專利名稱：乳腺癌相關(guān)風(fēng)險基因位點檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體明涉及檢測乳腺癌相關(guān)風(fēng)險基因位點是否發(fā)生突變的試劑盒，通過同時檢測與乳腺癌密切相關(guān)的成纖維細胞生長因子受體2(FGFR2)基因和T0X3基因(T0X3)的單核苷酸多態(tài)性位點基因型來評估個體患乳腺癌的風(fēng)險。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一。在歐美發(fā)達國家，乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首；在我國，乳腺癌發(fā)病率也呈逐漸上升趨勢，并出現(xiàn)低齡化。FGFR2 (fibroblastgrowth factor receptor2)基因位于10q26,這一區(qū)帶在移動細胞癌中常常存在結(jié)構(gòu)異常且表達下降。大量研究表明FGFR2基因的突變也可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。腫瘤中該基因的表 達缺失很可能是突變失活的結(jié)果，其具體機制尚不明了。國外研究表明，F(xiàn)GFR2的單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌有相關(guān)性。FGFR2基因的rs2912778、rs3135718、rsll020014位點多態(tài)性均増加了乳腺癌的患病風(fēng)險。由于乳腺癌的發(fā)生可能與雌激素有關(guān)，且腫瘤大小、細胞學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、ER/PR表達情況均影響乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)危險度分組，Stacey和Garcia-Closas等研究結(jié)果也表明FGFR2與雌激素陽性、低分化以及多結(jié)節(jié)乳腺癌患者有強烈的相關(guān)性。FGFR2基因的突變可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。研究表明，F(xiàn)GFR2突變與胃癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤均有夫。Jang等發(fā)現(xiàn)在胃、結(jié)腸、直腸癌中也發(fā)現(xiàn)了與贗縫骨結(jié)合綜合癥相同的FGFR2/FGFR3突變，說明FGFR2/FGFR3的突變在胃、結(jié)腸、直腸癌中也起著十分重要的作用。Udler等人研究結(jié)果也表明FGFR2基因突變可增加女性患乳腺癌的風(fēng)險。乳腺癌的發(fā)生涉及細胞凋亡與増殖失衡、細胞的分化紊亂、癌基因與抑癌基因的功能失調(diào)，以及相關(guān)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)等多種生命活動的異常。Meyer等對FGFR2基因遺傳變異與乳腺癌易感性的研究表明，風(fēng)險等位基因在乳腺癌中的表達有所増加。Gold等們對德系猶太人種進行基因組的相關(guān)性研究，得出FGFR2的SNP位點(rsl078806)與乳腺癌存在相關(guān)性。Hunter等通過基因分型對歐洲絕經(jīng)后婦女濕潤型乳腺癌患者和對照組進行了研究后發(fā)現(xiàn)FGFR2第2內(nèi)含子的rs2981579、rs2420946與乳腺癌發(fā)生有較強的關(guān)聯(lián)性。Udler等人發(fā)現(xiàn)FGFR2第2內(nèi)含子的rs2981578與乳腺癌發(fā)生有較強的關(guān)聯(lián)性。Liangy等研究表明，F(xiàn)GFR2基因第二內(nèi)含子的變異可能是中國乳腺癌發(fā)生的重要病因。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科Peng等報告的一項綜述表明，31. 7%的基因突變與乳腺癌發(fā)病相關(guān)性是顯著相關(guān)的，其中又有21. 7%值得進一步關(guān)注；而對于GWASs，有80%的顯著相關(guān)性值得進ー步關(guān)注。隨著對乳腺癌發(fā)病相關(guān)基因、全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide associationstudies,GffASs)的深入，越來越多的證據(jù)顯示基因突變與乳腺癌發(fā)病率之間有密切的相關(guān)性。[0007]研究檢索了包括PubMecUMedline在內(nèi)的科學(xué)文獻，其中87篇Meta分析或匯總分析的文章中共指出145個與乳腺癌相關(guān)的基因突變。其中包括FGFR2 (rs2981579)和T0X3(rs4784227)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤防治研究所進ー步證實了 T0X3基因相關(guān)位點多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系。經(jīng)過病例組和對照組的研究分析之后，得出結(jié)論T0X3基因上rs4784227位點的基因多態(tài)性和rs9302556位點基因多態(tài)性增加乳腺危險性。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型針對目的是提供ー種采用熒光定量PCR技術(shù)同時檢測兩個乳腺癌相關(guān)風(fēng)險基因SNP位點的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測兩個SNP位點的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個試管、裝有陽性對照品的ー個試管、裝有陰性對照品的ー個試管組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品。 其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、SNP位點檢測用上游引物、SNP位點檢測用下游引物、SNP位點基因型ー熒光探針、SNP位點基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。其中，成纖維細胞生長因子受體2 (FGFR2)上的SNP位點檢測引物和探針為上游引物序列5’- GAGGAAATACATAACCT -3’下游引物序列5’- TTGCTTGTTTTGGATAC -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GATGTCTaCAGAGG - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- GATGTCTgCAGAGG - TAMRA -3’T0X3上的SNP位點檢測引物和探針為上游引物序列5’- AAAAGTCCCAATTTGTA -3’下游引物序列5’- TGGGAGTATTTACATCA -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - TGTTTGCcGATTATT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC - TGTTTGCtGATTATT -TAMRA -3’對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陰性對照品為無菌雙蒸水樣品，陽性對照品為ロ腔粘膜細胞DNA樣品。本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。本實用新型試劑盒使用方法毎次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。擴增檢測在熒光定量PCR儀上進行，分為6個反應(yīng)管，每ー個SNP位點檢測使用3個反應(yīng)管，其中I個反應(yīng)管為被檢測樣品，陽性對照和陰性對照各使用I個反應(yīng)管，每管中總體積10 iil，其中Siil PCR反應(yīng)液，2 檢測樣品(基因組DNA、陽性對照或陰性對照)。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進行60個循環(huán)的95 V、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進行終點熒光讀取，根據(jù)得到的ニ維熒光圖和實時擴增曲線讀取被檢測樣品的SNP位點基因型。本實用新型提供的該試劑盒主要用于檢測乳腺癌相關(guān)風(fēng)險基因SNP位點，從而告知被檢者患病風(fēng)險數(shù)值，提前預(yù)防和控制，指導(dǎo)醫(yī)師選擇正確的臨床治療方案，有利于患者進行針對性治療。本實用新型的特點是該試劑盒運用熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了同時檢測兩個乳腺癌相關(guān)風(fēng)險基因SNP位點基因型的目的，相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測ー個SNP位點，本實用新型試劑盒將同一疾病的所有SNP位點檢測整合在ー個試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對個體患乳腺癌風(fēng)險性的評估也更便捷。

圖I為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
本實用新型結(jié)合附圖和具體實施例作進ー步說明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于 說明目的，而不用于限制本實用新型范圍。實施例I參見圖1，本實用新型試劑盒由包裝盒體I、襯墊2、裝有檢測兩個SNP位點的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔、分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對照品4和陰性對照品5。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、SNP位點檢測用上游引物、SNP位點檢測用下游引物、SNP位點基因型ー熒光探針、SNP位點基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。本試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。實施例2I.材料血樣總DNA提取試劑盒購于美國Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關(guān)試劑購于美國Promega公司，7900型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。2.引物及探針成纖維細胞生長因子受體2 (FGFR2)上的SNP位點檢測引物和探針為上游引物序列5’- GAGGAAATACATAACCT -3’下游引物序列5’- TTGCTTGTTTTGGATAC -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GATGTCTaCAGAGG - TAMRA _3’基因型ニ熒光探針序列5，-VIC-GATGTCTgCAGAGG - TAMRA -3’T0X3上的SNP位點檢測引物和探針為上游引物序列5’- AAAAGTCCCAATTTGTA -3’下游引物序列5’- TGGGAGTATTTACATCA -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - TGTTTGCcGATTATT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC - TGTTTGCtGATTATT -TAMRA -3’3.樣本檢測選取30例血液樣本，其中已確定患乳腺癌的為18例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。每一例檢測為12個反應(yīng)管，每管中總體積lOiil，其中8iU PCR反應(yīng)液，姆ー個SNP位點檢測使用3個反應(yīng)管，I個反應(yīng)管中加入2 u I被檢測DNA,另外2個反應(yīng)管中加入2 u I陽性對照和陰性對照，在ABI7900熒光定量PCR儀上進行擴增。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進行60個循環(huán)的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進 行終點熒光讀取。
權(quán)利要求1. ー種乳腺癌相關(guān)風(fēng)險基因位點檢測試劑盒，其特征是由包裝盒體(I )、襯墊(2 )、裝有檢測兩個SNP位點的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個試管(3)、裝有陽性對照品的一個試管(4)、裝有陰性對照品的一個試管(5)組成，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液(3 )、陽性對照品(4 )和陰性 對照品(5 )。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測乳腺癌相關(guān)風(fēng)險基因位點是否發(fā)生突變從而評估個體患乳腺癌風(fēng)險性的試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測兩個SNP位點的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對照品4和陰性對照品5。本實用新型試劑盒運用熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了同時檢測兩個乳腺癌相關(guān)風(fēng)險基因SNP位點基因型的目的，相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個SNP位點，本實用新型試劑盒將與同一疾病的兩個SNP位點檢測整合在一個試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對個體患乳腺癌風(fēng)險性的評估也更便捷。
文檔編號G01N21/64GK202401072SQ20112056948
公開日2012年8月29日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者任峻, 張華忠 申請人:浙江愛易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司