酪氨酸-磷酸化的WBP2，一種新的癌癥靶和生物標(biāo)記物相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2010年8月30日提交的新加坡專利申請第201006302-2號(hào)的權(quán)益，其全部內(nèi)容援引加入本文。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及確定癌癥的傾向或者診斷和/或治療癌癥的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：
本發(fā)明的背景的以下討論是為了促進(jìn)本發(fā)明的理解。但是，應(yīng)當(dāng)理解該討論不是承認(rèn)或允許所提及的任何材料在本申請的優(yōu)先權(quán)日期是公開的、已知的或任何管轄范圍中常見的一般知識(shí)的部分。通過核激素受體增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄包括其通過蛋白-蛋白相互作用與共激活蛋白和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用(1,2)。共激活蛋白可以作為轉(zhuǎn)錄接頭發(fā)揮作用，或者通過組氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)或核小體重塑復(fù)合物修飾染色質(zhì)。此外，共激活蛋白調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯以及合成蛋白的翻譯后修飾。一些已知的核激素受體共激活蛋白包括共激活蛋白的p160家族成員、SRC-1、SRC-2[TIF-2/GRIP-l/NCoA-2]、SRC-3[pCIP/ACTR/AIB-l/RAC-3/TRAM-1]、NRIF-3、E6-AP和WBP2。由于它們的多效作用，轉(zhuǎn)錄共激活蛋白作為在癌癥發(fā)展中越來越多涉及的一組蛋白出現(xiàn)并不令人驚訝(3-5)。轉(zhuǎn)錄共激活蛋白常進(jìn)行翻譯后修飾，例如磷酸化。SRC/pl60家族蛋白的特定成員的磷酸化可以增加它們的核定位(6)，抑制它們與非核受體激活蛋白的相互作用(7)或者刺激它們內(nèi)在的共激活蛋白活性(8)。AIB1和PGC-1的磷酸化調(diào)節(jié)它們的半衰期和活性(9,10)。此外，通過Pak1磷酸化NRIF3會(huì)通過增加的ERa-NRIF3相互作用促進(jìn)ERa反式激活(5)。WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(WBP2)為轉(zhuǎn)錄共激活蛋白，據(jù)證實(shí)其通過激素依賴性ERα/PR-WBP2相互作用選擇性和特異性地增強(qiáng)ERa和PR反式激活并將WBP2募集至激素應(yīng)答元件(11)。WBP2包含內(nèi)在的激活結(jié)構(gòu)域。其3個(gè)聚脯氨酸(PPXY)基序之一-PY3對于其在ERα/PR反式激活中的共激活功能是必需的。其共激活蛋白活性可以通過YAP(Yes激酶相關(guān)蛋白)進(jìn)一步增強(qiáng)，YAP還調(diào)節(jié)幾種轉(zhuǎn)錄因子，例如p73(12)、Runx2(13)、TEAD/TEF(14)和ErbB4(15)。我們以前的研究已鑒定WBP2為新的酪氨酸激酶底物，其在乳腺癌發(fā)展的MCF10AT模型中表現(xiàn)出差異性磷酸化(16)。隨后證實(shí)外源表達(dá)的WBP2是EGFR的真實(shí)靶標(biāo)。我們假設(shè)EGFR介導(dǎo)的WBP2的酪氨酸磷酸化在調(diào)節(jié)ERa功能和乳腺癌生物學(xué)中起作用。因此我們試圖描繪EGFR介導(dǎo)的WBP2的酪氨酸磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)途徑并研究WBP2磷酸化對其共激活蛋白活性的影響。還研究WBP2及其酪氨酸磷酸化對ER陽性乳腺癌生物學(xué)的作用以及深層機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
因此，本發(fā)明的一方面包括一種檢測患者的癌癥的方法，所述方法包括以下步驟：a)測量在分離自患者的第一樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量；以及b)將樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量與分離自正常的非癌性細(xì)胞的第二樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量進(jìn)行比較，其中相對于第二樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量，第一樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量的增加指示在第一樣品中存在癌癥。優(yōu)選地，第一和第二樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQEDNo.1的多肽的量還檢測在SEQIDNo.1的多肽的Y231處酪氨酸的磷酸化，其中相對于第二樣品中在Y192和Y231處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量，第一樣品中在Y192和Y231處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量的增加指示在第一樣品中存在癌癥。優(yōu)選地，癌癥是由EGFR、c-Src、c-Yes、ER、Wnt、WBP2或E2F表達(dá)或活性引起，或者起始于或依賴于EGFR、c-Src、c-Yes、ER、Wnt、WBP2或E2F表達(dá)或活性。優(yōu)選地，用分離的磷酸化位點(diǎn)特異性抗體測量具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量，所述抗體僅當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在酪氨酸Y192、或酪氨酸Y231、或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)特異性結(jié)合SEQID.NO.1的WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，其中當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在所述酪氨酸處未磷酸化時(shí)所述抗體不結(jié)合SEQIDNo.1的多肽。優(yōu)選地，所述方法還包括以下步驟：a)使SEQIDNo.1的多肽與多核苷酸探針或引物接觸，所述多核苷酸探針或引物包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列僅在SEQIDNo.1的多肽于酪氨酸Y192、或酪氨酸Y231、或酪氨酸Y192處磷酸化時(shí)在合適的雜交條件下能夠選擇性地雜交至SEQIDNo.1的多肽；以及b)檢測所述探針或引物與在所述酪氨酸處磷酸化的SEQIDNo.1的多肽之間形成的任何雙鏈體。6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中用分離的磷酸化位點(diǎn)特異性適體測量具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量，所述適體僅當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在酪氨酸Y192或Y231或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)特異性結(jié)合SEQID.NO.1的WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，其中當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在所述酪氨酸處未磷酸化時(shí)所述適體不結(jié)合SEQIDNo.1的多肽。本發(fā)明的另一方面包括干擾SEQIDNO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述物質(zhì)包含僅當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在酪氨酸Y192、Y231或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)特異性結(jié)合SEQID.NO.1的WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白的分離的磷酸化位點(diǎn)特異性抗體，其中所述抗體在所述酪氨酸未磷酸化時(shí)不結(jié)合SEQIDNo.1的多肽。優(yōu)選地，所述抗體是包含免疫球蛋白重鏈的免疫球蛋白。優(yōu)選地，所述抗體是包含免疫球蛋白輕鏈的免疫球蛋白。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白是IgG1κ免疫球蛋白。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白在免疫球蛋白的重鏈內(nèi)包含人IgG1恒定區(qū)，并且在免疫球蛋白的輕鏈內(nèi)包含人恒定區(qū)。在一實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白在重鏈內(nèi)和輕鏈內(nèi)包含完整的或部分的人框架區(qū)。在一實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白在重鏈內(nèi)和輕鏈內(nèi)包含鼠框架區(qū)。優(yōu)選地，所述抗體能夠在細(xì)胞系中產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述物質(zhì)包含僅當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在酪氨酸Y192或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)特異性結(jié)合SEQID.NO.1的WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白的分離的磷酸化位點(diǎn)特異性適體，其中所述適體在所述酪氨酸未磷酸化時(shí)不結(jié)合SEQIDNo.1的多肽。在一實(shí)施方案中，所述物質(zhì)包含小干擾RNA如SEQIDNO.2。本發(fā)明的另一方面包括本發(fā)明的物質(zhì)，其用于治療癌癥。優(yōu)選地，本發(fā)明的物質(zhì)用于治療乳腺癌和肺癌。優(yōu)選地，本發(fā)明的物質(zhì)還包含式1的FH535化合物。本發(fā)明的另一方面包括包含本發(fā)明的物質(zhì)和式1的FH535化合物的組合物。本發(fā)明的另一方面包括一種治療患有癌癥的患者的方法，所述方法包括以下步驟：(a)向患者施用干擾SEQIDNO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物質(zhì)。附圖說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案會(huì)參考以下附圖來描述：圖1：雌激素和孕酮誘導(dǎo)的WBP2在Tyrl92和Tyr231處經(jīng)由EGFR串話(cross-talk)的酪氨酸磷酸化A：將血清饑餓的細(xì)胞用50ng/mlEGF(E)刺激5min，或者將去除激素的細(xì)胞用l0nM雌激素(E2)或100nM孕酮(P4)刺激24hr，用/不用10μΜ易瑞沙(Ir)預(yù)處理lhr。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。B：將HeLa用EGFR與V5標(biāo)記的WT-WBP2或單個(gè)Y→F突變體共轉(zhuǎn)染。C：將HeLa用EGFR與V5標(biāo)記的野生型、WBP2的各個(gè)單突變體(Y192F、Y231F、Y253F)或雙突變體(Y192-231F)共轉(zhuǎn)染。對于實(shí)驗(yàn)B和C，轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓過夜并用50ng/mlEGF刺激5min。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。D：將血清饑餓的MCF7用50ng/mlEGF(E)刺激5min，或者將去除激素的細(xì)胞用l0nM雌激素(E2)或100nM孕酮(P4)刺激24hr，有/無10μΜ易瑞沙(Ir)預(yù)處理lhr。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。E：將HeLa用EGFR與V5標(biāo)記的WT-WBP2或單個(gè)Y→F突變體共轉(zhuǎn)染。F：將HeLa用EGFR與V5標(biāo)記的WT-WBP2、WBP2的各個(gè)單突變體(Y192F、Y231F、Y253F)或雙突變體(Y192-231F)共轉(zhuǎn)染。對于實(shí)驗(yàn)B和C，轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓過夜并用50ng/mlEGF刺激5min。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。G：將MCF7用V5標(biāo)記的WT-WBP2或Y192-231F-WBP2突變體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24hr，將血清饑餓的MCF7用50ng/mlEGF(E)刺激5min，或者將去除激素的細(xì)胞用l0nM雌激素(E2)或l00nM孕酮(P4)刺激24hr。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析?！癘”表示“未處理/媒介物處理”。圖2：通過c-Src調(diào)節(jié)WBP2酪氨酸磷酸化A：將HeLa用EGFR與WBP2的V5標(biāo)記的WT或單個(gè)Y→F突變體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓并用50ng/mlEGF刺激5min，用/不用10μΜ易瑞沙或1μΜAZD0530預(yù)處理lhr。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。B：在Src-DN過表達(dá)的存在或不存在下，將HeLa用EGFR與WBP2的V5標(biāo)記的WT或單個(gè)Y→F突變體共轉(zhuǎn)染。C：將HeLa用(a)WBP2；(b)WBP2和EGFR；(c)WBP2和野生型(WT)Src；(d)WBP2和組成型活化的(CA)Src；(e)WBP2、EGFR和WT-Src；(f)WBP2、EGFR和CA-Src；(g)Y192-231F、EGFR和WT-Src共轉(zhuǎn)染。對于實(shí)驗(yàn)B和C，轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓過夜并用50ng/mlEGF刺激5min。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。D：將HeLa用EGFR與WBP2的V5標(biāo)記的WT或單個(gè)Y→F突變體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓并用50ng/mlEGF刺激5min，用/不用10μΜ易瑞沙或1μΜAZD0530預(yù)處理lhr。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。E：在Src-DN-K295M過表達(dá)的存在或不存在下，將HeLa用EGFR與WBP2的V5標(biāo)記的WT或單個(gè)Y→F突變體共轉(zhuǎn)染。F：將HeLa用(a)WBP2；(b)WBP2和EGFR；(c)WBP2和野生型(WT)Src；(d)WBP2和組成型活化的(CA)Src-Y529F；(e)WBP2、EGFR和WT-Src；(f)WBP2、EGFR和CA-Src；(g)Y192-231F、EGFR和WT-Src共轉(zhuǎn)染。對于實(shí)驗(yàn)B和C，轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓過夜并用50ng/mlEGF刺激5min。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。G：將MCF7用V5標(biāo)記的WBP2與陰性對照siRNA、c-YessiRNA或c-SrcsiRNA共轉(zhuǎn)染。對于這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓過夜并用50ng/mlEGF刺激5min。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。圖3：通過c-Yes調(diào)節(jié)WBP2酪氨酸磷酸化A：將HeLa用(a)WBP2；(b)WBP2/Y192-231F和EGFR；(c)WBP2/Yl92-231F和野生型(WT)Yes；(d)WBP2Y192-231F、EGFR和WT-Yes；(e)WBP2/Y192-231F和組成型活化的(CA)Yes-Y357F；(f)WBP2/Y192-231F、EGFR和CA-Yes共轉(zhuǎn)染。B：將HeLa用V5標(biāo)記的WBP2與陰性對照siRNA、c-SrcsiRNA或c-YessiRNA共轉(zhuǎn)染。對于這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓過夜并用50ng/mlEGF刺激5min。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。A：將HeLa用(a)WBP2；(b)WBP2Y192-231F和EGFR；(c)WBP2/Y192-231F和野生型(WT)Yes；(d)WBP2/Y192-231F、EGFR和WT-Yes；(e)WBP2/Y192-231F和組成型活化的(CA)Yes-Y537F；(f)WBP2/Y192-231F、EGFR和CA-Yes共轉(zhuǎn)染。B：將HeLa用V5標(biāo)記的WBP2與陰性對照siRNA、c-YessiRNA或c-SrcsiRNA共轉(zhuǎn)染。對于這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞血清饑餓過夜并用50ng/mlEGF刺激5min。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB分析。圖4：WBP2的酪氨酸磷酸化通過調(diào)節(jié)其核進(jìn)入以及與ERα的相互作用來增強(qiáng)其在ERα活性中的共激活功能A：將去除激素的MCF7或T47D用載體、WBP2-WT或WBP2-Y192-231F突變體以及ERE/PRE-螢光素酶報(bào)道構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞不作處理，或者(a)用50ng/mlEGF刺激5min，(b)用l0nME2/100nMP4處理24hr，(c)用E2/P4和EGF刺激，存在或不存在用10μΜ易瑞沙(Ir)預(yù)處理1hr。然后測定各種條件中的ERa/PR反式激活的螢光素酶活性。**P<0.01，***P<0.001，學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。B：將T47D去除激素并用10nME2刺激所示時(shí)間(0-24hr)，存在或不存在用10μΜ易瑞沙(Ir)預(yù)處理1hr。C：將WT-WBP2或Y192-231F突變體轉(zhuǎn)染的T47D去除激素，然后用l0nME2刺激24hr。對于實(shí)驗(yàn)B和C，然后收獲細(xì)胞用于亞細(xì)胞分級(jí)分離為核和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分，所述級(jí)分用于用所示抗體IB/IP分析。組蛋白2A和GADPH分別用作核和細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物。D：將去除激素的MCF7用WT-WBP2或Y192-231F突變體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞用l0nME2刺激24hr。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB(對照IgG或WBP2抗體)分析。E：將去除激素的MCF7或T47D用載體、WBP2-WT或WBP2-Y192-231F突變體以及ERE/PRE-螢光素酶報(bào)道構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞不作處理，或者用l0nME2/100nMP4刺激24hr，存在或不存在用10μΜ易瑞沙(Ir)預(yù)處理lhr。然后測定各種條件中ERD(上圖)/PR(下圖)反式激活的螢光素酶活性，相對于媒介物處理的載體對照分析。**P<0.01，***P<0.001，學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。F：將T47D去除激素并用l0nME2處理所示時(shí)間(0-24hr)。G：將WT-WBP2或Y192-231F突變體轉(zhuǎn)染的T47D去除激素，然后用l0nME2刺激24hr。對于實(shí)驗(yàn)B和C，然后收獲細(xì)胞用于亞細(xì)胞分級(jí)分離為核和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分，所述級(jí)分用于用所示抗體IB/IP分析。組蛋白2A和GADPH分別用作核和細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物。H：將去除激素的MCF7用WT-WBP2或Y192-231F突變體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞用l0nME2刺激24hr。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IP/IB(對照IgG或WBP2抗體)分析。I：將去除激素的MCF7用載體、WBP2-WT或WBP2-Y192-231F突變體以及ERE-螢光素酶報(bào)道構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞不作處理，或者用50ng/mlEGF刺激5min。然后測定各種條件中ERa反式激活的螢光素酶活性，相對于媒介物處理的載體對照分析。J：E2-應(yīng)答的靶基因-細(xì)胞周期蛋白Dl蛋白表達(dá)通過WBP2的酪氨酸磷酸化來調(diào)節(jié)。將去除激素的載體、WBP2-WT或WBP2-Y192-231F突變體-表達(dá)MCF7用10nM的E2刺激。全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IB分析。K：T47D中在EGF刺激時(shí)核中酪氨酸磷酸化的WBP2。將T47D血清饑餓過夜并用50ng/ml的EGF刺激0-4hr。然后收獲細(xì)胞用于亞細(xì)胞分級(jí)分離為核和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分，所述級(jí)分用于用所示抗體IB/IP分析。組蛋白2A和GADPH分別用作核和細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物。L：MDA-MB231中在EGF刺激時(shí)核中酪氨酸磷酸化的WBP2。將MDA-MB231血清饑餓過夜并用50ng/ml的EGF刺激所示時(shí)間(0-24hr)。然后收獲細(xì)胞用于亞細(xì)胞分級(jí)分離為核和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分，所述級(jí)分用于用所示抗體IB/IP分析。組蛋白2A和GADPH分別用作核和細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物。M：EGF刺激的WBP2的核進(jìn)入受其缺陷的酪氨酸磷酸化影響。將WT-WBP2或Y192-231F突變體轉(zhuǎn)染的T47D(a)血清饑餓，然后用50ng/ml的EGF刺激5min。然后將細(xì)胞亞細(xì)胞分級(jí)分離為核和細(xì)胞質(zhì)級(jí)分，所述級(jí)分用于用所示抗體IB/IP分析。組蛋白2A和GADPH分別用作核和細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物。圖5：WBP2磷酸化在E2介導(dǎo)的乳腺癌生物學(xué)中的作用將MCF7用載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E或WBP2-Y192-231F轉(zhuǎn)染，并且在l0nME2的存在或不存在下于所示時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞增殖(A)、貼壁不依賴性生長(A)、傷口愈合(B)趨化性(B)和侵襲(B)測定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。C：在2D培養(yǎng)和在EMT標(biāo)記—ZO-2和E-鈣粘著蛋白上進(jìn)行的免疫熒光中形態(tài)學(xué)檢測載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-231F突變體表達(dá)MCF7。D：示出在MCF7的穩(wěn)定藥物選擇池中外源表達(dá)WBP2的WT、Y192-231E突變體和Y192-231F突變體的免疫印跡。將MCF7用pCEP4、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突變體和WBP2-Y192-231F突變體轉(zhuǎn)染，用潮霉素選擇3周，并且將抗性克隆收集和擴(kuò)大。使這4種MCF7的WBP2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子在l0nME2的存在或不存在下于所示時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞增殖(E)、貼壁不依賴性生長(F)、傷口愈合(G)趨化性(H)和侵襲(I)測定。所有數(shù)據(jù)相對于在第0天或0hr的媒介物處理的載體對照進(jìn)行比較。J：還在2D培養(yǎng)(上圖)以及在EM標(biāo)記J-鈣粘著蛋白(中圖)和ZO-2(下圖)上進(jìn)行的免疫熒光中形態(tài)學(xué)檢測它們。J：用4種MCF7的WBP2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子在裸鼠中進(jìn)行異種移植研究，并且在第22天評(píng)價(jià)和測量腫瘤形成。左圖和右圖分別示出用不同穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子注射的每只小鼠的腫瘤體積分布和平均腫瘤體積；I：示出在MCF10A的穩(wěn)定藥物選擇池中外源表達(dá)WBP2的WT和Y192-231D突變體的免疫印跡(左圖)。在2D培養(yǎng)(中圖)中形態(tài)學(xué)檢測它們，并且使它們進(jìn)行貼壁不依賴性軟瓊脂生長(右圖)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。圖6：磷酸化WBP2介導(dǎo)的乳腺癌生物學(xué)的潛在機(jī)制A：將來自載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突變體和WBP2-Y192-231F突變體表達(dá)MCF7或者具有WBP2敲低的Y192-231E突變體表達(dá)MCF7的全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IB分析。B：將載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突變體或WBP2-Y192-231F突變體表達(dá)MCF7用TOPFlash(上圖)或ERE-螢光素酶(下圖)報(bào)道構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。對于共轉(zhuǎn)染ERE-螢光素酶的細(xì)胞，將它們不作處理或者用50ng/mlWnt3a配體刺激16hr。然后測定各種條件中的TCF/ERa螢光素酶活性。**P<0.01，***P<0.001，學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。C：將載體或WBP2-Y192-231E突變體表達(dá)MCF7用所示濃度的他莫昔芬(Tam)和/或FH535處理。測量細(xì)胞數(shù)目。D：在處理后第2-4天收獲來自用2μΜTam和/或15μΜF(xiàn)H5353處理的WBP2-Y192-231E突變體表達(dá)MCF7的全細(xì)胞裂解物并用于用所示抗體IB分析。圖7WBP2-Y192和Y231的序列在藍(lán)色□中突出。紅色方框指示PY基序1、2和3。這些突出顯示和方框不在原圖中。使用這個(gè)代替圖8WBP2序列衍生的肽的原型(prototype)的構(gòu)建。最初，肽包含所有PY基序和酪氨酸位點(diǎn)。如果這些肽具有抗WBP2和抗乳腺癌功能，則將它們細(xì)化(即，縮短)以確定仍然保留期望活性的最短的可能的肽。NLS-使肽轉(zhuǎn)入核的核定位信號(hào)。圖9WBP2和磷酸化對腫瘤生長的影響的異種移植研究，將表達(dá)載體對照、WBP2、Y192-231E磷酸化模擬(phosphomimic)和Y192-231F磷酸化缺陷突變體的5×106個(gè)MCF7細(xì)胞注射入Balb/c裸鼠的脅腹，并且在3周后于第22天和第32天測量腫瘤體積。上圖示出在第22天和第32天用不同穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子注射的每只小鼠的腫瘤體積分布。下圖(左和右)示出用不同穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子注射的小鼠產(chǎn)生的平均腫瘤體積。星號(hào)指示基于學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)分析，相對于載體對照的統(tǒng)計(jì)顯著差異。(*指p<0.05，而**指p<0.01)圖10MCF10A中WBP2和Y192-231D磷酸化模擬突變體的過表達(dá)以及它們的功能研究，左上：示出在MCF10A的穩(wěn)定藥物選擇池中外源表達(dá)WBP2的WT和Y192-231D突變體的免疫印跡。右上：在2D培養(yǎng)中形態(tài)學(xué)檢測細(xì)胞。使細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖測定(左下)、貼壁不依賴性軟瓊脂生長測定(中下)和細(xì)胞侵襲測定(右下)。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001，學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。圖11與MCF10A中WBP2過表達(dá)和酪氨酸磷酸化相關(guān)的蛋白表達(dá)和/或活性變化，將來自載體、WBP2-WT和WBP2-Y192-231D-表達(dá)MCF10A的全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體免疫印跡分析。圖12HM-1未分化的對分化的小鼠胚胎干細(xì)胞中WBP2的表達(dá)圖13在體內(nèi)WBP2酪氨酸磷酸化的消除破壞WBP2-TAZ相互作用，將293細(xì)胞用Flag-TAZ與載體、WBP2-WT、磷酸化模擬Y192-231E或磷酸化缺陷Y192-231F突變體共轉(zhuǎn)染，并且在50ng/mlEGF的存在或不存在下刺激。利用V5抗體將WBP2免疫沉淀，然后將免疫沉淀物用共免疫沉淀的Flag-TAZ探測。圖14WBP2過表達(dá)和酪氨酸磷酸化激活E2F活性，將載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-231F-表達(dá)MCF7用E2F報(bào)道構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48hr，測定螢光素酶活性并針對組成型TK啟動(dòng)子海腎螢光素酶活性歸一化。結(jié)果表示為載體的倍數(shù)。圖15WBP2過表達(dá)或酪氨酸磷酸化激活細(xì)胞周期發(fā)展。將表達(dá)WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-231F的MCF7細(xì)胞用BrdU脈沖30分鐘。48小時(shí)后收獲細(xì)胞。用抗BrdU熒光抗體然后流式細(xì)胞術(shù)檢測摻入的BrdU(左)。條形圖(右)示出BrdU陽性細(xì)胞的百分比。圖16過表達(dá)WBP2及其phoshomimic突變體的MCF7細(xì)胞中E2F蛋白上調(diào)。將來自載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-231F-表達(dá)MCF7的全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體免疫印跡分析。圖l7在表達(dá)WBP2-Y192-231E的MCF7細(xì)胞上敲低E2F1和E2F3的效果。A.將表達(dá)WBP2-Y192-231E的MCF7細(xì)胞用所示siRNA轉(zhuǎn)染，并且利用蛋白印跡證實(shí)敲低效率。B.將細(xì)胞用所示siRNA和E2F報(bào)道質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染并在48小時(shí)后收獲用于螢光素酶測定。將螢光素酶讀數(shù)針對組成型TK啟動(dòng)子海腎螢光素酶讀數(shù)歸一化。C.將細(xì)胞用所示siRNA轉(zhuǎn)染并進(jìn)行BrdU摻入測定。將BrdU陽性細(xì)胞相對于對照siRNA處理的細(xì)胞的百分比作圖為條形圖。D.將細(xì)胞用所示siRNA轉(zhuǎn)染。在第3天進(jìn)行MTS測定。將相對于對照siRNA處理的細(xì)胞的細(xì)胞增殖百分比作圖為條形圖。圖18將來自載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突變體和WBP2-Y192-231F突變體表達(dá)MCF7(A)或者具有WBP2敲低的Y192-231E突變體表達(dá)MCF7(B)的全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IB分析。它們的表達(dá)水平在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中定量，并且平均值相對于肌動(dòng)蛋白來表示。代表性印跡(圖中從左至右的順序：載體、WBP2、Y192-231E、Y192F)呈現(xiàn)為條形圖的嵌圖。**P<0.01，***P<0.001，相對于載體的學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。將載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突變體或WBP2-Y192-231F突變體表達(dá)MCF7用TOPFlash(C)或ERE-螢光素酶(D)報(bào)道構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。對于共轉(zhuǎn)染ERE螢光素酶的細(xì)胞，將它們不作處理或者用50ng/mlWnt3a配體刺激16hr。然后測定各種條件中的TCF(C)/ERD(D)螢光素酶活性，并且相對于未處理的載體對照進(jìn)行分析。**P<0.01，***P<0.001，學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。E：將載體或WBP2-Y192-231E突變體表達(dá)MCF7用所示濃度的2DM他莫昔芬(Tam)和/或15DMFH535處理4天。每天測量細(xì)胞數(shù)目并相對于第0天的媒介物處理的載體表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行比較。F：將載體或WBP2-Y192-231E突變體表達(dá)MCF7用所示濃度(0-50DM)的FH535處理2天。測量細(xì)胞數(shù)目并相對于媒介物處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析它們的IC50。G：在處理后第2-4天收獲來自用2μΜTam和/或15μΜF(xiàn)H5353處理的WBP2-Y192-231E突變體表達(dá)MCF7的全細(xì)胞裂解物并用于用所示抗體IB分析。H：將載體或WBP2-Y192-231E突變體表達(dá)MCF7用所示濃度的100nM氟維司群和/或15DMFH535處理4天。在第2天和第4天測量細(xì)胞數(shù)目，并且相對于每天測量的媒介物處理的對照進(jìn)行比較(上圖)。收獲這些處理的細(xì)胞用于用所示抗體IB分析(下圖)。圖19將來自載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E突變體和WBP2-Y192-231F突變體表達(dá)MCF7(A)或者具有WBP2敲低的Y192-231E突變體表達(dá)MCF7(B)的全細(xì)胞裂解物用于用所示抗體IB分析。它們的表達(dá)水平在3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中定量，并且平均值相對于肌動(dòng)蛋白來表示。代表性印跡(圖中從左至右的順序：載體、WBP2、Y192-231E、Y192F)呈現(xiàn)為條形圖的嵌圖。**P<0.01，***P<0.001，相對于載體的學(xué)生t-檢驗(yàn)(2-尾)。具體實(shí)施方式本技術(shù)涉及發(fā)現(xiàn)WBP-2上的2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，已證實(shí)所述位點(diǎn)：1.調(diào)節(jié)其ER、TCF/b-連環(huán)蛋白和E2F共激活功能2.調(diào)節(jié)WBP2的核易位3.影響乳腺癌生物學(xué)(在EMT、細(xì)胞增殖和侵襲方面)用適體或抗體如單克隆抗體或多克隆抗體或特異性探針或引物檢測在WBP2(SEQIDNO.1)的位點(diǎn)特異性位置Y192或Y129和Y231處的磷酸化可以用來診斷癌癥或癌癥的合適的療法的預(yù)后。此外，干擾SEQIDNO.1.的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物質(zhì)可以用作癌癥的合適治療。在一實(shí)施方案中，所述癌癥為乳腺癌。在另一實(shí)施方案中，所述癌癥為肺癌。所述技術(shù)適合依賴于EGFR、c-Src、c-Yes、ER、Wnt或E2F的其他癌癥如肝癌；頭部和頸部癌癥；結(jié)腸直腸癌；骨癌以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他癌癥。SEQIDNO.1:MALNKNHSEGGGVrVNNTESILMSYDHVELTFNDMKNVPEAFKGTKKGTVYLTPYRVIFLSKGKDAMQSFMMPFYLMKDCEIKQPVFGANYIKGTVKAEAGGGWEGSASYKLTFTAGGAIEFGQRMLQVASQASRGEVPSGAYGYSYMPSGAYVYPPPVANGMYPCPPGWYPPPPPEFWGPPMMDGAMGY*VQPPPPPYPGPMEPPVSGPDVPSTPAAEAKAAEAAASAY*YNPGNPHNVYMPTSQPPPPPYYPPEDKKTQ用物質(zhì)干擾Y192處的WBP2酪氨酸磷酸化或者干擾Y192和Y231處的WBP2酪氨酸磷酸化可以減緩或阻止癌癥發(fā)展。實(shí)施方案包括所述物質(zhì)可以減緩或阻止乳腺癌或肺癌發(fā)展。優(yōu)選的干擾物質(zhì)可以包括：單克隆抗體、肽、小分子、設(shè)計(jì)為抑制WBP2的表達(dá)的siRNA如siWBP-2；干擾WBP2的Y192磷酸化或者WBP2上的Y192和Y231磷酸化的適體或其他試劑，用于乳腺癌治療。WBP2作為癌癥的藥物靶標(biāo)和生物標(biāo)記物我們已鑒定WBP2為EGF/EGFR和E2/ER信號(hào)傳導(dǎo)的下游靶標(biāo)。我們還已鑒定c-Yes和c-Src酪氨酸激酶為推定的WBP2的上游激酶并且因此可以調(diào)節(jié)WBP2活性和功能。我們已鑒定WBP2在Y192和Y231處磷酸化，并且顯示W(wǎng)BP2表達(dá)和磷酸化賦予生長因子獨(dú)立性，導(dǎo)致ER+乳腺癌的生長、增殖、遷移和侵襲增加。利用siRNA和shRNA沉默WBP2可以在體外消除三陰性乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括增殖、生長、遷移和侵襲。我們發(fā)現(xiàn)Y192和Y231處的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)WBP2功能、定位以及與靶蛋白如ER和可能的其他癌基因/腫瘤抑制物的相互作用。我們示出WBP2及其酪氨酸磷酸化激活的ER、TCF/b-連環(huán)蛋白和E2F轉(zhuǎn)錄活性。我們提供證據(jù)，WBP2在轉(zhuǎn)錄活性激活中的作用是由于但不必限于WBP2介導(dǎo)的多個(gè)癌基因的表達(dá)上調(diào)和有時(shí)激活，所述多個(gè)癌基因包括c-myc、wnt3a、b-連環(huán)蛋白、c-yes、YAP、ER、BCL2和其他轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，包括金屬蛋白酶。WBP2還抑制腫瘤抑制物以及其他生長調(diào)節(jié)物如p21和p16的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞和組織相比，WBP2在乳腺癌細(xì)胞系和組織中過表達(dá)。從約376個(gè)臨床樣品，我們發(fā)現(xiàn)3/4或更多的非癌組織(正常、增生和良性)具有不可檢測水平的核WBP2，而大部分癌組織(導(dǎo)管原位癌、侵襲性癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥)具有中等至高核水平的WBP2。我們已從體外乳腺癌細(xì)胞系的研究示出，核WBP2是Y192/231處酪氨酸磷酸化的，而胞漿WBP2大部分是非磷酸化的。在不同研究中已證實(shí)WW-結(jié)合蛋白2(WBP2)為酪氨酸激酶底物，激活ERaPR轉(zhuǎn)錄并在乳腺癌中起作用。然而，WBP2酪氨酸磷酸化在調(diào)節(jié)ER功能和乳腺癌生物學(xué)中的作用是未知的。這里，我們確定WBP2為雌激素信號(hào)傳導(dǎo)經(jīng)由EGFR串話的酪氨酸磷酸化靶標(biāo)。使用顯性失活的、組成型活化的突變體、RNAi和藥理學(xué)研究，我們證實(shí)WBP2在Tyr192和Tyr231處的磷酸化可以通過c-Src和c-Yes激酶來調(diào)節(jié)。我們進(jìn)一步證實(shí)消除WBP2磷酸化修復(fù)>60%的ERa報(bào)道活性，據(jù)推定這是通過阻斷WBP2的核進(jìn)入及其與ERa的相互作用。與載體對照相比，MCF7中WBP2及其磷酸化模擬突變體的過表達(dá)導(dǎo)致小鼠中較大的腫瘤，誘導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞粘附的喪失，以雌激素依賴性和不依賴性方式增加細(xì)胞增殖、貼壁不依賴性生長、遷移和侵襲，這些事件基本上可以通過磷酸化缺陷突變體的過表達(dá)來消除。表達(dá)WBP2磷酸化模擬突變體的細(xì)胞的激素不依賴性與升高的ERa和Wnt報(bào)道活性有關(guān)。Wnt/3-連環(huán)蛋白抑制物FH535比他莫昔芬和氟維司群更顯著地阻斷磷酸化WBP2介導(dǎo)的癌細(xì)胞生長，部分是通過誘導(dǎo)ERa的表達(dá)。Wnt途徑可能是WBP2介導(dǎo)的乳腺癌生物學(xué)中的重要組分。因此，本發(fā)明的一方面包括一種檢測患者的癌癥的方法，所述方法包括以下步驟：c)測量在分離自患者的第一樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量；以及d)將樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量與分離自正常的非癌性細(xì)胞的第二樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量進(jìn)行比較，其中相對于第二樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量，第一樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量的增加指示在第一樣品中存在癌癥。優(yōu)選地，第一和第二樣品中在Y192處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量還檢測在SEQIDNo.1的多肽的Y231處酪氨酸的磷酸化，其中相對于第二樣品中在Y192和Y231處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量，第一樣品中在Y192和Y231處具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量的增加指示在第一樣品中存在癌癥。優(yōu)選地，所述癌癥為乳腺癌和肺癌。優(yōu)選地，用僅當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在酪氨酸Y192或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)特異性結(jié)合SEQID.NO.1的WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白的分離的磷酸化位點(diǎn)特異性抗體測量具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量，其中當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在所述酪氨酸處未磷酸化時(shí)所述抗體不結(jié)合SEQIDNo.1的多肽。優(yōu)選地，所述方法還包括以下步驟：c)使SEQIDNo.1的多肽與多核苷酸探針或引物接觸，所述多核苷酸探針或引物包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列僅當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在酪氨酸Y192或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)在合適的雜交條件下能夠選擇性地雜交至SEQIDNo.1的多肽；以及d)檢測所述探針或引物與在所述酪氨酸處磷酸化的SEQIDNo.1的多肽之間形成的任何雙鏈體。6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中用僅當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在酪氨酸Y192或Y231或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)特異性結(jié)合SEQID.NO.1的WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白的分離的磷酸化位點(diǎn)特異性適體測量具有磷酸化的酪氨酸的SEQIDNo.1的多肽的量，其中當(dāng)SEQIDNo.1的多肽在所述酪氨酸處未磷酸化時(shí)所述適體不結(jié)合SEQIDNo.1的多肽。本發(fā)明的另一方面包括干擾SEQIDNO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述物質(zhì)包含僅在SEQIDNo.1的多肽于酪氨酸Y192、Y231或酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)特異性結(jié)合SEQID.NO.1的WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白的分離的磷酸化位點(diǎn)特異性抗體，其中所述抗體在所述酪氨酸未磷酸化時(shí)不結(jié)合SEQIDNo.1的多肽。優(yōu)選地，所述抗體是包含免疫球蛋白重鏈的免疫球蛋白。優(yōu)選地，所述抗體是包含免疫球蛋白輕鏈的免疫球蛋白。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白是IgG1κ免疫球蛋白。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白在免疫球蛋白的重鏈內(nèi)包含人IgG1恒定區(qū)，并且在免疫球蛋白的輕鏈內(nèi)包含人恒定區(qū)。在一實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白在重鏈內(nèi)和輕鏈內(nèi)包含完整的或部分的人框架區(qū)。在一實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白在重鏈內(nèi)和輕鏈內(nèi)包含鼠框架區(qū)。在一實(shí)施方案中，所述物質(zhì)可以是細(xì)化(refined)的肽，其基于磷酸化的酪氨酸Y192或、Y231或Y192和Y231或PY1、PY2和/或PY3兩側(cè)的序列。細(xì)化所述肽的方法描述于圖8。由此WBP2序列衍生的肽的原型的構(gòu)建包括磷酸化的酪氨酸Y192或、Y231或Y192和Y231以及磷酸化的酪氨酸Y192或、Y231或Y192和Y231任一側(cè)的氨基酸。最初，肽包含所有PY基序和酪氨酸位點(diǎn)。如果這些肽具有抗WBP2和抗乳腺癌功能，則將它們細(xì)化(即，縮短)以確定仍然保留期望活性的最短的可能的肽。所述肽還包括核定位信號(hào)(NLS)以允許它們能夠使該肽轉(zhuǎn)入核。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的NLS是合適的，在實(shí)例中使用的NLS具體是(PKKKRKV)。有義：5'-CCCAAGAAGAAGCGAAAGGTC-3'反義：5'-GACCTTTCGCTTCTTCTTGGG-3'所述肽的實(shí)例包括：SEQIDNO.3[NLS]-PPGYPPPYPPPYSEQIDNO.4PPGYPPPYPPPY-[NLS]SEQIDNO.5[NLS]-YVQPPPPPYPGPMEPPVSGPDVPSTPAAEAKAAEAAASAYSEQIDNO.6YVQPPPPPYPGPMEPPVSGPDVPSTPAAEAKAAEAAASAY-[NLS]優(yōu)選地，所述抗體能夠在細(xì)胞系中產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述物質(zhì)包含僅在SEQIDNo.1的多肽于酪氨酸Y192或者酪氨酸Y192和酪氨酸Y231處磷酸化時(shí)特異性結(jié)合SEQID.NO.1的WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白的分離的磷酸化位點(diǎn)特異性適體，其中所述適體在所述酪氨酸未磷酸化時(shí)不結(jié)合SEQIDNo.1的多肽。在一實(shí)施方案中，所述物質(zhì)包含小干擾RNA如SEQIDNO.2(5'-AGCAUCCGCUGUCCGAACUCAAUGG-3')。本發(fā)明的另一方面包括本發(fā)明的物質(zhì)，其用于治療癌癥。優(yōu)選地，本發(fā)明的物質(zhì)用于治療乳腺癌和肺癌。優(yōu)選地，本發(fā)明的物質(zhì)還包含式1的FH535化合物本發(fā)明的另一方面包括包含本發(fā)明的物質(zhì)和式1的FH535化合物的組合物本發(fā)明的另一方面包括一種治療患有癌癥的患者的方法，所述方法包括以下步驟：(a)向患者施用干擾SEQIDNO.1的多肽中酪氨酸Y192和/或Y231的磷酸化的物質(zhì)。我們建議測量核WBP2表達(dá)作為更準(zhǔn)確的癌癥診斷和預(yù)后的方法。WBP2為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，并且核WBP2的異常表達(dá)可能是乳腺癌的致病機(jī)制。我們公開WBP2的2個(gè)磷酸化位點(diǎn)-Y231和Y192，此外顯示這2個(gè)酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化調(diào)節(jié)乳腺癌生物學(xué)。WBP2的核表達(dá)水平可以用作癌癥的診斷或預(yù)后生物標(biāo)記物，特別是乳腺癌。WBP2的檢測試劑盒可以用于乳腺癌的早期檢測/篩查，乳房造影術(shù)后組織病理學(xué)不確定病例或可疑病例的確認(rèn)，所述試劑盒基于核酸、抗體、適體或其他試劑?？俉BP2或WBP2的核表達(dá)還可以用來預(yù)測對藥物的應(yīng)答。磷酸化位點(diǎn)特異性抗體、適體或其他試劑可以用來檢測磷酸化的WBP2作為乳腺癌或來自其他來源的癌癥中的診斷或預(yù)后特征。我們的數(shù)據(jù)支持這個(gè)，數(shù)據(jù)顯示W(wǎng)BP2是EGFR、Src和Yes的磷酸化靶標(biāo)。因?yàn)橐褕?bào)道這些酪氨酸激酶在許多人癌癥中在表達(dá)或活性方面異常，這意味著具有任何這些激酶活性升高的任何癌癥可能具有增加的WBP2磷酸化。通過任何方法(包括但不限于RNAi和小分子)調(diào)節(jié)WBP2表達(dá)可以用來單獨(dú)或與其他靶標(biāo)聯(lián)合阻斷癌癥生長、增殖、遷移、侵襲或轉(zhuǎn)移。siRNA的實(shí)例為SEQIDNO.2:5'-AACGTGCCAGAAGCCTTCAAACCTGTCTC-3'。有效組合物的實(shí)例為干擾Y192和Y231處WBP2酪氨酸磷酸化的物質(zhì)以及式1的FH535的化合物Aβ-連環(huán)蛋白/Tcf抑制物，F(xiàn)H535，分子式：Ci3HioCl2N204S，分子量：361.2g/mol。干擾WBP2在Y192和Y231處的酪氨酸磷酸化或者WBP2核定位可以用來直接或者通過調(diào)節(jié)其他癌基因和腫瘤抑制物的表達(dá)或功能來阻斷乳腺癌生長、增殖、遷移、侵襲和/或轉(zhuǎn)移。除了小分子，我們建議包含PY基序和/或Y192和Y231兩側(cè)以及包括Y192和Y231的序列的蛋白序列可以用來阻斷WBP2磷酸化，因此單獨(dú)或與其他治療策略聯(lián)合用于乳腺癌治療。我們還建議除PY基序、Y192和Y231以外的衍生自WBP2的序列可以單獨(dú)或者互相或與其他治療策略聯(lián)合用于乳腺癌治療。我們的數(shù)據(jù)提供直接的科學(xué)證據(jù)：i)通過至少2個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中的過表達(dá)和敲低研究提供WBP2的作用，以及ii)2個(gè)酪氨酸位點(diǎn)對乳腺癌生物學(xué)的作用。對于后者，我們顯示2個(gè)酪氨酸位點(diǎn)的突變減少乳腺癌細(xì)胞中乳腺癌生物學(xué)的各方面。因?yàn)槔野彼崃姿峄梢宰钄喟┌Y生物學(xué)中的WBP2功能，所以這2個(gè)位點(diǎn)是靶向癌癥療法的有效位點(diǎn)。WBP2表達(dá)可以令人信服地用作生物標(biāo)記物。然而，因?yàn)楸磉_(dá)不必與活性相關(guān)，所以需要疾病表型的更重要的決定因素。因此，毫無疑問檢測WBP2的磷酸化狀態(tài)可能是比僅其表達(dá)更相關(guān)(因此更好)的診斷特征。我們的數(shù)據(jù)顯示W(wǎng)BP2是ER、EGFR、Src、Yes的磷酸化靶標(biāo)。這些全部是已報(bào)道在許多人類癌癥中在表達(dá)或活性方面異常的酪氨酸激酶。這意味著具有任何這些激酶活性升高的任何癌癥可能具有增加的WBP2磷酸化。因此，磷酸化位點(diǎn)特異性抗體的應(yīng)用延伸至乳腺癌以外。事實(shí)上，我們的數(shù)據(jù)顯示核WBP2(即，WBP2的功能形式)是酪氨酸磷酸化的，而大量WBP2(優(yōu)選非功能形式)位于胞質(zhì)部分中。這意味著磷酸化特異性WBP2抗體會(huì)檢測WBP2的核/活性形式，與非磷酸化特異性WBP2抗體識(shí)別的非活性形式相比，所述WBP2的核/活性形式與癌癥更相關(guān)。還已檢測到WBP2的表達(dá)水平在正常肺細(xì)胞中比在一組肺癌細(xì)胞系中低。在一些肺癌細(xì)胞系中，據(jù)發(fā)現(xiàn)WBP2在酪氨酸殘基處組成型磷酸化。雖然已證實(shí)轉(zhuǎn)錄共激活蛋白WBP2激活ER/PR功能，但是其調(diào)節(jié)模式、對乳腺癌生物學(xué)的影響和深層機(jī)制是未知的。我們確定WBP2為雌激素信號(hào)傳導(dǎo)中經(jīng)由EGFR串話的酪氨酸磷酸化靶標(biāo)，c-Yes介導(dǎo)的WBP2在Tyr192和Tyr231處的磷酸化依賴于EGFR激活，而c-Src可以直接作用或是EGFR的上游。消除WBP2磷酸化通過阻斷核進(jìn)入以及WBP2與ERa的相互作用來損害其對ERa反式激活的共激活蛋白活性。MCF7中WBP2的野生型和磷酸化模擬突變體的過表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞粘附蛋白的喪失，以雌激素依賴性和不依賴性方式增加細(xì)胞增殖、貼壁不依賴性生長、遷移和侵襲，這些事件基本上可以通過磷酸化缺陷突變體的過表達(dá)來消除。磷酸化模擬WBP2有效激活Wnt途徑并增加Wnt介導(dǎo)的ERa功能的激活，這可能是通過上調(diào)ERa、3-連環(huán)蛋白和Wnt3a的表達(dá)。隨后證實(shí)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在WBP2介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖中至關(guān)重要。我們的發(fā)現(xiàn)使得分子上深入了解涉及WBP2、ERa和Wnt的復(fù)雜相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。WBP2加入乳腺癌越來越多涉及的核激素受體共激活蛋白的序列。優(yōu)選實(shí)施方案WBP2-一種新的乳腺癌中的磷酸化癌蛋白通過我們以前對人乳腺癌發(fā)展的MCF10AT異種移植衍生的等基因細(xì)胞系模型的磷酸化蛋白質(zhì)組(phosphoproteomics)篩選，首次在乳腺癌中牽涉WBP2(WW-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白2)，其中發(fā)現(xiàn)WBP2在乳腺癌發(fā)展期間差異性磷酸化。我們還證實(shí)其是EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的真正酪氨酸磷酸化靶標(biāo)。在后續(xù)研究中，我們發(fā)現(xiàn)WBP2表達(dá)在正常乳腺上皮細(xì)胞中低或不可檢測，但是在乳腺癌發(fā)展模型以及各種亞型的多種乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)。因此，我們的目的是通過WBP2的蛋白過表達(dá)和酪氨酸磷酸化來研究WBP2在人乳腺癌的生長和發(fā)展中的癌基因作用。我們首先作圖WBP2上的EGF依賴性酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，并且鑒定酪氨酸激酶的Src家族的成員為推定的WBP2的上游激酶。然后，我發(fā)現(xiàn)雌激素(E2)刺激可以相似地通過EGFR和ER途徑之間的串話誘導(dǎo)WBP2的酪氨酸磷酸化。亞細(xì)胞分級(jí)分離研究顯示在E2或EGF刺激時(shí)WBP2的磷酸化依賴性核進(jìn)入。與報(bào)道的WBP2作為核激素受體(ERaPR)的共激活蛋白的作用一致，消除WBP2上的酪氨酸磷酸化通過減少的E2/EGF刺激的WBP2的核進(jìn)入以及體內(nèi)的E2依賴性WBP2-ER相互作用顯著損害E2誘導(dǎo)的ER反式激活。ER陽性MCF7乳腺癌細(xì)胞中WBP2的野生型和磷酸化模擬突變體的穩(wěn)定過表達(dá)以E2不依賴性和/或E2依賴性方式增加其細(xì)胞增殖、在軟瓊脂中的粘附不依賴性生長、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲。這些細(xì)胞過程可以通過WBP2的磷酸化缺陷突變體至少部分抑制。將提出WBP2介導(dǎo)的癌基因轉(zhuǎn)化的潛在機(jī)制。我們還發(fā)現(xiàn)在ER陰性乳腺癌細(xì)胞，MDA-MB-231中穩(wěn)定敲低WBP2也顯著抑制乳腺癌細(xì)胞過程如生長、增殖、遷移和侵襲?？偟膩碚f，我們的發(fā)現(xiàn)揭示了WBP2作為新的ER+和ER-乳腺癌的磷酸化癌蛋白的潛力，可以相信WBP2和/或其酪氨酸磷酸化形式可以用作潛在的人乳腺癌以及其他癌癥類型如肺癌的預(yù)后標(biāo)記物或治療靶標(biāo)。材料和方法抗體通過NeoMPS,Inc，我們基于另一研究(11)中報(bào)道的17個(gè)氨基酸(N'-NDMKNVPEAFKGTKKGT-C)肽序列內(nèi)部產(chǎn)生了抗WBP2多克隆抗體，將其親和純化，并且通過在WBP2特異性和對照肽的存在下用免疫前血清比較免疫印跡，互相免疫沉淀外源表達(dá)的標(biāo)記的WBP2蛋白并用抗標(biāo)簽和抗WBP2抗體免疫印跡來嚴(yán)格證實(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)?？筗BP2小鼠單克隆抗體購自AbnovaCorp.,Taipei,Taiwan；抗PY20-HRP、抗EGFR、抗β-/3-連環(huán)蛋白和抗Yes小鼠單克隆抗體獲得自BD-Biosciences,SanDiego,CA,USA；抗肌動(dòng)蛋白-HRP、抗ERa、抗磷酸化ERa-Sl18、抗Src、抗細(xì)胞周期蛋白Bl、抗c-Myc、抗p21、抗pl6、抗p27、抗MMP2和抗ZO-2兔多克隆抗體，抗ERa和抗細(xì)胞周期蛋白Dl小鼠單克隆抗體，抗GADPH和抗波形蛋白山羊多克隆抗體獲得自SantaCruzBiotechnologyInc.,SantaCruz,CA,USA；抗磷酸化Src-Y416、抗EGFR、抗YAPl、抗組蛋白2A、抗E-鈣粘著蛋白、抗Wnt3a、抗GSK3、抗磷酸化GSK/3-S9、抗Bcl2、抗Akt和抗pERKl/2-Thr202/Tr204兔多克隆抗體，抗pAkt-S473和抗ERKl/2小鼠單克隆抗體獲得自CellSignalingTechnologyInc.,Danvers,MA,USA；抗V5小鼠單克隆抗體和抗V5-HRP獲得自InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA；抗Yes兔多克隆抗體獲得自Milliporecorp.,Billerica,MA,USA；抗磷酸化FAKl-Y397兔多克隆抗體獲得自Abeam,Cambridge,UK；抗小鼠、抗兔和抗山羊辣根過氧化物酶(HRP)綴合物購自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA。質(zhì)粒和報(bào)道基因野生型WBP2的cDNA來自O(shè)rigene(Rockville,MD)，并且將其亞克隆入pcDNATM6.2-Directional-載體和pCEP4(Invitrogen)。所有Y→F突變均利用QuikChangeIIXL位點(diǎn)定向誘變試劑盒(Stratagene)來產(chǎn)生。這些是饋贈(zèng)-來自SarahCourtneidge,EMBL的Src-野生型(WT)、組成型活化(CA)和顯性失活(DN)-pSGT；來自MariusSudol,Danville,PA,USA的Yes-WT和CA(Y357F)；來自DeanP.Edwards,Houston,TX,USA的2XERETATA-螢火蟲Luc和2XPRE-TATA-螢火蟲Luc；來自YoshiakiIto,Singapore的TOPFlash報(bào)道質(zhì)粒。pRL-TK購自Promega。野生型WBP2的cDNA來自O(shè)rigene,Rockville,MD,USA，并且將其亞克隆入pcDNATM6.2-Directional-載體和pCEP4(Invitrogen)。所有突變均利用QuikChangeIIXL位點(diǎn)定向誘變試劑盒(Stratagene,AgilentTechnologiesInc.,SantaClara,CA,USA)來產(chǎn)生。這些是饋贈(zèng)-來自SarahCourtneidge,EMBL,USA的Src-野生型(WT)、組成型活化(CA-Y529F)和顯性失活(DNK295M)-pSGT；來自MariusSudol,Danville,PA,USA的Yes-WT和CA(Y537F)；來自DeanP.Edwards,Houston,TX,USA的2XERE-TATA-螢火蟲Luc和2XPRE-TATA-螢火蟲Luc；來自YoshiakiIto,Singapore的TOPFlash報(bào)道質(zhì)粒。pRL-TK購自Promega,corp.,Madison,WI,USA。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染MCF7、MDA-MB231、T47D、HeLa和A431來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。將MCF7、HeLa和MDA-MB231維持在包含10%FBS(Hyclone)和100U青霉素/鏈霉素(Invitrogen)的RPMI1640(Sigma)中。將T47D維持在包含10%FBS、10μg/ml胰島素(Sigma)和100U青霉素/鏈霉素Pen/Strep的RPMI1640中。將A431維持在包含10%FBS和100U青霉素/鏈霉素的DMEM(Sigma)中。細(xì)胞系通過供應(yīng)者進(jìn)行的短串聯(lián)重復(fù)(STR)概括分析來鑒定。MCF7和T47DER陽性乳腺癌細(xì)胞系的ERa狀態(tài)通過蛋白印跡來鑒定已確定ERa表達(dá)，并且測試所有細(xì)胞均不含支原體。所有實(shí)驗(yàn)均在第1代至第10代之間進(jìn)行。根據(jù)制造商的說明書利用lipofectamine2000(Invitrogen)將60mm皿中的細(xì)胞用4μg質(zhì)粒/l00nMsiRNA轉(zhuǎn)染。配體和藥物處理對于所有涉及雌激素/孕酮(Sigma)的實(shí)驗(yàn)，在刺激之前將MCF7和T47D在包含5%活性炭-葡聚糖處理的FBS(Hyclone)的不含酚紅的RPMI1640(Sigma)中培養(yǎng)至少2天。EGF來自Millipore，Wnt3a配體來自R&Dsystems，他莫昔芬和FH535來自Sigma，而易瑞沙和AZD0530來自AstraZeneca。為了處理，每天補(bǔ)充新鮮的激素/藥物，持續(xù)超過1天。細(xì)胞裂解、SDS-PAGE和免疫印跡細(xì)胞培養(yǎng)、配體/藥物處理和裂解MCF7、MDA-MB231、T47D、HeLa和MCF10A來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。將MCF7、HeLa和MDA-MB231維持在包含10%FBS(Hyclone)和100U青霉素/鏈霉素(Invitrogen)的RPMI1640(Sigma)中。將T47D維持在包含10%FBS、10μg/ml胰島素(Sigma)和100U青霉素/鏈霉素的RPMI1640中。將MCF10A維持在包含5%馬血清以及以前所述的添加劑(17)的DMEM/F12(Sigma)中。對于所有涉及雌激素/孕酮(Sigma)的實(shí)驗(yàn)，在刺激之前將MCF7和T47D在包含5%活性炭-葡聚糖處理的FBS(ThermoScientificHyclone,SouthLogan,UT,USA)的不含酚紅的RPMI1640(Sigma)中培養(yǎng)至少2天。EGF來自Millipore，Wnt3a配體來自R&DsystemsInc.,Minneapolis,MN,USA，他莫昔芬、氟維司群和FH535來自Sigma，而易瑞沙和AZD0530來自AstraZenecaSingaporePteLtd,Singapore。為了處理，每天補(bǔ)充新鮮的激素/藥物，持續(xù)超過1天。按照以前的報(bào)道(18)進(jìn)行細(xì)胞裂解。免疫沉淀/免疫共沉淀如以前所述(19)進(jìn)行免疫沉淀和免疫印跡。對于免疫共沉淀，將細(xì)胞在冰冷的緩沖液(50mMTris，pH7.5；150mMNaCl；lmMEDTA；10%甘油；0.5%NonidetP40；0.5%TritonX-100；50mMNaF；IX蛋白酶抑制劑；lmMNa3V04)中裂解并在冰上溫育15min以完全裂解。免疫沉淀之前，將500-1000μg裂解物通過與50μ1的50%抗小鼠/兔-IgG瓊脂糖漿(Sigma)在4°C下溫育lhr來預(yù)澄清。同時(shí)，將等量的抗小鼠/兔-IgG瓊脂糖用5%BSA封閉過夜，4°C。然后將預(yù)澄清的裂解物與l-2μg抗體在4°C下溫育過夜。然后通過與預(yù)封閉的抗小鼠/兔-IgG瓊脂糖在4°C下溫育2hr來捕獲免疫復(fù)合物。在蛋白印跡之前，將免疫沉淀物用緩沖液(50mMTris，pH7.5；150mMNaCl；lmMEDTA；10%甘油；0.5%NP40；0.5%TritonX-100；lmMNa3V04)大量洗滌4X5min每次。瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染之前將細(xì)胞以70-80%匯合接種于60-mm皿中于不含抗生素的培養(yǎng)基中1天，并且按照制造商的說明書用4μg質(zhì)粒DNA或50-100nMsiRNA和12μllipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)然后24-48hr收獲細(xì)胞。對于反向轉(zhuǎn)染，當(dāng)仍懸浮時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(即在胰蛋白酶消化之后和平板接種之前)。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，將MCF7或MCF10A用pCEP4載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E、WBP2-Y192-231D和WBP2-Y192-231F/pCEP4轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48hr，將細(xì)胞暴露于潮霉素(Invitrogen)[對于MCF7，250Gg/ml而對于MCF10A1，50ng/ml]3周并篩選WBP2蛋白表達(dá)。收集所選克隆并用相同選擇壓力維持。定期檢查WBP2表達(dá)。穩(wěn)定細(xì)胞系建立對于WBP2獲得功能的過表達(dá)研究，用pCEP4載體、WBP2-WT、WBP2-Y192-231E和WBP2-Y192-23lF/pCEP4轉(zhuǎn)染MCF7。轉(zhuǎn)染后24hr，將細(xì)胞暴露于250ug/ml潮霉素(Invitrogen)3周，并且篩選WBP2蛋白表達(dá)。收集所選克隆并用相同選擇壓力維持。定期檢查WBP2表達(dá)。亞細(xì)胞分級(jí)分離根據(jù)Dr.RichardPattern,Tufts-NewEnglandMedicalCentre(http://www.abcam.coin/index.html?pageconfig=resource&rid=l1473),Boston,MA,USA的方案進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí)分離。簡單地說，將板上的細(xì)胞用冰冷的PBS漂洗一次并刮入冰冷的低滲裂解緩沖液(20mMHepes，pH7.4；10mMKCl；2mMMgC12；1mMEDTA；ImMEGTA；1mMDTT；IX蛋白酶抑制劑混合物；50mMNaF；1mM原釩酸鈉)，在冰水溫育1hr。使裂解物通過25G針15次。以3000rpm離心5min離心出核沉淀，重懸之前用低滲裂解緩沖液洗滌2次，并且在核裂解緩沖液(具有10%甘油和1%SDS的NID裂解緩沖液)中裂解。然后將核裂解物短暫地超聲處理。將上清以8000rpm離心5min。所得的上清為胞質(zhì)和膜級(jí)分。將該上清以40000rpm進(jìn)一步離心1hr。將所得的上清收集為胞質(zhì)級(jí)分。螢光素酶報(bào)道測定雙螢光素酶TM報(bào)道測定系統(tǒng)(Promega)用于按照制造商的說明書順序測量螢火蟲和海腎螢光素酶活性。螢光素酶活性的定量利用發(fā)光計(jì)(Sirius)來進(jìn)行。雙螢光素酶TM報(bào)道測定系統(tǒng)(Promega)用于按照制造商的說明書順序測量螢火蟲和海腎螢光素酶活性。螢光素酶活性的定量利用發(fā)光計(jì)(Sirius,Berthold-DSInc,Germany)來進(jìn)行。簡單地說，將24-孔板中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用冰冷的PBS漂洗一次并在RT下于1X被動(dòng)裂解緩沖液(PLB)中裂解15min。將粗裂解物首先與螢光素酶測定底物(LARII)溫育以測量螢火蟲螢光素酶，然后與Stop和Glo底物溫育以測量海腎螢光素酶活性。基于細(xì)胞的測定利用CellTiter一種水溶液非放射性(MTS)測定試劑(Promega)進(jìn)行細(xì)胞增殖測定。利用CytoSelect96-孔細(xì)胞轉(zhuǎn)化比色測定試劑盒(CellBiolabs)測定貼壁不依賴性生長。利用CytoSelect96-孔細(xì)胞遷移測定試劑盒，8μm(CellBiolabs)進(jìn)行趨化性和細(xì)胞侵襲測定。使用試劑盒的所有研究均按照制造商的說明書進(jìn)行。對于傷口愈合測定，用p200槍頭在匯合細(xì)胞單層中刻入傷口。將細(xì)胞洗滌一次以去除細(xì)胞碎片并平滑劃痕的邊緣，然后更換新鮮生長培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37oC下溫育，并且監(jiān)測它們遷移入劃痕區(qū)域長達(dá)24hr。利用相差顯微鏡，在劃傷后0、8、16和24hr拍攝相同視野中的劃痕的圖像。利用Photoshop5.5定量地測量劃痕的相對寬度。siRNA序列YeslsiRNA(5'-UUCUCCUACAAGAAUAUUAGCAGCC-3'),v-SrcsiRNA(5'-GCCUCUCAGUGUCUGACUUCGACAA-3'),螢光素酶-GL2siRNA(5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'),WBP2siRNA(5'-AGCAUCCGCUGUCCGAACUCAAUGG-3')以及WBP2UTR-siRNA(5'-CAGGAACUAGCAUUGUGGGACAUUA-3')來自Invitrogen。免疫熒光使細(xì)胞在6-孔板中的蓋玻片上生長。各種處理之后，將細(xì)胞用4%多聚甲醛在室溫下固定并用PBS中的0.5%Triton-X-100透化。用5%BSA封閉1小時(shí)后，將細(xì)胞與一抗溫育過夜[抗ER□小鼠單克隆抗體，1:100，抗E-鈣粘著蛋白兔多克隆抗體，1:100，抗ZO-2兔多克隆抗體，1:100]。然后與1:1000稀釋的綴合至AlexFluor488的二抗(MolecularProbes,Invitrogen)溫育1小時(shí)。將細(xì)胞核用1:10000稀釋的4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染1min。然后將含有細(xì)胞的蓋玻片通過加入延長抗褪色試劑(MolecularProbes,Invitrogen)封固在載玻片上并用Eukitt快速硬化封固介質(zhì)(Fluka,Sigma)密封。利用CarlZeissAxioplan2熒光顯微鏡(CarlZeissImaging,Gottingen,Germany)用100X油浸物鏡進(jìn)行分析。AxiovisionRel4.6軟件用來拍攝和分析圖像。體外基于細(xì)胞的分析利用CellTiter一種水溶液非放射性(MTS)細(xì)胞增殖測定試劑(Promega)測量細(xì)胞增殖。簡單地說，在第0天將5000個(gè)細(xì)胞/孔一式三份接種于96-孔板中的100μl培養(yǎng)基中，并且每天監(jiān)測細(xì)胞生長直至第4天。將20μl的MTS試劑加入每孔并通過旋轉(zhuǎn)板來混合。1小時(shí)后在酶標(biāo)儀(TecanGroupLtd,Mannedorf,Switzerland)上于490nm處測量吸光度。利用CytoSelect96-孔細(xì)胞轉(zhuǎn)化比色測定試劑盒(CellBiolabsInc.,SanDiego,CA,USA)測定貼壁不依賴性生長。簡單地說，將50μl基底瓊脂基質(zhì)加入96-孔板的每孔的底部。當(dāng)基底瓊脂固化時(shí)，將包含5000個(gè)細(xì)胞的75μl細(xì)胞懸浮液/軟瓊脂基質(zhì)鋪在上部，然后50μl培養(yǎng)基。在37°C下培養(yǎng)10天后，使瓊脂基質(zhì)溶解并利用MTT溶液檢測細(xì)胞。在570/630nm處測量吸光度。對于劃痕測定，將細(xì)胞接種在6-孔板上并使其生長直至匯合的單層。用p200槍頭在細(xì)胞單層中刻入傷口。將細(xì)胞用生長培養(yǎng)基洗滌一次以去除細(xì)胞碎片并平滑劃痕的邊緣，然后更換新鮮生長培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37°C下溫育，并且監(jiān)測它們遷移入劃痕區(qū)域長達(dá)24hr。利用相差顯微鏡，在劃傷后0、8、16和24hr拍攝相同視野中的劃痕的圖像。利用Photoshop5.5定量地測量劃痕的相對寬度。間隙閉合的程度確定為細(xì)胞遷移率。對于趨化性測定，將2x105個(gè)血清饑餓過夜的細(xì)胞接種在具有聚碳酸酯膜室(8μm孔徑，CellBiolabs)的96trans-well板的頂部室上的無血清培養(yǎng)基中，并且將包含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基加入底部室作為化學(xué)引誘物。2hr溫育之后，去除頂部非遷移性細(xì)胞，將底部遷移的細(xì)胞首先從膜分離，然后裂解并利用CyQuantGR熒光染料在480nm520nm處定量。對于侵襲測定，將2x105個(gè)血清饑餓過夜的細(xì)胞接種在具有用均勻的基底膜基質(zhì)層包被的聚碳酸酯膜室(8μm孔徑，CellBiolabs)的96trans-well板的頂部室上的無血清培養(yǎng)基中，并且將包含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基加入底部室。24hr溫育之后，去除頂部非侵襲性細(xì)胞，將底部侵襲的細(xì)胞首先從膜分離，然后裂解并利用CyQuantGR熒光染料在480nm520nm處定量。裸鼠中的腫瘤異種移植將4-6周齡的雌性裸鼠在后脅中用懸浮于100Dl的Matrigel(BD)中的5x106個(gè)pCEP4或WBP2-WT或WBP2-Y192-231E或WBP2-Y192-231F的MCF7穩(wěn)定細(xì)胞s.c.接種。每3-4天監(jiān)測和測量腫瘤發(fā)展直至第22天。結(jié)果雌激素和孕酮通過EGFR串話誘導(dǎo)WBP2在Tyr192和Tyr231處的酪氨酸磷酸化雌激素/孕酮與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)之間的串話已報(bào)道(20-22)。因?yàn)橐炎C實(shí)WBP2為EGFR靶標(biāo)，所以我們研究了雌激素/孕酮是否可以通過這種串話誘導(dǎo)WBP2酪氨酸磷酸化。如圖1A所示，在MCF7中WBP2在雌激素/孕酮刺激時(shí)酪氨酸磷酸化，雖然與EGF刺激相比較弱。通過易瑞沙顯著消除雌激素/孕酮誘導(dǎo)的WBP2磷酸化指示與EGFR串話在雌激素/孕酮介導(dǎo)的WBP2磷酸化中起作用。然后，我們試圖定位WBP2上的EGF依賴性酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。將通過各種軟件(Netphos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、HPRDPhosphomotifFinder(http://www.hprd.org/PhosphoMotif_finder)和NetphosK(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/))預(yù)測的17個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)單獨(dú)突變?yōu)楸奖彼?。將WT-WBP2或Y→F突變體與EGFR共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，然后用EGF處理該細(xì)胞。在EGF刺激時(shí)，除了Y192F和Y231F，所有Y→F突變體酪氨酸磷酸化至與WTWBP2相同的程度(圖1B)。當(dāng)Y192和Y231均突變時(shí)觀察到幾乎完全消除WBP2酪氨酸磷酸化(圖1C)。我們研究了E2/P4是否可以通過這種串話誘導(dǎo)內(nèi)源性WBP2酪氨酸磷酸化。將細(xì)胞用E2或P4處理24h，因?yàn)檫@是報(bào)道WBP2作為E2和P4受體的共激活蛋白的作用的組所用的時(shí)間點(diǎn)(11)。另一原因是E2/P4與EGF信號(hào)傳導(dǎo)串話部分歸因于EGFR配體的上調(diào)及隨后的EGFR的自分泌激活(23)。如圖1D所示，在MCF7中WBP2在E2或P4刺激時(shí)酪氨酸磷酸化，雖然與EGF(E)刺激相比較弱。通過易瑞沙顯著消除E2/P4誘導(dǎo)的WBP2磷酸化指示。將WBP2或Y→F突變體與EGFR共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，然后用EGF處理該細(xì)胞。在EGF刺激時(shí)，除了Y192F和Y231F，所有Y→F突變體酪氨酸磷酸化至與WTWBP2相同的程度(圖1E)。當(dāng)Y192和Y231均突變時(shí)觀察到幾乎完全消除WBP2酪氨酸磷酸化(圖1F)。為了確認(rèn)是否相同的兩個(gè)位點(diǎn)對雌激素/孕酮刺激應(yīng)答而酪氨酸磷酸化，將用WBP2或Y192/231F雙突變體轉(zhuǎn)染的MCF7用雌激素/孕酮處理，并且比較它們的酪氨酸磷酸化狀態(tài)。Y192和Y231的突變幾乎完全消除雌激素/孕酮誘導(dǎo)的WBP2的酪氨酸磷酸化(圖1G)。c-Src和c-Yes調(diào)節(jié)WBP2酪氨酸磷酸化Src家族激酶是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)EGFR起始的信號(hào)的關(guān)鍵下游激酶。有9個(gè)成員，但是僅c-Src、c-Yes和Fyn在多種細(xì)胞類型中顯性表達(dá)，而其他成員主要在造血細(xì)胞中表達(dá)(21)。通過AZD0530破壞c-Src活性(圖2A)和顯性失活的c-Src(圖2B)消除EGF誘導(dǎo)的WBP2的酪氨酸磷酸化。注意到c-Src抑制還導(dǎo)致EGFR激活的顯著減少，提示c-Src抑制對WBP2磷酸化的負(fù)面影響部分通過其對EGFR激活的抑制效應(yīng)來介導(dǎo)。這并不令人驚訝，因?yàn)橐褕?bào)道c-Src介導(dǎo)的EGFR的磷酸化增加EGFR活性(22)。因此，c-Src可以潛在地在WBP2酪氨酸磷酸化期間在EGFR的上游和下游作用。野生型(WT)或組成型活化(CA)的c-Src的過表達(dá)導(dǎo)致WBP2的酪氨酸磷酸化，雖然是以EGF不依賴性方式(圖2C)。與EGFR共表達(dá)略微增加WBP2磷酸化。此外，c-Src誘導(dǎo)的WBP2磷酸化主要通過Tyr192和Tyr231介導(dǎo)。然后，研究c-Yes在EGF誘導(dǎo)的WBP2磷酸化中的作用，因?yàn)閏-Yes與YAP相互作用(23)，YAP與WBP2相互作用(24,25)。不像c-Src，WT和CAc-Yes介導(dǎo)的WBP2酪氨酸磷酸化可以通過EGF誘導(dǎo)，雖然與WTc-Yes相比，CAc-Yes的基礎(chǔ)和EGF誘導(dǎo)的WBP2酪氨酸磷酸化更高(圖3A)。注意到c-Yes介導(dǎo)的WBP2磷酸化與EGFR介導(dǎo)的WBP2磷酸化相比較不顯著。通過c-Yes與EGFR的共表達(dá)協(xié)同增強(qiáng)WBP2磷酸化也是EGF可誘導(dǎo)的。因此，c-Yes在WBP2磷酸化中的作用依賴于EGFR和c-Yes的可用性。與c-Src相似，c-Yes調(diào)節(jié)WBP2在Tyr192和Tyr231處的磷酸化。c-Yes和c-Src在WBP2磷酸化中的作用通過siRNA研究來進(jìn)一步探討。EGF誘導(dǎo)的WBP2酪氨酸磷酸化通過c-Yes敲低幾乎完全消除，并且通過c-Src敲低消除至較低程度(圖3B)。通過c-Src的EGF誘導(dǎo)的WBP2磷酸化的部分減少可能是由于c-Src的較低效的敲低或與c-Yes的功能冗余?？偟膩碚f，與c-Src相比，c-Yes更可能直接在WBP2的上游作用，c-Src可能通過EGFR間接作用。此外，據(jù)報(bào)道c-Yes與YAP相互作用(26)，轉(zhuǎn)而已證實(shí)YAP與WBP2相互作用(27,28)。因此我們詢問c-Src和c-Yes是否在EGF誘導(dǎo)的WBP2酪氨酸磷酸化中起作用。通過高度選擇性的雙特異性Src/Abl激酶抑制物AZD0530破壞c-Src活性(圖2D)和顯著失活的c-Src-K295M(圖2E)消除HeLa細(xì)胞中EGF誘導(dǎo)的WBP2的酪氨酸磷酸化。從圖2D和2E注意到c-Src抑制還導(dǎo)致EGFR激活(EGFR自磷酸化)的減少。因此，可能c-Src抑制對WBP2磷酸化的負(fù)面影響可以部分通過其對EGFR激活的抑制效應(yīng)來介導(dǎo)。這并不令人驚訝，因?yàn)橐褕?bào)道c-Src介導(dǎo)的EGFR的磷酸化增加EGFR活性(29)。因此，c-Src可以潛在地在WBP2酪氨酸磷酸化期間在EGFR的上游和下游作用。野生型(WT)或組成型活化(CA)的c-Src-Y529F的過表達(dá)導(dǎo)致WBP2的酪氨酸磷酸化，雖然是以EGF不依賴性方式(圖2F，左圖)。c-Src誘導(dǎo)的WBP2磷酸化主要通過Tyr192和Tyr231介導(dǎo)(圖2F，右圖)。不像c-Src，WT和CA-Y357F-c-Yes介導(dǎo)的WBP2酪氨酸磷酸化是EGF依賴性的，雖然與WTc-Yes相比，CAc-Yes的基礎(chǔ)和EGF誘導(dǎo)的WBP2酪氨酸磷酸化更高(圖3)。注意到c-Yes介導(dǎo)的WBP2磷酸化與EGFR介導(dǎo)的WBP2磷酸化相比較不顯著。通過c-Yes與EGFR的共表達(dá)協(xié)同增強(qiáng)WBP2磷酸化也是EGF可誘導(dǎo)的。因此，c-Yes在WBP2磷酸化中的作用依賴于EGFR激活。正如c-Src的情況，c-Yes調(diào)節(jié)WBP2在Tyr192和Tyr231處的磷酸化。c-Yes和c-Src在WBP2磷酸化中的作用通過siRNA研究來進(jìn)一步探討。在HeLa(圖3E)和MCF7細(xì)胞(圖2G)中，EGF誘導(dǎo)的WBP2酪氨酸磷酸化通過c-Yes或c-SrcsiRNA敲低幾乎完全消除。對照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中EGF誘導(dǎo)的WBP2的酪氨酸磷酸化信號(hào)不像以前的實(shí)驗(yàn)?zāi)菢訌?qiáng)，因?yàn)镋GFR未與WBP2共轉(zhuǎn)染?？偟膩碚f，c-Yes和c-Src均在EGF誘導(dǎo)的WBP2的酪氨酸磷酸化中起作用，但是基于它們對EGFR激活的不同依賴性，c-Yes更可能在EGFR的下游作用，而c-Src可能通過EGFR間接作用。WBP2的酪氨酸磷酸化通過調(diào)節(jié)其核進(jìn)入以及與ERα的相互作用來增強(qiáng)其在ERα活性中的共激活功能一個(gè)相關(guān)問題是WBP2的酪氨酸磷酸化是否調(diào)節(jié)其在ERα/PR反式激活中的共激活功能。如圖4A所示，表達(dá)WT-和Y192-231F-WBP2的細(xì)胞與載體對照相比表現(xiàn)出更高的基礎(chǔ)ERα報(bào)道活性，這可以在雌激素而不是EGF處理之后增強(qiáng)。EGF和雌激素的組合進(jìn)一步增強(qiáng)ERα報(bào)道活性。與WT相比，Y192-231F突變體在雌激素或雌激素/EGF刺激時(shí)表現(xiàn)出共激活蛋白活性的-50%損失。為了消除可能的來自內(nèi)源性WT的干擾，利用針對5'UTR序列的siRNA使內(nèi)源性WBP2表達(dá)沉默，并且在Y192-231F表達(dá)細(xì)胞中重復(fù)ERα報(bào)道測定。未觀察到ERα反式激活的進(jìn)一步減少(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明Y192-231F突變不發(fā)揮顯性負(fù)面作用，并且WBP2共激活ERα活性并不絕對需要WBP2的酪氨酸磷酸化。WT和Y192-231F在ERα反式激活中的潛力之間的差異隨后通過雌激素應(yīng)答靶基因細(xì)胞周期蛋白Dl的差異表達(dá)證實(shí)。我們還研究了在T47D中Y192-231F突變對PR報(bào)道活性的影響。如圖4A所示，在孕酮或孕酮/EGF刺激期間，Y192-231突變顯著(～30%)但不完全損害WBP2的共激活蛋白功能。當(dāng)EGF單獨(dú)刺激時(shí)，不可以檢測到顯著的PR反式激活。在所有情況下，雌激素/孕酮/EGF誘導(dǎo)的WT-WBP2的共激活蛋白活性通過易瑞沙消除，指向EGFR介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化在調(diào)節(jié)WBP2的共激活功能中的作用。雖然Y192和Y231的磷酸化很重要，但是類固醇激素依賴性轉(zhuǎn)錄控制并不絕對需要它們。由于其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，WBP2在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)當(dāng)位于核以發(fā)揮其功能。如圖4B所示，WBP2在基礎(chǔ)狀態(tài)主要位于胞質(zhì)中，而在雌激素刺激時(shí)可以觀察到核WBP2。當(dāng)施用易瑞沙時(shí)后者減少。圖4B還顯示僅核定位的WBP2是酪氨酸磷酸化的。當(dāng)用EGF刺激T47D和MDA-MB-231時(shí)得到相似的觀察。這些指向WBP2酪氨酸磷酸化與其核易位的密切聯(lián)系。實(shí)際上，Y192-231FWBP2中受損的酪氨酸磷酸化減少其E2依賴性核進(jìn)入(圖4C)。這可以至少部分解釋其增強(qiáng)ERα/PR活性的減少。雖然EGF誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化也促進(jìn)WBP2的核進(jìn)入，但是其不足以增強(qiáng)ERα反式激活。因此，WBP2在ER反式激活中的功能額外地需要雌激素處理呈現(xiàn)的其他因子。因?yàn)閃BP2以雌激素依賴性方式與ERα相互作用，我們研究了WBP2酪氨酸磷酸化對其與ERα的相互作用的影響。如圖4D所示，Y192-231F突變損害雌激素誘導(dǎo)的WBP2與ERα之間的相互作用。因?yàn)楸娝苤姿峄{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活蛋白的活性，我們檢測了WBP2的酪氨酸磷酸化是否調(diào)節(jié)其報(bào)道的在ERα/PR反式激活中的共激活蛋白功能。如圖4E上圖所示，穩(wěn)定表達(dá)WBP2和Y192-231F突變體的MCF7細(xì)胞與載體對照相比表現(xiàn)出更高的基礎(chǔ)ERα報(bào)道活性，這可以在雌激素而不是EGF處理之后增強(qiáng)(圖4I)，提示ERα轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成由雌激素顯著誘導(dǎo)。這里由WBP2的存在增加的ER報(bào)道基因激活的倍數(shù)(10倍)與以前報(bào)道的倍數(shù)(12倍)相似(11)。相對于載體和與WBP2相比，Y192-231F突變體在雌激素刺激時(shí)表現(xiàn)出共激活蛋白活性的-60%喪失。為了消除可能的來自內(nèi)源性WBP2的干擾，利用針對5'UTR序列的siRNA使內(nèi)源性WBP2表達(dá)沉默，并且在Y192-231F表達(dá)細(xì)胞中重復(fù)ERα報(bào)道測定。未觀察到ERα反式激活的進(jìn)一步減少(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明Y192-231F突變不發(fā)揮顯性負(fù)面作用，并且WBP2共激活ERα活性并不絕對需要WBP2的酪氨酸磷酸化。WT和Y192-231F在ERα反式激活中的潛力之間的差異隨后通過雌激素應(yīng)答靶基因細(xì)胞周期蛋白Dl的差異表達(dá)證實(shí)(圖4J)。我們還研究了在T47D中Y192-231F突變對PR報(bào)道活性的影響，T47D比MCF7對孕酮刺激更應(yīng)答。如圖4E下圖所示，在孕酮刺激期間Y192-231F突變顯著(-50%，相對于載體和與WBP2相比)損害WBP2的PR共激活蛋白功能。在所有情況下，雌激素/孕酮誘導(dǎo)的WBP2的共激活蛋白活性可以通過易瑞沙消除，指向EGFR介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化在調(diào)節(jié)WBP2的ERD/PR共激活功能中的作用。雖然Y192和Y231的磷酸化很重要，但是類固醇激素依賴性轉(zhuǎn)錄控制并不絕對需要它們。由于其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，WBP2在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)當(dāng)位于核以發(fā)揮其功能。如圖4F所示，WBP2在基礎(chǔ)狀態(tài)主要位于胞質(zhì)中，而在雌激素刺激T47D細(xì)胞時(shí)可以觀察到增加的核WBP2。然后，我們想知道WBP2的核定位是否可以通過WBP2磷酸化來調(diào)節(jié)。為此，我們采集胞質(zhì)和核級(jí)分，進(jìn)行WBP2的免疫沉淀并檢測其酪氨酸磷酸化狀態(tài)。如圖4F所示，僅核定位的WBP2是酪氨酸磷酸化的。當(dāng)用EGF刺激T47D和MDA-MB-231時(shí)得到相似的觀察(圖4K和L)。這些指向WBP2酪氨酸磷酸化與其核易位的密切聯(lián)系。實(shí)際上，Y192-231F-WBP2中受損的酪氨酸磷酸化減少其E2依賴性核進(jìn)入(圖4G)。這可以至少部分解釋其增強(qiáng)ERD/PR活性的減少。雖然EGF誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化也促進(jìn)WBP2的核進(jìn)入(圖4M)，但是其不足以增強(qiáng)ERα反式激活(圖4J)。這暗示W(wǎng)BP2在ERD反式激活中的功能額外地需要通過僅雌激素而不是EGF處理呈現(xiàn)的其他因子。因?yàn)閃BP2以雌激素依賴性方式與ERQ相互作用，所以我們研究了WBP2酪氨酸磷酸化對其與ERα的相互作用的影響。為此，WBP2或Y192/231F磷酸化缺陷突變體轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞未作處理或者用E2處理，并且收獲裂解物。我們在E2刺激的細(xì)胞中同樣觀察到降低水平的ERα。雖然原因不清楚，但是這可以歸因于i)E2誘導(dǎo)的ER不溶性染色質(zhì)復(fù)合物的高親和性結(jié)合，所述ER不溶性染色質(zhì)復(fù)合物不可以通過所用的裂解緩沖液溶解和/或ii)E2誘導(dǎo)的ERα降解(30)。然后將裂解物用抗ERα抗體或?qū)φ湛贵w免疫沉淀，并且用抗V5探查免疫沉淀物以檢測外源性WBP2或其突變體。如圖4H所示，Y192-231F突變損害雌激素誘導(dǎo)的WBP2與ERD之間的相互作用。盡管在E2處理的細(xì)胞中ERα水平降低，在未作處理和處理的細(xì)胞中富集相似量的ERα。這可能是由于在免疫沉淀期間使用的有限量的一抗和/或二抗(綴合至瓊脂糖珠)。WBP2磷酸化在E2介導(dǎo)的乳腺癌生物學(xué)中的作用和影響為了研究WBP2在乳腺癌生物學(xué)中的功能，產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)載體，WBP2的WT、Y192-231E突變體和Y192-231F突變體的MCF7細(xì)胞。集中的克隆用來避免克隆變異。監(jiān)測WBP2及其突變體的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)與載體對照比較時(shí)，WBP2-WT的過表達(dá)以及更顯著的WBP2-Y192-231E突變體促進(jìn)MCF7的激素依賴性細(xì)胞增殖(圖5A)。雌激素進(jìn)一步增加WBP2-WT過表達(dá)的MCF7的生長，涉及乳腺癌細(xì)胞的雌激素反應(yīng)性中的WBP2。基線和雌激素誘導(dǎo)的生長的增加相當(dāng)大，但是在表達(dá)WBP2-Y192-231F的細(xì)胞中未完全消除。與細(xì)胞增殖結(jié)果一致，WBP2-WT或WBP2-Y192-123E而不是WBP2-Y192-231F的過表達(dá)在軟瓊脂測定中促進(jìn)MCF7的基礎(chǔ)和雌激素誘導(dǎo)的貼壁不依賴性生長。在傷口愈合測定中，WBP2-Y192-231E突變體表達(dá)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性甚至在不存在雌激素時(shí)顯著增強(qiáng)(圖5B)。與Y192-231-E突變體相比，WT-WBP2表達(dá)細(xì)胞具有少得多的運(yùn)動(dòng)性，而Y192-231F突變體表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出最少的運(yùn)動(dòng)性。在趨化性測定中，Y192-231E表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出最高的遷移潛力。相對于載體對照，WT-和Y192-231F表達(dá)細(xì)胞還表現(xiàn)出增加的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，但是互相之間差異不大。由于測定持續(xù)時(shí)間短，未分析雌激素的效果。另一方面，WT-WBP2過表達(dá)增加雌激素誘導(dǎo)的MCF7的侵襲，而WBP2-Y192-231E突變體不依賴于雌激素地顯著增強(qiáng)其基礎(chǔ)侵襲特性。當(dāng)阻斷Y192/Y231磷酸化時(shí)，WBP2介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲顯著消除。WBP2在調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲特性中的能力促使我們檢測其在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)中的作用。引人注目的是，Y192-231E突變體的過表達(dá)誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞從上皮變化為成纖維細(xì)胞樣外觀(圖5C)。相比之下，WBP2-Y192-231F表達(dá)MCF7表現(xiàn)為像對照細(xì)胞一樣的緊湊細(xì)胞團(tuán)。WBP2-WT表達(dá)MCF7保留上皮團(tuán)聚特征但是聚集較不緊密。此外，如以前所述(26)進(jìn)行的共聚焦免疫熒光研究顯示，WT和Y192-231E而不是Y192-231F表達(dá)MCF7表現(xiàn)出在細(xì)胞-細(xì)胞連接處E-鈣粘著蛋白和ZO-2緊密連接蛋白表達(dá)的喪失/減少。為了研究WBP2表達(dá)和磷酸化在ER陽性乳腺癌生物學(xué)中的影響，我們產(chǎn)生了表達(dá)載體、WBP2、WBP2的Y192-231E磷酸化模擬和Y192-231F磷酸化缺陷突變體的MCF7細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。集中的克隆用來避免克隆變異。監(jiān)測WBP2及其突變體的表達(dá)(圖5D)。注意到WBP2Y192-231E磷酸化模擬突變體表現(xiàn)出移動(dòng)性凝膠移位。這與我們以前的研究(17)中觀察到的過釩酸鹽和EGF處理誘導(dǎo)的WBP2的酪氨酸磷酸化所引起的凝膠移位一致。當(dāng)與載體對照比較時(shí)，WBP2的過表達(dá)以及更顯著的Y192-231E突變體促進(jìn)MCF7的激素依賴性細(xì)胞增殖(圖5E)。雌激素進(jìn)一步增加WBP2過表達(dá)的MCF7的增殖，涉及乳腺癌細(xì)胞的雌激素反應(yīng)性中的WBP2?；€和雌激素誘導(dǎo)的生長的增加相當(dāng)大，但是在表達(dá)Y192-231F的細(xì)胞中未完全消除。與細(xì)胞增殖結(jié)果一致，WBP2或Y192-123E而不是WBP2-Y192-231F的過表達(dá)在軟瓊脂測定中促進(jìn)MCF7的基礎(chǔ)和雌激素誘導(dǎo)的貼壁不依賴性生長(圖5F)。在傷口愈合測定中，Y192-231E突變體表達(dá)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性甚至在不存在雌激素時(shí)顯著增強(qiáng)(圖5G)。與Y192-231-E突變體相比，WBP2表達(dá)細(xì)胞具有少得多的運(yùn)動(dòng)性，而Y192-231F突變體表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出最少的運(yùn)動(dòng)性。在趨化性測定(圖5H)中，Y192-231E表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)出最高的遷移潛力。相對于載體對照，WBP2和Y192-231F表達(dá)細(xì)胞還表現(xiàn)出增加的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，但是互相之間差異不大。由于測定持續(xù)時(shí)間短，未分析雌激素的效果。另一方面，WBP2過表達(dá)增加雌激素誘導(dǎo)的MCF7的侵襲，而Y192-231E突變體不依賴于雌激素地顯著增強(qiáng)其基礎(chǔ)侵襲特性(圖5I)。當(dāng)阻斷Y192/Y231磷酸化時(shí)，WBP2介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲顯著消除。在許多上述測定中，磷酸化缺陷突變體與載體對照相比表現(xiàn)出略強(qiáng)的表型。這暗示除了Y192和Y231，WBP2的其他功能區(qū)可以有助于WBP2功能并有待進(jìn)一步研究。WBP2在調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲特性中的能力促使我們檢測其在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)中的作用。與生長為細(xì)胞島的Y192-231F表達(dá)和對照MCF7相比，在2D培養(yǎng)中Y192-231E突變體的過表達(dá)誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞更分散(圖5J，上圖)。WBP2表達(dá)MCF7保留上皮團(tuán)聚特征但是聚集較不緊密。如以前所述(31)進(jìn)行的免疫熒光研究顯示W(wǎng)BP2和Y192-231E，而不是Y192-231F表達(dá)MCF7表現(xiàn)出在細(xì)胞-細(xì)胞連接處E-鈣粘著蛋白(圖5J，中圖)和ZO-2(圖5J，下圖)緊密連接蛋白表達(dá)的喪失/減少。另一方面，波形蛋白表達(dá)在WT和Y192-231E表達(dá)MCF7中上調(diào)(圖6E)。為了獲得WBP2表達(dá)和磷酸化對腫瘤生長的作用的更多生理學(xué)評(píng)價(jià)，我們用表達(dá)WBP2及其突變體的MCF7的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子注射Balb/c裸鼠。結(jié)果顯示載體對照MCF7細(xì)胞是弱致瘤的，而表達(dá)WBP2和Y192-231E磷酸化模擬突變體的細(xì)胞形成比對照細(xì)胞大3-4倍的腫瘤(p<0.05)。表達(dá)磷酸化缺陷的WBP2突變體的細(xì)胞僅產(chǎn)生比對照細(xì)胞略大的腫瘤(圖5K)。最近，論文報(bào)道單獨(dú)WBP2不足以促進(jìn)MCFIOA正常乳腺上皮細(xì)胞的貼壁不依賴性生長。取而代之，需要TAZ與WBP2的相互作用(32)。這促使我們提出這樣的問題，WBP2的酪氨酸磷酸化是否可以賦予MCFIOA細(xì)胞貼壁不依賴性生長。為此，我們對用載體、WBP2和Y192-231D磷酸化模擬突變體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCFIOA細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂克隆形成測定(為了一些未知原因，我們在MCFIOA細(xì)胞中未獲得Y192-231E突變體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子)。與Chan等人的報(bào)道一致，WBP2不賦予正常乳腺上皮細(xì)胞貼壁不依賴性生長。相比之下，WBP2磷酸化模擬突變體表達(dá)MCFIOA細(xì)胞在軟瓊脂中比載體對照多生長5倍(圖5L)。綜上所述，WBP2磷酸化在軟瓊脂克隆測定中促進(jìn)/增加生長的能力可以在癌癥和正常乳腺上皮細(xì)胞中證實(shí)。WBP2介導(dǎo)的乳腺癌腫瘤發(fā)生的機(jī)制-Wnt-ERα串話的重要作用WBP2過表達(dá)及其酪氨酸磷酸化賦予生長因子獨(dú)立性。我們詢問這些雌激素不依賴性表型是否仍然依賴于ERα途徑或者帶來其他致癌信號(hào)傳導(dǎo)途徑?；A(chǔ)表達(dá)水平以及在某些情況下，c-Yes、YAP、ERα和細(xì)胞周期蛋白Dl的激活在WBP2-Y192-231E-而不是Y192-231F-表達(dá)MCF7中上調(diào)(圖18A)。與免疫印跡數(shù)據(jù)一致，免疫熒光數(shù)據(jù)顯示與Y192-231F和對照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在WT和Y192-231E表達(dá)細(xì)胞中核ERα信號(hào)更強(qiáng)和更顯著。這些數(shù)據(jù)提示ERα途徑可以引起一些WBP2介導(dǎo)的效應(yīng)。乳腺癌涉及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)(27,28)。已證實(shí)包括ERα在內(nèi)的核受體(NR)超家族的成員通過Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分來調(diào)節(jié)(29)。如圖18A所示，WBP2-WT和Y192-231E表達(dá)MCF7中Wnt3A表達(dá)的增加伴隨著磷酸化介導(dǎo)的GSK3/3抑制的增加，3-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定以及增加的Wnt途徑靶基因如c-Mycand細(xì)胞周期蛋白Dl的表達(dá)。觀察到的其他變化包括與Y192-231F和對照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在WT和Y192-231E表達(dá)細(xì)胞中i)細(xì)胞周期關(guān)卡蛋白、CDK抑制物-p21和p16的表達(dá)的下調(diào)，ii)Bcl-2抗凋亡分子表達(dá)的上調(diào)以及MMP2侵襲促進(jìn)蛋白的活性的升高。有趣的是，當(dāng)利用WBP2siRNA在WBP2Y192-231E穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中沉默WBP2表達(dá)時(shí)，YAP、ERα、細(xì)胞周期蛋白Dl、Wnt3a、pGSKβ、β-連環(huán)蛋白、c-Myc以及Bcl-2(較低程度)的表達(dá)受到抑制。(圖18A)。c-Yes、p16、p21和活性MMP2的表達(dá)保持不變。因此，基因組變化和各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活性調(diào)節(jié)的組合有助于在WT-和Y192-231E-表達(dá)MCF7中觀察到的表型。通過WBP2上調(diào)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)組分令人感興趣。隨后，我們分析了TCF報(bào)道基因在各種MCF7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中的活性。當(dāng)與載體和WT/Y192-231F表達(dá)對應(yīng)物比較時(shí)，Y192-231E表達(dá)MCF7表現(xiàn)出高得多的基礎(chǔ)TCF活性，暗示磷酸化的WBP2在Wnt-TCF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起作用(圖18B)。據(jù)證實(shí)Wnt激活以及TCF1促進(jìn)ERα反式激活(30)。我們還顯示W(wǎng)nt誘導(dǎo)的TCF報(bào)道活性在Y192-231E表達(dá)細(xì)胞中大大增強(qiáng)(圖18B)。然后，我們檢測了ERα和Wnt途徑對WBP2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的相對貢獻(xiàn)。當(dāng)用他莫昔芬處理Y192-231E表達(dá)MCF7時(shí)不可以觀察到顯著生長抑制(圖18C)。甚至在高達(dá)2000nM的較高劑量，通過他莫昔芬的Y192-231E表達(dá)細(xì)胞的增殖遲緩仍不顯著。FH535是最近鑒定的TCF/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制物(31)。我們的初步研究顯示FH535抑制β-連環(huán)蛋白的募集，并且在Y192-231E表達(dá)MCF7中用15μΜF(xiàn)H535處理后24-hr，TCF活性減少50%。與他莫昔芬相比，單獨(dú)FH535處理在第3天使Y192-231E15表達(dá)MCF7的生長速率顯著降低至接近載體表達(dá)MCF7。當(dāng)他莫昔芬和FH535聯(lián)合給藥時(shí)不可以觀察到協(xié)同效應(yīng)。在消除WBP2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖中，Wnt途徑的抑制比ERα的抑制更有效。我們還比較了載體和Y192-231E穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子對FH535的敏感性。雖然在兩種轉(zhuǎn)染子中均觀察到FH5353的劑量依賴性生長抑制，但是Y192-231E表達(dá)MCF7比載體表達(dá)MCF7對FH535介導(dǎo)的生長抑制更敏感(圖18C)。這暗示W(wǎng)nt抑制可以特異性地選擇針對具有高表達(dá)的酪氨酸磷酸化的WBP2的乳腺癌。考慮到ERα在ER陽性乳腺癌中的中心作用以及Wnt途徑調(diào)節(jié)ERα活性的知識(shí)，我們詢問Y192-231E表達(dá)MCF7的FH535介導(dǎo)的生長抑制是否可以包括以與他莫昔芬不同的方式破壞ERα表達(dá)或激活。如圖18D所示，單獨(dú)FH535處理而不是他莫昔芬顯著減少ERα表達(dá)而不影響WBP2表達(dá)，暗示W(wǎng)BP2的磷酸化可以通過Wnt途徑激活上調(diào)ERα表達(dá)?？紤]到ERα在ER陽性乳腺癌中的中心作用以及Wnt途徑調(diào)節(jié)ERα活性的知識(shí)，我們詢問Y192-231E表達(dá)MCF7的FH535介導(dǎo)的生長抑制是否可以包括以與他莫昔芬不同的方式破壞ERα表達(dá)或激活。有趣的是，單獨(dú)FH535處理而不是他莫昔芬顯著減少ERα表達(dá)(很像選擇性雌激素受體下調(diào)物，氟維司群)而不影響WBP2表達(dá)(圖18G)。這提示W(wǎng)BP2的磷酸化可以通過Wnt途徑激活上調(diào)ERα表達(dá)。因?yàn)镕H535看來像氟維司群一樣在降低ER水平中作用，所以我們比較了兩種藥物對WBP2介導(dǎo)的乳腺癌生長和增殖的影響。首先，我們將WBP2磷酸化模擬表達(dá)MCF7細(xì)胞暴露于系列濃度的氟維司群(0.1nM、1nM、10nM、100nM和1μΜ)并探查ERα表達(dá)以確定有效工作濃度。100nM氟維司群幾乎完全消除ERα表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。然后，我們比較了在l00nM氟維司群或15μΜF(xiàn)H535的存在下WBP2磷酸化模擬突變體表達(dá)MCF7的生長和增殖。結(jié)果顯示在第4天氟維司群分別抑制表達(dá)載體和Y192-231E突變體的MCF7細(xì)胞的生長約50%和40%(圖6H)。相比之下，在第4天FH535分別減少表達(dá)載體和Y192-231E突變體的MCF7細(xì)胞的增殖約30%和65%。在氟維司群和FH535之間觀察到很少協(xié)同。因此，通過FH535抑制在載體對照和WBP2磷酸化模擬突變體之間產(chǎn)生細(xì)胞增殖干擾的更顯著差異。通過FH535的更顯著的抑制并不令人驚訝，因?yàn)閃nt不僅可以調(diào)節(jié)ERα的表達(dá)(圖18G)，而且還可能調(diào)節(jié)其他癌基因。結(jié)果表明雖然ER表達(dá)很重要，但是與ERα途徑相比，WBP2磷酸化模擬驅(qū)動(dòng)的MCF7細(xì)胞更依賴于Wnt。討論用雌激素刺激ER陽性乳腺癌細(xì)胞通過EGFR串話導(dǎo)致WBP2在Tyr192和Tyr231處的酪氨酸磷酸化。WBP2磷酸化通過c-Src(EGFR的上游/下游)和c-Yes(可能是EGFR的下游)酪氨酸激酶調(diào)節(jié)。酪氨酸磷酸化增加WBP2進(jìn)入核，在那里其可能與ERα形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物并以雌激素依賴性方式導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄的總體增加。提高的WBP2表達(dá)和磷酸化不僅增強(qiáng)ERα信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而且還激活多種癌基因如Wnt并促進(jìn)它們與ERα的串話，導(dǎo)致獨(dú)立于雌激素的ERα信號(hào)傳導(dǎo)的進(jìn)一步增強(qiáng)-所有這些均有助于乳腺癌的侵襲性特征。雖然已報(bào)道WBP2在ERα和PR反式激活中的作用(11)，但是我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示W(wǎng)BP2的共激活功能是通過酪氨酸磷酸化來調(diào)節(jié)的。其他類固醇激素受體共激活蛋白也利用磷酸化來調(diào)節(jié)它們的功能。例如，據(jù)發(fā)現(xiàn)AIB1在IGF1、EGF和雌激素處理時(shí)通過c-Abl在Tyrl357處酪氨酸磷酸化(4)。AIB1的酪氨酸磷酸化改變其與ERα、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(CBP/p300)和甲基轉(zhuǎn)移酶(CARMl)的相互作用(4)。另一方面，NRIF3的絲氨酸磷酸化增加其核定位、與ERα的相互作用，并且隨后增加ERα反式激活(5)。Tyr192和Tyr231包埋在由3個(gè)高度保守的PY基序組成的WBP2的聚脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域內(nèi)。PY基序介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用，并且存在于許多轉(zhuǎn)錄因子和共激活蛋白中，包括c-Jun(32)、AP-2(33)、C/EBPa(34)和PEBP(35)。可以相信Tyr192和Tyr231的磷酸化通過控制PY基序介導(dǎo)的與轉(zhuǎn)錄和/或表觀遺傳學(xué)機(jī)制中的其他配對物的相互作用來調(diào)節(jié)WBP2的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白作用。進(jìn)行蛋白相互作用研究以測試這種假設(shè)。然而，WBP2的共激活蛋白活性并不絕對通過Tyr192和231處的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)，暗示W(wǎng)BP2的其他區(qū)域?qū)τ谄涔δ芤卜浅Ｖ匾?。例如，?bào)道的Nedd4E3連接酶結(jié)合至WBP2的脯氨酸富集區(qū)表明蛋白穩(wěn)定性(例如轉(zhuǎn)錄組分)的調(diào)節(jié)可以是另一種模式，通過這種模式WBP2調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(36,37)。出現(xiàn)的證據(jù)已證實(shí)轉(zhuǎn)錄共激活蛋白在腫瘤發(fā)生中的重要性。在正常乳腺上皮細(xì)胞-MCFlOA中TAZ的過表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)變化特征并增加細(xì)胞遷移/侵襲(3)。在MCF7中NRIF3及其S28E磷酸化模擬突變體的過表達(dá)增加細(xì)胞增殖和貼壁不依賴性生長(5)。相似地，在MEF中AIB1及其Y1357E磷酸化模擬突變體的過表達(dá)誘導(dǎo)集落形成(4)。還發(fā)現(xiàn)AIBl的磷酸化Y1357水平在MMTV驅(qū)動(dòng)的HER2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)展的乳腺腫瘤中升高(4)。我們關(guān)于WBP2過表達(dá)及其酪氨酸磷酸化在細(xì)胞增殖、貼壁不依賴性生長、遷移和侵襲中起關(guān)鍵作用的發(fā)現(xiàn)為癌癥治療的未來研究鋪平了道路，所述癌癥治療利用WBP2作為藥物靶標(biāo)用于治療ERα/PR陽性乳腺癌以補(bǔ)充激素療法或者甚至治療其他亞型如沒有標(biāo)準(zhǔn)治療方案的三陰性乳腺癌。我們的初步篩選顯示W(wǎng)BP2表達(dá)在正常乳腺上皮細(xì)胞中低或不可檢測，但是在包括ER陰性乳腺癌細(xì)胞的不同分子亞型的12/16個(gè)人乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)(未公開的數(shù)據(jù))。雖然WBP2增強(qiáng)E2/ERα信號(hào)傳導(dǎo)，但是ER陰性乳腺癌細(xì)胞系中WBP2的過表達(dá)表明WBP2的功能并不嚴(yán)格依賴于或受限于ERα。這與WBP2及其磷酸化模擬形式單獨(dú)過表達(dá)可以在E2/ERα信號(hào)傳導(dǎo)不存在的情況下驅(qū)動(dòng)許多生物化學(xué)和細(xì)胞過程的觀察一致。可以相信WBP2可以發(fā)揮其對其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白功能，例如AIBl是ERα以外的多種其他核受體(包括E2F-1(38)、NF-KB(6)和STAT6(39))的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白。WBP2及其酪氨酸磷酸化有助于通過基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的癌癥的標(biāo)志。在我們的研究中已檢測到許多與EMT(例如E鈣粘著蛋白和ZO-2緊密連接蛋白的下調(diào))和對凋亡的抗性(例如BCL2的上調(diào))相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)波動(dòng)。與ERα(YAP、ERa、細(xì)胞周期蛋白Dl)和Wnt(Wnt3a、磷酸化GSKβ、β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期蛋白Dl、c-Myc)相關(guān)的基因的上調(diào)可以賦予這個(gè)研究中觀察的乳腺癌細(xì)胞生長獨(dú)立性表型(例如在雌激素不存在的情況下更高的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲潛力)。更全面的基因表達(dá)譜對于作圖WBP2的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的整體類別是令人感興趣的。Wnt途徑組分與核受體家族成員的交叉調(diào)節(jié)在內(nèi)分泌生物學(xué)中變得重要(29)。β-連環(huán)蛋白與ERα相關(guān)，并且它們的相互作用在雌激素的存在下增強(qiáng)(40)，從而促進(jìn)ERα反式激活。然而，在促進(jìn)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤發(fā)生中ERα/β-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)仍不清楚。已證實(shí)β-連環(huán)蛋白募集共激活蛋白，如p300/CBP復(fù)合物(41)以及SWI/SNF和RSC染色質(zhì)重塑復(fù)合物的組分(42)，這可以解釋部分調(diào)節(jié)機(jī)制。有助于這個(gè)復(fù)雜過程，我們鑒定了WBP2作為推定的雌激素-→EGFR→WBP2→Wnt→ER途徑中的新介質(zhì)(簡單地)。我們的數(shù)據(jù)顯示W(wǎng)BP2上調(diào)雌激素和Wnt途徑中的信號(hào)傳導(dǎo)組分，但是尚不清楚這些怎樣實(shí)現(xiàn)。WBP2通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子合作直接作用以驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)或者WBP2通過其上調(diào)的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)物(例如β-連環(huán)蛋白)間接作用？WBP2還參與染色質(zhì)重塑復(fù)合物或促進(jìn)更高級(jí)的復(fù)合物如長范圍染色質(zhì)相互作用的形成嗎？這些是將解決的問題。我們的數(shù)據(jù)提供對Wnt信號(hào)傳導(dǎo)可以怎樣調(diào)節(jié)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)的新的深入了解。表達(dá)磷酸化模擬WBP2的MCF7中ERα表達(dá)的增加加上觀察到的Wnt抑制后ERα表達(dá)的下調(diào)表明ERα基因本身可以是LEFl/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的靶標(biāo)。這不是沒有先例-在前列腺癌細(xì)胞中ARmRNA通過Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的激活高度上調(diào)(43)。雖然正常乳腺上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化活性尚未評(píng)價(jià)，但是WBP2表現(xiàn)像癌基因。WBP2的酪氨酸磷酸化用作分子通/斷開關(guān)，控制雌激素、EGF和Wnt/其他癌基因信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間的串話，導(dǎo)致ER受體活性的擴(kuò)增、多種癌基因和腫瘤抑制物的失調(diào)。所有這些可以合作作用以促進(jìn)失控的乳腺癌生長。我們的研究已將WBP2加入增加的參與乳腺癌的核受體共激活蛋白的列表(AJBl、NRIF3、YAP、TAZ等)。MCF7中野生型和磷酸化模擬突變體-WBP2的過表達(dá)在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤形成為了評(píng)價(jià)WBP2的體內(nèi)意義及其在促進(jìn)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的磷酸化，我們用表達(dá)載體、WBP2磷酸化模擬和磷酸化缺陷突變體的MCF7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子進(jìn)行了異種移植研究。結(jié)果顯示載體對照MCF7細(xì)胞是弱致瘤的，而表達(dá)WBP2和Y192-231E磷酸化模擬突變體的細(xì)胞形成比對照細(xì)胞大3-4倍的腫瘤。如圖10所示，表達(dá)磷酸化缺陷的WBP2突變體的細(xì)胞僅產(chǎn)生比對照細(xì)胞略大的腫瘤。MCF10A中WBP2和Y192-231D磷酸化缺陷突變體的過表達(dá)在MCF10A中的乳腺腫瘤發(fā)生中起作用為了研究WBP2作為乳腺癌中的潛在癌基因，我們在正常乳腺上皮細(xì)胞-MCFlOA產(chǎn)生了載體、WBP2-WT和Y192-231D過表達(dá)轉(zhuǎn)染子的穩(wěn)定池。2D培養(yǎng)中的形態(tài)學(xué)檢測顯示當(dāng)WBP2過表達(dá)時(shí)，形態(tài)學(xué)變化為較不緊湊的更成纖維細(xì)胞狀的表型。如圖9所示，使這種WBP2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子進(jìn)行各種體外細(xì)胞生長測定，包括細(xì)胞增殖、軟瓊脂克隆形成和細(xì)胞侵襲測定。WBP2-WT及其磷酸化模擬突變體的過表達(dá)均促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲潛力。然而，WBP2-WT不賦予正常乳腺上皮細(xì)胞貼壁不依賴性生長。相比之下，WBP2磷酸化模擬突變體表達(dá)MCF10A細(xì)胞在軟瓊脂中生長好5倍。與WT-和Y192-231E-WBP2過表達(dá)相關(guān)的更多蛋白表達(dá)活性變化如圖11所示，在MCF10A中檢測到蛋白表達(dá)和/或活性的變化與WT-和Y192-231D-WBP2過表達(dá)相關(guān)。觀察到增加的Wnt途徑激活(Wnt3a、β-連環(huán)蛋白、GSK、Myc、細(xì)胞周期蛋白Dl)。其他變化包括增加的Akt活性、上調(diào)的波形蛋白(EMT標(biāo)記)和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)以及細(xì)胞周期抑制物p16的下調(diào)。WBP2表達(dá)與分化狀態(tài)相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性研究以了解WBP2是否在干細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起作用。在HM-1細(xì)胞中檢測WBP2表達(dá)，HM-1細(xì)胞是次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)缺陷的，來源于HPRT缺陷株129小鼠，其特征在于高多能性。有趣的是，WBP2表達(dá)在誘導(dǎo)HM-1細(xì)胞分化時(shí)下調(diào)(圖12)。WBP2的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)其與TAZ的相互作用最近證實(shí)TAZ介導(dǎo)的癌基因轉(zhuǎn)化通過WBP2-TAZ相互作用需要WBP2。因此我們檢測了WBP2的酪氨酸磷酸化是否調(diào)節(jié)其與TAZ的相互作用。如圖13所示，在EGF刺激時(shí)WBP2的酪氨酸磷酸化促進(jìn)WBP2-TAZ相互作用，這在消除酪氨酸磷酸化時(shí)被破壞。在過表達(dá)WBP2-Y192-231E的MCF細(xì)胞中E2F報(bào)道活性增強(qiáng)以前已鑒定WBP2為轉(zhuǎn)錄共激活蛋白。可能WBP2通過影響多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來發(fā)揮其作用。為了鑒定可以解釋W(xué)BP2效應(yīng)的潛在途徑，我們篩選了許多途徑報(bào)道基因。我們發(fā)現(xiàn)E2F報(bào)道活性在過表達(dá)WBP2-Y192-231E的細(xì)胞中增加。這可以指示W(wǎng)BP2的磷酸化激活E2F途徑。這是我們已鑒定的由WBP2激活的第三個(gè)癌基因途徑-其他是Wnt和ER途徑。在過表達(dá)WBP2-Y192-231E的MCF7細(xì)胞中觀察到增加的細(xì)胞周期發(fā)展增加的E2F活性最常與細(xì)胞周期發(fā)展相關(guān)。BrdU摻入測定允許檢測已通過S-期的細(xì)胞。下文的結(jié)果顯示表達(dá)WBP2-Y192-231E的MCF7細(xì)胞更快通過細(xì)胞周期。E2F蛋白水平在過表達(dá)WBP2-Y192-231E的細(xì)胞中增加E2F途徑包含分類為激活物或抑制物的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。E2F活性的增加可以歸因于升高的E2F轉(zhuǎn)錄激活物水平。因此我們探查了E2F1、E2F2和E2F3的表達(dá)。在表達(dá)WBP2-Y192-231E的細(xì)胞中觀察到蛋白水平的可檢測的升高。在表達(dá)WBP2-Y192-231E的MCF7細(xì)胞中E2F1和E2F3的敲低減少E2F活性、細(xì)胞周期發(fā)展和細(xì)胞增殖E2F1和E2F3均關(guān)聯(lián)至細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期發(fā)展。為了研究E2F1和E2F3水平的升高是否可以導(dǎo)致觀察到的表型，將過表達(dá)WBP2-Y192-231E的MCF7細(xì)胞用靶向E2F1和E2F3的siRNA轉(zhuǎn)染。針對E2F1和E2F3的siRNA均導(dǎo)致減少的螢光素酶活性、減少的細(xì)胞周期發(fā)展和減少的細(xì)胞增殖。E2F途徑可能對于介導(dǎo)磷酸化模擬WBP2的效應(yīng)是重要的。用雌激素刺激ERD陽性乳腺癌細(xì)胞通過EGFR串話導(dǎo)致WBP2在Tyr192和Tyr231處的酪氨酸磷酸化。WBP2磷酸化通過c-Src(EGFR的上游/下游)和c-Yes(可能是EGFR的下游)酪氨酸激酶調(diào)節(jié)。酪氨酸磷酸化增加WBP2進(jìn)入核，在那里其可能與ERα形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物并以雌激素依賴性方式導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄的總體增加。提高的WBP2表達(dá)和磷酸化不僅增強(qiáng)ERα信號(hào)傳導(dǎo)途徑，而且還激活多種癌基因如Wnt并促進(jìn)與ERα的串話，導(dǎo)致獨(dú)立于雌激素的ERα信號(hào)傳導(dǎo)的進(jìn)一步增強(qiáng)-所有這些均有助于乳腺癌的侵襲性特征。雖然已報(bào)道WBP2在ERα和PR反式激活中的作用(11)，但是我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示W(wǎng)BP2的共激活功能是通過酪氨酸磷酸化來調(diào)節(jié)的。其他類固醇激素受體共激活蛋白也利用磷酸化來調(diào)節(jié)它們的功能。例如，據(jù)發(fā)現(xiàn)AIBl在IGF1、EGF和雌激素處理時(shí)通過c-Abl在Tyrl357處酪氨酸磷酸化(4)。AIBl的酪氨酸磷酸化改變其與ERα、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(CBP/p300)和甲基轉(zhuǎn)移酶(CARM1)的相互作用(4)。另一方面，NRIF3的絲氨酸磷酸化增加其核定位、與ERα的相互作用，并且隨后增加ERα反式激活(5)。Tyr192和Tyr231包埋在由3個(gè)高度保守的PY基序組成的WBP2的聚脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域內(nèi)。PY基序介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用，并且存在于許多轉(zhuǎn)錄因子和共激活蛋白中，包括c-Jun(38)、AP-2(39)、C/EBPa(40)和PEBP(41)?？梢韵嘈臫yr192和Tyr231的磷酸化通過控制PY基序介導(dǎo)的與轉(zhuǎn)錄和/或表觀遺傳學(xué)機(jī)制中的其他配對物的相互作用來調(diào)節(jié)WBP2的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白作用。最近，已報(bào)道TAZ的癌基因活性需要TAZ通過其ww結(jié)構(gòu)域與WBP2的PY基序相互作用(32)。可以相信WBP2的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)其與TAZ的相互作用，從而促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白活性，從而驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生。進(jìn)行研究以測試這種假設(shè)。然而，WBP2的共激活蛋白活性并不絕對通過Tyr192和231處的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)，暗示W(wǎng)BP2的其他區(qū)域?qū)τ谄涔δ芤卜浅Ｖ匾?。例如，?bào)道的Nedd4E3連接酶結(jié)合至WBP2的脯氨酸富集區(qū)表明蛋白穩(wěn)定性(例如轉(zhuǎn)錄組分)的調(diào)節(jié)可以是另一種模式，通過這種模式WBP2調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(42,43)。出現(xiàn)的證據(jù)已證實(shí)轉(zhuǎn)錄共激活蛋白在腫瘤發(fā)生中的重要性。在正常乳腺上皮細(xì)胞-MCFlOA中TAZ的過表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)變化特征并增加細(xì)胞遷移/侵襲(3)。在MCF7中NRIF3及其S28E磷酸化模擬突變體的過表達(dá)增加細(xì)胞增殖和貼壁不依賴性生長(5)。相似地，在MEF中AIB1及其Y1357E磷酸化模擬突變體的過表達(dá)誘導(dǎo)集落形成(4)。還發(fā)現(xiàn)AIB1的磷酸化Y1357水平在MMTV驅(qū)動(dòng)的HER2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)展的乳腺腫瘤中升高(4)。我們關(guān)于WBP2過表達(dá)及其酪氨酸磷酸化在細(xì)胞增殖、貼壁不依賴性生長、遷移和侵襲中起關(guān)鍵作用的發(fā)現(xiàn)為癌癥治療的未來研究鋪平了道路，所述癌癥治療利用WBP2作為藥物靶標(biāo)用于治療ERα/PR陽性乳腺癌以補(bǔ)充激素療法或者甚至治療其他亞型如沒有標(biāo)準(zhǔn)治療方案的三陰性乳腺癌。我們的初步篩選顯示W(wǎng)BP2表達(dá)還在ER陰性乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)(未公開的數(shù)據(jù))。雖然WBP2增強(qiáng)E2/ERα信號(hào)傳導(dǎo)，但是ER陰性乳腺癌細(xì)胞系中WBP2的過表達(dá)表明WBP2的功能并不嚴(yán)格依賴于或受限于ERα。這與WBP2及其磷酸化模擬形式單獨(dú)過表達(dá)可以在E2/ERα信號(hào)傳導(dǎo)不存在的情況下驅(qū)動(dòng)許多生物化學(xué)和細(xì)胞過程的觀察一致?？梢韵嘈臰BP2可以發(fā)揮其對其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白功能，例如AIBl是ERα以外的多種其他核受體(包括E2F-1(44)、NF-KB(6)和STAT6(45))的轉(zhuǎn)錄共激活蛋白。WBP2及其酪氨酸磷酸化有助于通過基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的癌癥的標(biāo)志。在我們的研究中已檢測到許多與EMT(例如E鈣粘著蛋白和ZO-2緊密連接蛋白的下調(diào)以及波形蛋白的上調(diào))和對凋亡的抗性(例如BCL2的上調(diào))相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)波動(dòng)。與ERα(YAP、ERa、細(xì)胞周期蛋白Dl)和Wnt(Wnt3a、磷酸化GSKβ、β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期蛋白Dl、c-Myc)相關(guān)的基因的上調(diào)可以賦予這個(gè)研究中觀察的乳腺癌細(xì)胞激素獨(dú)立性表型(例如在雌激素不存在的情況下更高的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲潛力)。特別有趣的是通過WBP2的ER和Wnt途徑的上調(diào)。Wnt途徑組分與核受體家族成員的交叉調(diào)節(jié)在內(nèi)分泌生物學(xué)中變得越來越重要(35)。β-連環(huán)蛋白與ERα相關(guān)，并且它們的相互作用在雌激素的存在下增強(qiáng)(46)，從而促進(jìn)ERα反式激活。然而，在促進(jìn)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤發(fā)生中ERα/β-連環(huán)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)仍不清楚。已證實(shí)β-連環(huán)蛋白募集共激活蛋白，如p300/CBP復(fù)合物(47)以及SWI/SNF和RSC染色質(zhì)重塑復(fù)合物的組分(48)，這可以解釋部分調(diào)節(jié)機(jī)制。利用藥理學(xué)抑制劑，我們顯示干擾WBP2誘導(dǎo)的Wnt途徑減少ERα表達(dá)，并且與ERα途徑相比，WBP2介導(dǎo)的乳腺癌更依賴于Wnt途徑。所有數(shù)據(jù)放在一起，我們鑒定了WBP2作為推定的雌激素→EGFR→WBP2→Wnt→ERa途徑中的新介質(zhì)(簡單地)。我們的數(shù)據(jù)顯示W(wǎng)BP2上調(diào)雌激素和Wnt途徑中的信號(hào)傳導(dǎo)組分。然而，這些是如何實(shí)現(xiàn)的仍有待研究。WBP2通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子合作直接作用以驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)或者WBP2通過其上調(diào)的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)物(例如β-連環(huán)蛋白、YAP)間接作用？WBP2還參與染色質(zhì)重塑復(fù)合物或促進(jìn)更高級(jí)的復(fù)合物如長范圍染色質(zhì)相互作用的形成嗎？這些問題目前正在我們實(shí)驗(yàn)室中解決。我們的數(shù)據(jù)提供對Wnt信號(hào)傳導(dǎo)可以怎樣調(diào)節(jié)雌激素信號(hào)傳導(dǎo)的新的深入了解。表達(dá)磷酸化模擬WBP2的MCF7中ERα表達(dá)的增加加上觀察到的Wnt抑制后ERα表達(dá)的下調(diào)表明ERα基因本身可以是LEFl/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的靶標(biāo)。這不是沒有先例-在前列腺癌細(xì)胞中ARmRNA通過Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的激活高度上調(diào)(49)。與最近的報(bào)道(32)一致，我們顯示在正常乳腺上皮細(xì)胞中單獨(dú)WBP2表達(dá)不足以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。取而代之，WBP2的磷酸化模擬突變體表現(xiàn)像癌基因，賦予MCF10A正常上皮細(xì)胞在軟瓊脂中的貼壁不依賴性生長并賦予乳腺癌細(xì)胞侵襲性特征?？梢韵嘈帕姿峄l(fā)WBP2，否則需要其他因素(與其他蛋白配對物的相互作用、其他修飾)用于合作功能。WBP2的酪氨酸磷酸化可以用作分子通/斷開關(guān)，控制雌激素、EGF和Wnt/其他癌基因信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間的串話，導(dǎo)致ERD受體活性的擴(kuò)增、多種癌基因和腫瘤抑制物的失調(diào)。我們的研究將WBP2加入增加的參與乳腺癌的核受體共激活蛋白的列表(AIB1、NRTF3、YAP、TAZ等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解本文所述的發(fā)明易受本文具體描述的以外的變化和修飾的影響。本發(fā)明包括所有這樣的變化和修飾。本發(fā)明還包括說明書單獨(dú)或共同提到或指示的所有步驟、特征、制劑和化合物，以及任何和全部組合或者任何兩個(gè)或更多個(gè)步驟或特征。本文中引用的每個(gè)文件、參考文獻(xiàn)、專利申請或?qū)＠鞔_地整體援引加入本文，這意味著讀者應(yīng)當(dāng)將其閱讀和考慮為本文的部分。本文引用的文件、參考文獻(xiàn)、專利申請或?qū)＠诒疚闹胁恢貜?fù)僅僅是為了簡潔的目的。本文提到的任何產(chǎn)品或援引加入本文的任何文件中的任何制造商的說明書、描述、產(chǎn)品說明書和產(chǎn)品頁均援引加入本文，并且可以用于本發(fā)明的實(shí)施。本發(fā)明的范圍并不限于本文所述的任何具體實(shí)施方案的范圍。這些實(shí)施方案僅為了例證的目的。明確地，功能等同的產(chǎn)品、制劑和方法在如本文所述的發(fā)明的范圍內(nèi)。本文所述的發(fā)明可以包括一個(gè)或多個(gè)范圍的值(例如大小、濃度等)。值的范圍理解為包括該范圍內(nèi)的所有值，包括定義該范圍的值，以及導(dǎo)致相同或基本上相同的結(jié)果的鄰近該范圍的值，因?yàn)樵撝稻o鄰定義該值的界限的值。在整個(gè)說明書中，除非上下文另有要求，詞語“包含(comprise)”或變異如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”理解為表示包括所述整數(shù)或整數(shù)的組但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)的組。還注意到在本公開中，特別是在權(quán)利要求書和/或段落中，術(shù)語如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等可以具有美國專利法中歸于它的含義；例如，它們可以表示“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；并且那些術(shù)語如“基本上由…組成(consistingessentiallyof)和”基本上由…組成(consistsessentiallyof)具有美國專利法歸于它們的含義，例如它們允許未明確列舉的元件，但是排除現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的元件或者影響本發(fā)明的基本或新特征的元件。本文使用的所選術(shù)語的其他定義可以在本發(fā)明的詳細(xì)描述中找到并始終應(yīng)用。除非另有定義，本文所用的所有其他科學(xué)和技術(shù)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。參考文獻(xiàn)1.Lee,J.W.,Lee,Y.C,Na,S.Y.,Jung,D.J.,andLee,S.K.(2001)Transcriptionalcoregulatorsofthenuclearreceptorsuperfamily:coactivatorsandcorepressors.CellMolLifeSci58,289-2972.McKenna,N.J.,andO'Malley,B.W.(2002)Combinatorialcontrolofgeneexpressionbynucle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