專利名稱：老年性癡呆相關(guān)基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)老年性癡呆相關(guān)基因位點(diǎn)是否發(fā)生突變的試劑盒，通過同時(shí)檢測(cè)與老年性癡呆密切相關(guān)的載脂蛋白E (APOE)和脊髄灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)2 (PVRL2)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評(píng)估個(gè)體患老年性癡呆癥的風(fēng)險(xiǎn)。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病所謂的老年癡呆癥。是ー種進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。患病率研究顯示，美國(guó)在2000年的阿爾茨海默病例數(shù)為450萬例。年齡每增加5歲，阿爾茨海默病人的百分?jǐn)?shù)將上升2倍，也就是說，60歲人群的患病率為1%，而85歲 人群的患病率為30%。載脂蛋白E (Apolipoprotein E,AP0E)是血衆(zhòng)脂蛋白的ー個(gè)重要組成部分。APOE基因位于19號(hào)染色體。目前以有研究者們以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對(duì)APOE進(jìn)行分型，以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析結(jié)果。由此從分子水平闡明APOE基因多態(tài)性與老年性癡呆(Alzheimer’ s disease, AD)的關(guān)系，尤其是e 4的多態(tài)性，對(duì)研究AD的發(fā)病機(jī)理、預(yù)防、診斷及早期防治有重大意義。人類APOE存在基因多態(tài)性，其遺傳多態(tài)性主要受位于同一基因位點(diǎn)上的3個(gè)等位基因(e 2、e 3、e 4)所控制，分別編碼血漿中3種異構(gòu)體，即AP0E2、AP0E3、AP0E4,構(gòu)成6種不同的基因型，3種純合子(e 2/ e 2，e 3/ e 3, e 4/ e 4)，3鐘雜合子(e 2/ e 3，e 2/ e 4,e 3/ e 4)。APOE基因PCR-RFLP原理為用特異性引物擴(kuò)增，包括2位點(diǎn)DNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)ー步用Hhal I酶切，產(chǎn)生不同的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性￡2、￡3、￡4，由此產(chǎn)生6種不同的電泳圖譜。AP0E3是人群中最常見的形式。有學(xué)者報(bào)道APOE- e 4增加AD的危險(xiǎn)性，APOE- e 2減少AD的危險(xiǎn)性。APOE基因與晚發(fā)家族性AD，晚發(fā)散發(fā)型AD與早發(fā)散發(fā)性AD均有關(guān)聯(lián)。晚發(fā)性AD與APOE e 4等位基因的聯(lián)系已被證實(shí)。AD患者攜帶e 4等位基因者占46. 2%，而對(duì)照只占13. 2%。根據(jù)研究者的研究結(jié)果表明，AD患者的年齡分布和對(duì)照組之間無差別(u=0. 97，P>0.05)。等位基因在AD組與正常對(duì)照組之間有非常顯著的差異(P < 0.01)。其中e2、e 3等位基因在AD組與對(duì)照組之間的比較無明顯差異(u=l. 79，P > 0. 05)，e 4等位基因在對(duì)照組和研究者們的結(jié)果與國(guó)外報(bào)道一致。并且在AD組中，攜帯e 4基因型與對(duì)照組之間也有明顯差異(P< 0.01)，而攜帶￡3等位基因，無明顯差異。e4等位基因與對(duì)照組比較差異明顯(P < 0. 05)。1994年有報(bào)道百歲老人普遍攜帯AP0E2等位基因。因此e 2等位基因似乎不僅可 以保護(hù)人們免患AD，而且還與長(zhǎng)壽有夫。這ー關(guān)系可能是由于e 2等位基因通過減少LDL—膽固醇濃度而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用。[0008]AD組與正常對(duì)照組中APOE基因型差異顯著。AD患者e 3的頻率與對(duì)照組相似。對(duì)照組e 2的頻率較高，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而患者e 4的頻率明顯高于對(duì)照，說明^4對(duì)AD的發(fā)展及結(jié)果確實(shí)有一定的影響。這可能是AD患者特殊的腦損傷由APOE多態(tài)性所致。許多人傾向認(rèn)為ム0是首要的并且首先發(fā)生淀粉樣蛋白沉積。特別AP0E4比AP0E3結(jié)合
的速度快，pH范圍狹窄。A0PE4還可以同AP結(jié)合形成新的單纖維，沉寂后形成高密度的結(jié)構(gòu)。最近有學(xué)者認(rèn)為，淀粉蛋白形成是AD的第一歩，P淀 粉蛋白斑的形成可能先于通常見到的導(dǎo)致AD腦細(xì)胞凋亡的“神經(jīng)元纖維纏結(jié)”的產(chǎn)生。另ー種與AD損傷有關(guān)的重復(fù)蛋白是微管蛋白Tau。APOE-Tau相互作用可能是防止Tau磷酸化的保護(hù)機(jī)制。對(duì)于攜帶ー個(gè)或兩個(gè)e 4等位基因的患者，游離的Tau可能被磷酸化，從而影響了神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)。綜上所述，APOE特別是AP0E4在多種神經(jīng)退化過程的發(fā)展中起作用。研究者們研究AD患者的遺傳與APOE基因多態(tài)性的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡明e 4與AD的發(fā)病有著一定的相關(guān)作用，而AP0E3或AP0E2與病理改變無明確的牽連。脊髓灰質(zhì)炎病韋受:體相關(guān)2 (polivovirus receptor related 2, PVRL2)屬于免疫球蛋白超家族中的Nectin家族,基因全長(zhǎng)約43kb,亦定位于19ql3,有9個(gè)外顯子和兩種亞型，在氨基酸水平上與PVR有55%的同源性。PVRL2編碼I型穿膜糖蛋白，結(jié)構(gòu)中也有兩個(gè)免疫球蛋白樣C2型區(qū)域和ー個(gè)免疫球蛋白樣V型區(qū)域。其分子定位于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間連接處，它的兩種亞型互相作用，通過S亞型向細(xì)胞內(nèi)傳遞信息，發(fā)揮粘附作用。葛曉東等研究認(rèn)為PVRL2是單純皰疹病毒(HSV)和假狂犬病病毒的受體，介導(dǎo)這些病毒株入侵細(xì)胞，而且與這些病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散有關(guān)，大多數(shù)研究亦認(rèn)為PVRL2的基因遺傳多態(tài)性現(xiàn)象對(duì)多發(fā)性硬化癥的嚴(yán)重程度有所影響，認(rèn)為病毒與多發(fā)性硬化癥的臨床病程相關(guān)。Takahashi等的研究更進(jìn)一步證實(shí)PVRL2是一種Ca2+非依賴性的粘附分子(cellular adhesionmolecule, CAM),在細(xì)胞粘附、遷移和極化中起重要作用。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型針對(duì)目的是提供ー種采用熒光定量PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)老年性癡呆相關(guān)基因SNP位點(diǎn)的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管、裝有陽(yáng)性對(duì)照品的ー個(gè)試管、裝有陰性對(duì)照品的ー個(gè)試管組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgC12、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型ー熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。其中，載脂蛋白E (APOE)上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5’- GAGATGAGAGTTGGT -3’下游引物序列5’- GAAGAGAAACGCTGT -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GGGTTGGaGTGGAG - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5，-VIC-GGGTTGGgGTGGAG - TAMRA -3’脊髄灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)2 (PVRL2)上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5’- CTTGGGACTTGGAGG -3’[0021]下游引物序列5，-TAGAGACGGGAGAAG -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GGTGGAACaGCACACT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC - GGTGGAACgGCACACT -TAMRA -3’對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陰性對(duì)照品為無菌雙蒸水樣品，陽(yáng)性對(duì)照品為ロ腔粘膜細(xì)胞DNA樣品。本試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。本實(shí)用新型試劑盒使用方法毎次檢測(cè)均應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。擴(kuò)增檢測(cè)在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，分為6個(gè)反應(yīng)管，每ー個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)使用3個(gè)反應(yīng)管，其中I個(gè)反應(yīng)管為被檢測(cè)樣品，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各使用I個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積10 iil，其中Siil PCR反應(yīng)液，2 檢測(cè)樣品(基因組DNA、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照)。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95 V、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取，根據(jù)得到的ニ維熒光圖和實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線讀取被檢測(cè)樣品的SNP位點(diǎn)基因型。本實(shí)用新型提供的該試劑盒主要用于檢測(cè)老年性癡呆相關(guān)基因SNP位點(diǎn)，從而告知被檢者患病風(fēng)險(xiǎn)數(shù)值，提前預(yù)防和控制，指導(dǎo)醫(yī)師選擇正確的臨床治療方案，有利于患者進(jìn)行針對(duì)性治療。本實(shí)用新型的特點(diǎn)是該試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)老年性癡呆相關(guān)基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對(duì)于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測(cè)ー個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將同一疾病的所有SNP位點(diǎn)檢測(cè)整合在ー個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對(duì)個(gè)體患老年性癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)性的評(píng)估也更便捷。

圖I為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)ー步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本實(shí)用新型范圍。實(shí)施例I參見圖1，本實(shí)用新型試劑盒由包裝盒體I、襯墊2、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽(yáng)性對(duì)照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔、分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽(yáng)性對(duì)照品4和陰性對(duì)照品5。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgC12、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測(cè)用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型ー熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。實(shí)施例2I.材料[0039]血樣總DNA提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關(guān)試劑購(gòu)于美國(guó)Promega公司，7900型熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。2.引物及探針 基于載脂蛋白E (APOE)上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5’- GAGATGAGAGTTGGT -3’下游引物序列5’- GAAGAGAAACGCTGT -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GGGTTGGaGTGGAG - TAMRA _3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- GGGTTGGgGTGGAG - TAMRA -3’ 脊髄灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)2 (PVRL2)上的SNP位點(diǎn)檢測(cè)引物和探針為上游引物序列5’- CTTGGGACTTGGAGG -3’下游引物序列5，-TAGAGACGGGAGAAG -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GGTGGAACaGCACACT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC - GGTGGAACgGCACACT -TAMRA -3’3.樣本檢測(cè)選取30例血液樣本，其中已確定患老年性癡呆癥的為18例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。每一例檢測(cè)為12個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積lOiil，其中8iU PCR反應(yīng)液，姆ー個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)使用3個(gè)反應(yīng)管，I個(gè)反應(yīng)管中加入2 u I被檢測(cè)DNA,另外2個(gè)反應(yīng)管中加入2 u I陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，在ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95で、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取。
權(quán)利要求1. ー種老年性癡呆相關(guān)基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，其特征是由包裝盒體(I)、襯墊(2)、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管(3)、裝有陽(yáng)性對(duì)照品的一個(gè)試管(4)、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管(5)組成，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液(3 )、陽(yáng)性對(duì)照品(4 )和陰性對(duì)照品(5 )。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種檢測(cè)老年性癡呆相關(guān)基因位點(diǎn)是否發(fā)生突變從而評(píng)估個(gè)體患老年性癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)性的試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽(yáng)性對(duì)照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對(duì)照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽(yáng)性對(duì)照品4和陰性對(duì)照品5。本實(shí)用新型試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)老年性癡呆癥相關(guān)基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對(duì)于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測(cè)一個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將與同一疾病的兩個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè)整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對(duì)個(gè)體患老年性癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)性的評(píng)估也更便捷。
文檔編號(hào)G01N21/64GK202401070SQ20112056947
公開日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者任峻, 張華忠 申請(qǐng)人:浙江愛易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司