專(zhuān)利名稱：嗜鉻粒蛋白a的免疫測(cè)定法、抗體和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測(cè)定嗜鉻粒蛋白A (CGA)的方法。它還涉及針對(duì)CGA的單克隆抗體和以其為基礎(chǔ)的、可被用于本發(fā)明的測(cè)定法的免疫試劑，以及用于CGA的測(cè)定方法中的檢驗(yàn)試劑盒。
背景技術(shù)：
嗜鉻粒蛋白(CG)和分泌粒蛋白組成了與神經(jīng)遞質(zhì)和肽類(lèi)激素共同儲(chǔ)存在大腦和彌散神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中的酸性蛋白質(zhì)家族(Winkler, H. &Fischer-Colbrie, R.，1992)。雖然這些蛋白質(zhì)是不同基因的產(chǎn)物，但它們共有ー些總體結(jié)構(gòu)特性，例如豐富的酸性氨基酸殘基和作為翻譯后切割的潛在位置的幾對(duì)堿性氨基酸。CG與神經(jīng)肽和激素在全身神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中共同儲(chǔ)存和共同釋放。已經(jīng)提出了 CG在激素顆粒產(chǎn)生和激素包裝中的作用。此外，CG可以被切割成較小的片段，所述片段表現(xiàn)出生物活性，例如抑制激素釋放、血管擴(kuò)張和抗 微生物作用(Stridsberg M, 2000)。神經(jīng)內(nèi)分泌起源的腫瘤通常表現(xiàn)出CGA血清/血漿水平的提高(O，Connor, DT, Deftos LJ, 1986)。神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，典型的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是類(lèi)癌瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)腺瘤、垂體瘤和胰島瘤，并包括MENl和MEN2綜合征。這還包括不同的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤綜合征，即胃泌素瘤、胰島素瘤、胰高血糖素瘤、生長(zhǎng)抑素瘤、產(chǎn)胰多肽(PP)瘤(PPomas)和無(wú)功能性神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(Eriksson, B.等，2000)。對(duì)于這些腫瘤，已經(jīng)證明CGA是最好的循環(huán)標(biāo)志物(Bajetta, E.等,1999)。為此原因，希望有用于CGA的定性和定量測(cè)定的特異性的、準(zhǔn)確而快速的測(cè)定法。已經(jīng)報(bào)告了幾種CGA測(cè)定法。US 4，758，522涉及基于競(jìng)爭(zhēng)分析法，使用標(biāo)記的CGA和針對(duì)CGA的抗體來(lái)測(cè)量樣品中人CGA的方法。測(cè)定與抗體結(jié)合或未結(jié)合的標(biāo)記CGA的量作為樣品中CGA的度量。CGA樣品可以得自內(nèi)分泌腺或腎上腺來(lái)源的組織。EP1078266B1涉及基于使用與人CGA的145-234位序列中的表位特異性結(jié)合的至少ー種(單克隆或多克隆)抗體的CGA免疫測(cè)定法。更具體地，它涉及在CGA的免疫測(cè)定法中使用與人CGA的145-197位序列中的表位特異性結(jié)合的抗體和/或與219-234位序列中的表位特異性結(jié)合的抗體。任選，這兩種抗體的任ー種都可以在CGA測(cè)定法中與特異性結(jié)合人CGA的250-301位序列中表位的抗體相組合。本技術(shù)領(lǐng)域中已知方法的缺點(diǎn)是假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，這主要是由于與通常也靠近天然CGA存在的CGA衍生肽的交叉反應(yīng)所致。使用多克隆抗體的測(cè)定法尤其苦于這樣的缺點(diǎn)。已經(jīng)建議過(guò)使用單克隆抗體以便克服這個(gè)問(wèn)題，然而，現(xiàn)有技術(shù)中所述的基于單克隆抗體的CGA測(cè)定法事實(shí)上執(zhí)行起來(lái)甚至還不如基于多克隆抗體的測(cè)定法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及克服或改善這些缺點(diǎn)的方法。本發(fā)明的免疫化學(xué)測(cè)定法基于CGA多肽與兩種新的和獨(dú)特的抗體的特異性結(jié)合，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。ー種抗體與CGA多肽的ー個(gè)表位特異性結(jié)合，另ー種抗體CGA多肽的另一個(gè)表位特異性結(jié)合。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及CGA多肽的測(cè)定方法，所述方法包括將準(zhǔn)備測(cè)定CGA的存在或量的樣品與ー組單克隆抗體反應(yīng)，其中至少ー種單克隆抗體與人CGA氨基酸序列的236至251位氨基酸序列表示的CGA多肽(由SEQ ID NO 2表示)中的表位有反應(yīng)性；并且其中至少ー種其他單克隆抗體與人CGA氨基酸序列的264至279位氨基酸序列表示的CGA多肽(由SEQ ID NO 3表示)中的表位有反應(yīng)性。人CGA的氨基酸序列在此是指Konecki等人在1987年報(bào)告的439個(gè)氨基酸長(zhǎng)的序列，并由SEQ ID NO I表示。術(shù)語(yǔ)CGA多肽意在指示人CGA的全長(zhǎng)多肽序列或者其可用于診斷上面提到的任何疾病的片段。這樣的片段應(yīng)該優(yōu)選至少包含與SEQ ID NO: I和SEQID N0:2所涵蓋的氨基酸序列的反應(yīng)性單克隆抗體起反應(yīng)的表位。
本發(fā)明的免疫化學(xué)測(cè)定法可以具有各種樣式。優(yōu)選，所述免疫測(cè)定法基于夾心樣式-CGA蛋白被夾在所述兩種獨(dú)特的抗體之間。用于檢測(cè)抗體與CGA特異性結(jié)合的適合的樣式舉例為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和放射免疫測(cè)定法(RIA)。其他檢測(cè)方法也可以適當(dāng)?shù)厥褂?。根?jù)另ー種實(shí)施方式，本發(fā)明涉及針對(duì)CGA并與人CGA氨基酸序列的236至251位氨基酸表示的多肽中的表位有反應(yīng)性的單克隆抗體。根據(jù)再ー種實(shí)施方式，本發(fā)明涉及針對(duì)CGA并與人CGA氨基酸序列的264至279位氨基酸表示的多肽中的表位有反應(yīng)性的單克隆抗體。本發(fā)明的又一種實(shí)施方式涉及用于本發(fā)明方法中的檢驗(yàn)試劑盒。這樣的檢驗(yàn)試劑盒包含基于至少兩種單克隆抗體的免疫試劑，一種與人CGA氨基酸序列的236至251位氨基酸表不的多肽中的表位有反應(yīng)性，另ー種與人CGA氨基酸序列的264至279位氨基酸表示的多肽中的表位有反應(yīng)性。每種抗體都可以作為捕獲抗體或作為檢測(cè)抗體使用。檢驗(yàn)試劑盒中包含的免疫試劑取決于所述測(cè)定法的方法和樣式。在一種實(shí)施方式中，至少ー種抗體可以直接或間接同標(biāo)記物結(jié)合，例如酶或放射性標(biāo)志物。在另ー種實(shí)施方式中，至少ー種抗體可以同適合的固相結(jié)合，例如微量滴定板。在另ー種實(shí)施方式中，至少ー種抗體可以同通用的連接劑結(jié)合，例如生物素或鏈霉親和素(已知它們能夠互相結(jié)合)。在所述測(cè)定法之前或過(guò)程期間，可以應(yīng)用這樣的連接劑將抗體與固相或與標(biāo)記物間接結(jié)合。生產(chǎn)針對(duì)ー種所指定的CGA表位的單克隆抗體的細(xì)胞可以通過(guò)例如K(ihler和Milstein在1975年描述的方法獲得。本發(fā)明還涉及分別與人CGA氨基酸序列的236至251位和264至279位氨基酸序列表示的多肽中的表位有反應(yīng)性的單克隆抗體?？傊景l(fā)明提供了與使用單克隆抗體的現(xiàn)有技術(shù)方法相比具有改善的特異性和靈敏度、同時(shí)避免了使用多克隆抗體的測(cè)定法的缺點(diǎn)的方法。附I /4CGA校準(zhǔn)曲線
圖2/4本發(fā)明的檢驗(yàn)與商業(yè)檢驗(yàn)(Dako)之間的比較圖3/4本發(fā)明的檢驗(yàn)與商業(yè)檢驗(yàn)(CIS-BIO)之間的比較圖4/4在NE0LISA中分析的，來(lái)自于107份神經(jīng)內(nèi)分泌患者血漿和120份獻(xiàn)血者血漿的血漿。基準(zhǔn)面〈3. 0 (紅線)。實(shí)施例材料-涂有針對(duì)CGA的236-251位肽的單克隆抗體的微量滴定板(12x8)。-含有在稀釋劑中的人CGA的校準(zhǔn)品。Call=0nmol/L (稀釋劑)，Cal 2=lnmol/L, Cal3=5nmol/L, Cal 4=15nmol/L, Cal 5=30nmol/L, Cal 6=50nmol/L。
-凍干的低對(duì)照(L)。-凍干的高對(duì)照⑶。-30mL 稀釋劑(Dil)。-150 ii L含有針對(duì)CGA的264-279位肽的HRP標(biāo)記抗體的結(jié)合物。IOOx濃縮。-15mL結(jié)合緩沖液-15mL 底物 TMB.-15mL 終止溶液(0. 5M H2S04).-35mL洗滌溶液，20x濃縮嗜鉻粒蛋白A的ELISA方法程序所有溶液都在室溫下使用。在室溫(20-30° C)下執(zhí)行溫育。樣品稀釋和溫育所有樣品在轉(zhuǎn)移到檢驗(yàn)板之前都在単獨(dú)的稀釋板中稀釋5x。校準(zhǔn)品、低對(duì)照、高對(duì)照和患者血漿在使用之前全部用50 UL血漿+200 UL稀釋劑稀釋。然后，將其通過(guò)上下吸取進(jìn)行徹底混合，然后一式兩份轉(zhuǎn)移100 U L到檢驗(yàn)板。將檢驗(yàn)板溫育60分鐘。樣品溫育后將檢驗(yàn)板用300 U L洗滌液/孔洗滌三(3)次，毎次注滿和倒空所述孔。在最后ー次洗滌后，通過(guò)在吸水薄紙上輕敲所述板來(lái)排空孔。加入結(jié)合物每孔加入100 ii L結(jié)合物。將檢驗(yàn)板溫育30分鐘。結(jié)合物溫育之后如前洗滌檢驗(yàn)板。加入底物溶液每孔加入100 ii L底物TMB，并將檢驗(yàn)板在黑暗中溫育15分鐘。添加終止溶液每孔加入100 U L終止溶液。在2h以內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀出450nm下的OD(光密度)。讀出參考波長(zhǎng)620nm下的OD。實(shí)施例I單克降抗體
已經(jīng)基本上通過(guò)Kfihler和Milstein在1975年的方法制備了分別與人CGA氨基酸序列的第236到251位氨基酸序列表示的多肽特異性反應(yīng)的單克隆抗體(在此還表示為抗體2E8)，和與第264到279位氨基酸序列表示的多肽特異性反應(yīng)的單克隆抗體(在此還表示為抗體1H6)?？贵w2E8在Elisa中用作捕獲抗體；抗體1H6被用作與HRP結(jié)合的檢測(cè)抗體。實(shí)施例2CGA _聯(lián)免疫測(cè)定法的校準(zhǔn)曲線提供了ー組6個(gè)校準(zhǔn)品，其值分別為校準(zhǔn)品I :0nmol/L，校準(zhǔn)品2 :lnmol/L，校準(zhǔn)品 3 :5nmol/L,校準(zhǔn)品 4 :15nmol/L,校準(zhǔn)品 5 :30nmol/L,校準(zhǔn)品 6 :50nmol/L。 試劑盒中的校準(zhǔn)品是對(duì)應(yīng)于CGA的合成肽。設(shè)置肽校準(zhǔn)品以產(chǎn)生與純化的天然CGA 片段相等的響應(yīng)(Stridsberg, M 等 1993，Stridsberg 等 1995)將六個(gè)校準(zhǔn)品的OD對(duì)nmol/L值作圖，構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)品測(cè)量的結(jié)果在表I和圖I中描述。表I
權(quán)利要求
1.CGA多肽的測(cè)定方法，所述方法包括將準(zhǔn)備測(cè)定CGA多肽的存在或CGA多肽的量的樣品與ー組單克隆抗體反應(yīng)，其中至少ー種單克隆抗體與人CGA氨基酸序列的第236至251位氨基酸序列表示的CGA多肽(由SEQ ID NO 2表示)中的表位有反應(yīng)性；并且其中至少一種其他單克隆抗體與人CGA氨基酸序列的第264至279位氨基酸序列表示的CGA多肽(由SEQ ID NO 3表示)中的表位有反應(yīng)性。
2.針對(duì)CGA多肽的單克隆抗體，其選自⑴與人CGA氨基酸序列的第236至251位氨基酸表示的多肽(由SEQ ID NO 2表示)中的表位有反應(yīng)性的單克隆抗體；和⑵與人CGA氨基酸序列的第264至279位氨基酸表示的多肽(由SEQ ID NO 3表示)中的表位有反應(yīng)性的單克隆抗體。
3.包含權(quán)利要求2的抗體的免疫試劑，其中所述單克隆抗體與下列任一種結(jié)合 a)固體支持物，例如微量滴定板的壁，或者 b)可檢測(cè)標(biāo)記物，例如酶、放射性元素或化合物，或者 c)特異性連接劑，例如生物素或鏈霉親和素。
4.用于檢測(cè)CGA的檢驗(yàn)試劑盒，其至少包含 a)與人CGA氨基酸序列的第第236到251位氨基酸表示的多肽(由SEQID NO 2表示)中的表位有反應(yīng)性的單克隆抗體；和 b)與人CGA氨基酸序列的第264到279位氨基酸表示的多肽(由SEQIDNO 3表示)中的表位有反應(yīng)性的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及與人CGA氨基酸序列的第236到251位或第264到279位氨基酸序列表示的多肽中的表位有反應(yīng)性的單克隆抗體。本發(fā)明還涉及這些單克隆抗體在CGA的免疫測(cè)定中的應(yīng)用、包含這兩種抗體的任一種的免疫試劑、以及用于測(cè)定CGA的含有基于這兩種單克隆抗體的免疫試劑的檢驗(yàn)試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102869681SQ201180020713
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者麥茨·斯特里斯貝格, 英韋·索馬林 申請(qǐng)人:歐羅診斷股份公司