專利名稱：核酸的檢測方法以及裝置、試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多鏈核酸的檢測方法、以及多鏈核酸檢測裝置或試劑盒技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域、基因檢測等的臨床應(yīng)用領(lǐng)域中，對靶核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增的方法成為非常重要的技術(shù)。作為核酸擴(kuò)增方法，最通用的是PCR法(Polymerase Chain Reaction),但需要復(fù)雜的溫度控制；因此，還開發(fā)出了 LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)法、ICAN(Isothermal and Chimericprimer-1nitiated Amplification of Nucleic acids)法等的等溫擴(kuò)增方法。通過PCR法、LAMP法、ICAN法等擴(kuò)增出的核酸是雙鏈的，在檢測方法中，使用熒光染料的方法的研究盛行。最普通的方法是，是對擴(kuò)增反應(yīng)后的溶液實施瓊脂糖電泳，使之與EthidiumBromide、SYBR Green等突光性嵌入劑(intercalator)結(jié)合,而對特異性的突光進(jìn)行觀察的方法(非專利文件I)。但是，電泳后利用熒光性嵌入劑進(jìn)行檢測的方法，需要30分鐘 I小時左右的泳動時間，而且需要對熒光進(jìn)行檢測的UV照射裝置、熒光檢測器等昂貴的儀器。在沒有與其他DNA混合的可能性，只是對擴(kuò)增產(chǎn)物的有無進(jìn)行判斷時，預(yù)先在PCR開始前的反應(yīng)液中添加熒光性嵌入劑，在擴(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行熒光檢測，就可以省略電泳(專利文件I)。但是，存在如下問題:熒光性嵌入劑會與引物等單鏈核酸結(jié)合，因此使背景信號增強(qiáng)，而使得檢測靈敏度下降。相對于此，有人開發(fā)了:使用與單鏈核酸結(jié)合的熒光性嵌入劑優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)的化合物進(jìn)行處理而降低背景信號的方法(專利文獻(xiàn)2)，以及與單鏈核酸相比，與雙鏈核酸的反應(yīng)特異性得到提高的熒光染料(專利文獻(xiàn)3);但是，在進(jìn)行熒光檢測這一點上沒有變化。此外，也有人開發(fā)了通過采用熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，并用熒光偏振進(jìn)行檢測的方法(專利文獻(xiàn)4)，但通常存在如下問題:熒光引物通常是高價的，或者需要對沒能與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合的熒光標(biāo)記引物進(jìn)行分離操作，因此是較為繁瑣的?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特開平5-237000號公報專利文獻(xiàn)2:國際公開第2002/103053號專利文獻(xiàn)3:日本特開2003-240780號公報專利文獻(xiàn)4:日本特開平9-187275號公報非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)I:Molecular Cloning Second Edition, vol.1,6.15(1989)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的問題在于提供不需要復(fù)雜的操作和特殊的裝置、簡單并且迅速地對核酸擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增出的多鏈核酸進(jìn)行檢測的多鏈核酸的檢測方法，以及多鏈核酸的檢測裝置或試劑盒。解決問題的方法本發(fā)明人為解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過使多鏈核酸與顯色性的無色型染料接觸，使無色型染料的脫離基解離而顯色，利用可視光能夠檢測出核酸。并且，發(fā)現(xiàn)利用這樣的原理可以制作多鏈核酸檢測裝置或試劑盒，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及多鏈核酸的檢測方法，其包括:使顯色性的無色型染料與多鏈核酸接觸的工序，該方法中，用可見光對因無色型染料與多鏈核酸的相互作用而呈現(xiàn)的色調(diào)進(jìn)行檢測。優(yōu)選無色型染料是通式(I)所表示的化合物，(化學(xué)式I)
權(quán)利要求
1.多鏈核酸的檢測方法，其包括: 使顯色性的無色型染料與多鏈核酸接觸的工序， 該方法中，用可見光對因無色型染料與多鏈核酸的相互作用而呈現(xiàn)的色調(diào)進(jìn)行檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中， 無色型染料是通式(I)所表示的化合物，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中，所述通式(I)所表示的化合物是通式(II)所表示的化合物，
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項所述的檢測方法，其中， 無色型染料為三芳基甲烷類染料與親核劑的反應(yīng)產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其中， 三芳基甲烷類染料是選自龍膽紫、結(jié)晶紫、甲基綠、孔雀綠、維多利亞藍(lán)、副品紅以及它們的衍生物中的I種以上的染料。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的檢測方法，其中， 親核劑為選自亞硫酸根離子、亞硫酸氫根離子、硝酸根離子、亞硝酸根離子、氰離子、鹵化物離子、氮親核劑、硫親核劑、堿金屬烷氧化物、堿金屬氫氧化物、以及氫化物親核劑中的I種以上的親核劑。
7.多鏈核酸檢測裝置或試劑盒，其含有: (d)保持無色型染料的載體，(e)供被檢測物通過載體(d)的通路，以及 (f)用可見光檢測因被檢測物與無色型染料相互作用而呈現(xiàn)的色調(diào)，從而對多鏈核酸的存在進(jìn)行判定的部位。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置或試劑盒， 無色型染料是通式(I)所表示的化合物，
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的裝置或試劑盒，其中， 載體(d)保持三芳基甲烷類染料和親核劑的混合液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置或試劑盒，其中， 三芳基甲烷類染料是選自龍膽紫、結(jié)晶紫、甲基綠、孔雀綠、維多利亞藍(lán)、副品紅以及它們的衍生物中的I種以上的染料。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的裝置或試劑盒，其中， 親核劑為選自亞硫酸根離子、亞硫酸氫根離子、硝酸根離子、亞硝酸根離子、氰離子、鹵化物離子、氮親核劑、硫親核劑、堿金屬烷氧化物、堿金屬氫氧化物、以及氫化物親核劑中的I種以上的親核劑。
全文摘要
本發(fā)明提供不需要特殊的裝置、簡單并且高精度地對核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增出的多鏈核酸進(jìn)行檢測的方法以及核酸檢測裝置。本發(fā)明提供利用顯色性的無色型染料與多鏈核酸相接觸而產(chǎn)生的顯色反應(yīng)，通過可見光對核酸進(jìn)行檢測的方法，以及使用該方法的核酸檢測裝置。
文檔編號G01N33/52GK103119178SQ201180045639
公開日2013年5月22日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月22日
發(fā)明者宮本重彥, 直原啟明, 佐野創(chuàng)太郎, 高橋孝治, 友野潤 申請人:株式會社鐘化