固定25ng-50ng三種單克隆抗體，NC膜上固定O. 4 μ g-1. 2 μ g三種抗原-BSA。然后置于37°C真空干燥30min。(2) “瘦肉精”三聯(lián)速測(cè)卡實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)品效果評(píng)價(jià)①加樣孔中加入50 μ L空白樣品液(pH 7. 4,0. 2mol/L PBS :8g氯化鈉、3. 35g十二水合磷酸氫二鈉，O. 2g磷酸二氫鉀，O. 2g氯化鉀，雙蒸水溶解定容至1L)，在室溫條件下反應(yīng)8分鐘后在結(jié)果觀察孔中觀察顯色結(jié)果。結(jié)果表明，觀察孔中呈現(xiàn)明顯的酒紅色的控制線C線和檢測(cè)線Tl線、T2線、T3線。②加樣孔中加入50 μ L 6ng/ml的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品(采樣同上的PBS溶液稀 釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線、檢測(cè)線T2線、檢測(cè)線T3線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線Tl線無色。③加樣孔中加入50 μ L 6ng/ml的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線、檢測(cè)線Tl線、檢測(cè)線T3線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線T2線無色。④加樣孔中加入50 μ L 6ng/ml的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線、檢測(cè)線Tl線、檢測(cè)線T2線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線T3線無色，。⑤加樣孔中加入50 μ L 6ng/ml的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品和6ng/ml的鹽酸克倫特羅混合標(biāo)準(zhǔn)品(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線、檢測(cè)線T2線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線Tl線、檢測(cè)線T3無色。⑥加樣孔中加入50 μ L 6ng/ml的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品和6ng/ml的萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)品(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線、檢測(cè)線Tl線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線T2線、檢測(cè)線T3線無色。⑦加樣孔中加入50 μ L 6ng/ml的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品和6ng/ml的鹽酸克倫特羅混合標(biāo)準(zhǔn)品(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線、檢測(cè)線T3線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線Tl線、檢測(cè)線T2線無色。⑧加樣孔中加入50 μ L 6ng/ml的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品和6ng/ml的鹽酸克倫特羅和6ng/ml萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)品(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線Tl線、檢測(cè)線T2線、檢測(cè)線T3線均無色。(3)瘦肉精三聯(lián)速測(cè)卡實(shí)際豬尿樣品效果評(píng)價(jià)①加樣孔中加入50 μ L空白豬尿樣本，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中呈現(xiàn)明顯的酒紅色的控制線C線和檢測(cè)線Tl線、Τ2線、Τ3線。②加樣孔中加入50 μ L添加了 6ng/ml的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品和6ng/ml的鹽酸克倫特羅和6ng/ml萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)品的豬尿樣本(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線Tl線、檢測(cè)線T2線、檢測(cè)線T3線均無色。(4)瘦肉精三聯(lián)速測(cè)卡實(shí)際飼料樣品效果評(píng)價(jià)①加樣孔中加入50μ L空白飼料樣本，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中呈現(xiàn)明顯的酒紅色的控制線C線和檢測(cè)線Tl線、Τ2線、Τ3線。②加樣孔中加入50 μ L添加了 6ng/ml的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品和6ng/ml的鹽酸克倫特羅和6ng/ml萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)品的飼料樣本(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線Tl線、檢測(cè)線T2線、檢測(cè)線T3線均無色。(5)瘦肉精三聯(lián)速測(cè)卡實(shí)際肉樣樣品效果評(píng)價(jià)①加樣孔中加入50 μ L空白肉樣樣本，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中呈現(xiàn)明顯的酒紅色的控制線C線和檢測(cè)線Tl線、Τ2線、Τ3線。②加樣孔中加入50 μ L添加了 6ng/ml的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品和6ng/ml的鹽酸克倫特羅和6ng/ml萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)品的肉樣樣本(采樣同上的PBS溶液稀釋配成)，按照與空白樣品同樣的操作步驟。結(jié)果表明，觀察孔中控制線C線呈現(xiàn)酒紅色，檢測(cè)線Tl線、檢測(cè)線T2線、檢測(cè)線T3線均無色。
發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種三聯(lián)免疫膠體金速測(cè)卡及其制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟 (1)將萊克多巴胺-BSA、沙丁胺醇-BSA、鹽酸克倫特羅-BSA以及酶標(biāo)記抗體分別固定于NC膜上； (2)在堿性條件下將膠體金顆粒與特異性單克隆抗體通過靜電作用力相互結(jié)合； (3)速測(cè)卡的組裝以下均以加樣孔作為試紙條的下方。首先將固定有特異性單克隆抗體的金標(biāo)墊蓋在NC膜的下方，其前沿搭在NC膜的底部處；玻璃纖維膜大小為4mmX 15mm蓋在金標(biāo)試紙條的下方lmm-1. 5mm處,其前沿搭在金標(biāo)墊的下部；吸收墊位于試紙條的最上方，其下部蓋在NC膜的上方； (4)在上層的塑料板有兩個(gè)的孔，分別為加樣孔和結(jié)果觀察孔； 在塑料卡條下方并排粘貼的樣品墊和固定有膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體的金標(biāo)墊、NC膜以及吸收墊； 在NC膜上固定三種抗原-BSA、在金標(biāo)墊上固定三種膠體金標(biāo)記的單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求I所述的免疫金標(biāo)速測(cè)卡的使用方法，其特征在于首先于加樣孔中加入50 μ I樣品溶液并水平放置。樣品溶液會(huì)沿樣品墊滲透至膠體金標(biāo)記抗體的試紙條，并與NC膜上的特異性抗原-BSA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)試紙條上的特異性單克隆抗體。8-lOmin后，于結(jié)果觀察孔中觀察顏色變化，作出判斷；如果只有控制線C線，沒有相應(yīng)的檢測(cè)線T線，則表明為待檢物質(zhì)為陽性；既有控制線C線，又有相應(yīng)的檢測(cè)線T線，則表明待檢物質(zhì)為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫金標(biāo)速測(cè)卡，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理。檢測(cè)時(shí)，首先向加樣孔中加入待檢樣本，如果樣本中含有待檢測(cè)物質(zhì)，則樣本中的抗原在側(cè)向移動(dòng)的過程中與位于金標(biāo)墊上的膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，從而抑制了金標(biāo)抗體和NC膜檢測(cè)線上相應(yīng)的抗原-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，則該檢測(cè)線(T線)不顯色，多余的金標(biāo)單克隆抗體則與多余的酶標(biāo)記抗體結(jié)合，控制線(C線)顯色；反之，檢測(cè)線(T線)為酒紅色，控制線(C線)顯色。并應(yīng)用其針對(duì)尿樣、組織類等樣品中“瘦肉精”類違禁藥物殘留的快速、現(xiàn)場(chǎng)和靈敏的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102967707SQ201210089130
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者武愛波, 范峰, 劉木林, 毛愛民, 楊文杰, 劉剛, 陶海強(qiáng), 徐偉, 鐘國良 申請(qǐng)人:無錫福陽生物科技有限公司, 無錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心