專利名稱：人可溶性mica蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測可溶性MICA (sMICA)分子的試劑盒。
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)是將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用原理有機(jī)的結(jié)合起來的一種敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法，可敏感的檢測體液中的微量的特異性蛋白。MICA (MHC class I related chain A)基因，是人類主要組織兼容復(fù)合體I類(MHC I)相關(guān)的基因之一。MICA分子是表達(dá)在細(xì)胞膜表面的糖蛋白。與MHC-I類分子不 同，MICA的表達(dá)僅局限于人體纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞。在應(yīng)急和感染的情況下，MICA分子的表達(dá)增高。在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和器官移植的狀況下，MICA的表達(dá)也有增高的現(xiàn)象。NKG2D作為重要的激活性受體，可與MICA分子結(jié)合。從而激活NK細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞的殺傷效果。NKG2D-MICA是機(jī)體先天免疫激活的重要活化通路。除了膜結(jié)合的MICA蛋白的分子形式外，MICA膜分子可能被酶切作用釋放進(jìn)入外周血循環(huán)，形成游離的可溶性MICA (Solube MICA, sMICA)分子，在腫瘤患者血液中尤為明顯。近年來有研究檢測血清中sMICA濃度在肝病患者明顯增高，包括慢性肝病患者和肝細(xì)胞肝癌患者。而且他們還發(fā)現(xiàn)血清高濃度的sMICA能夠在體外實(shí)驗(yàn)中下調(diào)NK細(xì)胞的NKG2D受體表達(dá)量。大量研究表明sMICA濃度的變化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，具有一定的診斷價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測sMICA蛋白的ELlSA試劑盒，其操作簡便，成本低，穩(wěn)定性好，適合于血液及其它生物液體中sMICA蛋白的檢測。為了解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型所采用的技術(shù)方案是一種人可溶性MICA蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體I和包被層3，固相載體I上設(shè)置有多個(gè)微孔2，包被層3附著在固相載體I的微孔2表面，包被層3是由抗人可溶性MICA蛋白單克隆抗體和牛血清白蛋白依次涂布在微孔2上形成的復(fù)合層。本實(shí)用新型采用ELlSA方法的試劑盒可以定量檢測血液或其它來源生物液體中可溶性MICA蛋白含量，顯著提高了可溶性MICA蛋白檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度；并且靈敏度高，特異性強(qiáng)，幾乎不受液體中其它物質(zhì)，如酶抑制劑、激活劑等的影響，不受藥物的干擾，且操作簡單，省時(shí)省力，特別適用于可溶性MICA蛋白的檢測。

圖I本實(shí)用型新一具體實(shí)施例酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)示意圖。圖2本ELlSA試劑盒對標(biāo)準(zhǔn)sMICA*008不同稀釋濃度的檢測。圖3正常人群血清sMICA濃度分布。
具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本實(shí)用新型作進(jìn)一步說明，以使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本實(shí)用新型并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對本實(shí)用新型的限定。如圖I所示，本實(shí)用新型試劑盒的酶標(biāo)板，其包括固相載體I和包被層3，固相載體I采用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)。固相載體I上有多個(gè)微孔2，包被層3附著在固相載體I上的微孔2上。包被層3是包括小鼠抗人可溶性MICA蛋白單克隆抗體和牛血清白蛋白的復(fù)合層。該具體實(shí)施例的試劑盒制備方法是可采用96孔、48孔、60孔或12孔板。或8 12孔的聯(lián)排管，例如采用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時(shí)，是PS板活化。在試劑板微孔2上先包被一定濃度的捕獲抗體，該捕獲抗體是小鼠抗人可溶性MICA蛋白單克隆抗體，為IgGl亞型。4°C過夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標(biāo)板，以備標(biāo)本檢測。 使用時(shí)將待測樣本血清用含2%牛血清白蛋白的PBS緩沖液按1:3稀釋加樣。加樣后的酶標(biāo)板在37°C孵育2小時(shí)。用PBS緩沖液洗滌6次后，向每孔加入sMICA特異性的檢測抗體。該檢測抗體也是小鼠抗人可溶性MICA蛋白單克隆抗體，該檢測抗體是IgG2 Q亞型，與捕獲抗體的區(qū)別在于其結(jié)合抗原表位不同。濃度為I. 0 ug/ml，每孔加入lOOul。37°C孵育2小時(shí)。用PBS緩沖液洗滌5次后，向每孔加入標(biāo)記有HRP的羊抗鼠IgG2 Q亞型的多克隆抗體。用含I %牛血清白蛋白的PBS緩沖液稀釋到濃度為1:5000，每孔100ul，37°C孵育I小時(shí)，PBS緩沖液洗滌5次。加底物3，3’ -5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為顯示底物。加硫酸中止顯色反應(yīng)。于酶標(biāo)儀450nm的波長測定吸光度值。每一酶標(biāo)板設(shè)有標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的檢測。本實(shí)施例采用的是雙位點(diǎn)一步法，也可以采用雙抗夾心法，在這種情況下采用采用生物素化的兔抗人可溶性MICA蛋白多克隆抗體，親和素辣根過氧化物酶作為檢測試劑A和B，以及3，3’ -5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和硫酸作為底物和終止液。采用標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品以及88名正常對照者作為研究對象進(jìn)一步分析。標(biāo)準(zhǔn)sMICA重組蛋白質(zhì)為MICA*008型別蛋白，其僅含有細(xì)胞外MICA結(jié)構(gòu)分子。從檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線綜合統(tǒng)計(jì)分析，如圖2所示表明血清中sMICA的濃度在100-2000 pg/ml范圍內(nèi)與定量夾心ELlSA法檢測出來的吸光度值(OD)呈現(xiàn)很好的直線關(guān)系(r=0. 9922)。其標(biāo)準(zhǔn)曲線以每個(gè)稀釋點(diǎn)(pg/ml)重復(fù)三次的OD樣本均值(Mean)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)繪制而成。我們對當(dāng)?shù)刂驹斧I(xiàn)血者中隨機(jī)抽取88例健康者進(jìn)行血清sMICA濃度的定量測定。如圖3所示健康正常人群血清中的sMICA濃度分布為近似的對數(shù)正態(tài)分布。健康人群中血液sMICA濃度的對數(shù)值頻率分布(n=88，Mean=L 373，SD=O. 016)。
權(quán)利要求1.一種人可溶性MICA蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體(I)和包被層(3)，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個(gè)微孔(2)，所述包被層附著在所述固相載體(I)的微孔(2)表面。
2.如權(quán)利要求I所述的一種人可溶性MICA蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征在于所述固相載體(I)為96孔試劑板。
3.如權(quán)利要求I所述的一種人可溶性MICA蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征在于所述固相載體(I)為60孔試劑板。
4.如權(quán)利要求I所述的一種人可溶性MICA蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征在于所述固相載體(I)為48孔試劑板。
5.如權(quán)利要求I所述的一種人可溶性MICA蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征在于所述固相載體(I)為8 12孔聯(lián)排管。
專利摘要一種人可溶性MICA蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體(1)和包被層(3)，固相載體(1)上設(shè)置有多個(gè)微孔(2)，包被層3附著在固相載體(1)的微孔(2)表面，包被層(3)是小鼠抗人可溶性MICA蛋白單克隆抗體和牛血清蛋白依次涂布在微孔(2)上形成的復(fù)合層。本實(shí)用新型采用ELISA方法的試劑盒可以定量檢測血液或其它來源生物液體中可溶性MICA蛋白含量，顯著提高了可溶性MICA蛋白檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度；并且靈敏度高，特異性強(qiáng)，幾乎不受液體中其它物質(zhì)，如酶抑制劑、激活劑等的影響，不受藥物的干擾，且操作簡單，省時(shí)省力，特別適用于可溶性MICA蛋白的檢測。
文檔編號G01N33/577GK202471716SQ20112051203
公開日2012年10月3日 申請日期2011年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月10日
發(fā)明者余平, 劉立民, 林琳, 羅奇志, 龔拯 申請人:龔拯