專利名稱：甘薯上馬鈴薯y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及甘薯上的馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
甘薯羽狀斑駁病毒potato feathery mottle 口>狀，SPFMV)、甘薯潛隱病: {Sweet potato latent virus, SPLV)^1^ G ^ {Sweet potato virus SPVG)禾口甘薯脈花葉病毒(Sfveet potato vein mosaic virus, SPVMV)是危害甘薯的主要病毒，4種病毒都屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)A種病毒或與其他病毒常?；旌锨秩靖适?，造成甘薯產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣和種性退化，對甘薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。對甘薯病毒病目前尚無特別有效的化學(xué)防治方法，利用莖尖分生組織培養(yǎng)，培育脫毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。在脫毒甘薯的培養(yǎng)和脫毒種薯(苗)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化過程中，病毒的快速檢測技術(shù)是保證脫毒種薯質(zhì)量以及實現(xiàn)脫毒種薯產(chǎn)業(yè)化非常關(guān)鍵的技術(shù)。只有利用快速、高效的病毒檢測技術(shù)，篩選出真正無毒的試管苗并及時淘汰不同級別的感病種苗，才能使真正的脫毒種薯用于生產(chǎn)，確保脫毒種薯的增產(chǎn)效果，進(jìn)而加快脫毒種薯的推廣進(jìn)程。因此，建立甘薯病毒高效的檢測技術(shù)是培育脫毒甘薯的前提和基礎(chǔ)。目前用于甘薯病毒檢測的常用方法是酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術(shù)，以及在此基礎(chǔ)上建立的硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定(NCM-ELISA)技術(shù)。由于侵染甘薯的PoiJ^ir皿^病毒種類較多，當(dāng)不需要確定病毒種類，只需要確定樣品中是否含有病毒時(譬如對甘薯脫毒莖尖苗進(jìn)行檢測)，利用上述方法進(jìn)行檢測時需要對各種病毒逐一進(jìn)行檢測，往往費時費力，造成浪費。

實用新型內(nèi)容本實用新型要解決的技術(shù)問題克服背景技術(shù)中的問題，提供一種簡便、高效和低成本的檢測甘薯上四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的試劑盒。本實用新型的技術(shù)方案甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測試劑盒，所述試劑盒分為上、下兩層，上、下兩層之間設(shè)置有隔板，上層還設(shè)有試劑瓶插孔，插孔中放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放置有硝酸纖維素膜；不同試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑藍(lán)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和1Tris-HCl溶液。所述試劑瓶為九個，其中一號試劑瓶裝有甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號試劑瓶裝有甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號試劑瓶裝有甘薯G病毒SPVG抗體，四號試劑瓶裝有甘薯脈花葉病毒SPVMV抗體，五號試劑瓶裝有上述四種病毒的混合抗體；六號試劑瓶裝有工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，七號試劑瓶裝有濃度為50mg/ml的氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT，八號試劑瓶裝有濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號試劑瓶9裝有pH為7. 5的2M Tris-HCl溶液。[0007]所述四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體均是利用大腸桿菌中表達(dá)的病毒外殼蛋白，通過純化蛋白、免疫家兔的方法制備獲得，所述四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體和混合抗體的效價均為4096倍，工作濃度為1 :1000倍。本實用新型的積極有益效果(1)本實用新型提供了一種檢測甘薯上/^ij^irMM病毒的簡便、高效和低成本的試劑盒。檢測樣品時，當(dāng)只需要確定樣品中是否含有/^ij^ir皿^病毒時使用試劑盒中裝有混合抗體的試劑瓶進(jìn)行檢測；當(dāng)需要確定含有某種特定病毒時，再使用其他試劑瓶中的特異性抗體，檢測方便，節(jié)省了檢測成本。(2)本實用新型檢測簡單、直觀，只需要將NC膜晾干后觀察顏色反應(yīng)，比較檢測樣品與正負(fù)對照的顏色反應(yīng)，出現(xiàn)紫色顏色反應(yīng)的樣品為陽性，從而判斷出是否含有Potyviruses病毒，方便實用。(3)本試劑盒可應(yīng)用于脫毒甘薯莖尖苗和各級種薯的檢測，通過對/^ij^irMM病毒的快速高效檢測，可以確保脫毒甘薯的質(zhì)量和增產(chǎn)效果；也可對甘薯病毒的種類進(jìn)行特異性檢測，可應(yīng)用于甘薯種薯調(diào)運以及病害調(diào)查等過程中。(4)本試劑盒特別適用于甘薯脫毒莖尖苗的檢測，也可直接推廣到基層農(nóng)技單位開展病害普查和預(yù)測預(yù)報，或用于脫毒甘薯種薯的質(zhì)量監(jiān)測，使真正的脫毒甘薯應(yīng)用于生產(chǎn)。

圖1 本實用新型的試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 本實用新型的試劑盒對甘薯樣品的檢測結(jié)果顯示圖。
具體實施方式
實施例1、甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測試劑盒，參見圖1，圖中1為試劑盒上層，2為試劑瓶，3為試劑盒下層。試劑盒中含有四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體和一種混合抗體，所述的試劑盒分為上、下兩層，上、下兩層之間設(shè)置有隔板，上層還設(shè)有試劑瓶插孔，插孔中放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放置有硝酸纖維素膜；上層的試劑瓶為九個，分別為一號至九號試劑瓶，其中一號試劑瓶中的甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號試劑瓶為甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號試劑瓶為甘薯G病毒SPVG抗體，四號試劑瓶為甘薯脈花葉病毒SPVMV抗體，五號試劑瓶為上述四種病毒的混合抗體；六號試劑瓶為工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，七號試劑瓶為濃度為50mg/ml的氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT，八號試劑瓶為濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號試劑瓶9 為 pH 為 7. 5 的 2M Tris-HCl 溶液。SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV 4種病毒的抗體均是利用在大腸桿菌中表達(dá)的病毒外殼蛋白，通過純化蛋白，免疫家兔的方法制備獲得，4種病毒的抗體以及混合抗體的效價均為4096倍，工作濃度為1 :1000倍。用試劑盒檢測樣品時，當(dāng)只需要確定樣品中是否含有馬鈴薯Y病毒屬病毒時，使用混合抗體的五號試劑瓶進(jìn)行檢測；當(dāng)需要確定含有馬鈴薯Y病毒屬病毒的某種病毒時，則使用一號至四號試劑瓶進(jìn)行檢測。實施例2、甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟1、緩沖液的配制(1) TBS 0. 02M Tris+0. 50M NaCl, pH7. 5 ；(2)抽提緩沖液TBS+0. 2%亞硫酸鈉；(3)封閉液:TBS+2% 脫脂奶粉 +2% triton X-100 ；(4)抗體緩沖液TBS+^)脫脂奶粉；(5) T-TBS :TBS+0. 05% Tween 20 ；(6)底物緩沖液0. IM Tris+ 0. IM NaCl+5mM MgCl2'6H20, pH=9. 5 ；其中M是指單位mol/L。2、檢測步驟(1)準(zhǔn)備硝酸纖維素膜(NC膜):剪取合適大小的NC膜，用鉛筆在膜上做好標(biāo)記，以便于點樣。(2)樣品處理將0. Ig甘薯樣品于液氮中速凍并研磨呈粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提緩沖液(TBS+ 0. 2%亞硫酸鈉)繼續(xù)研磨至徹底裂解，并轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，5000rpm離心5min。(3)點樣將NC素膜于TBS中浸泡1 min，用濾紙吸去膜表面液體，取上清液5μ1點于膜上，室溫晾干。(4)封閉加入IOml封閉液(TBS+覬脫脂奶粉+2%triton X-100)于培養(yǎng)皿中，將NC膜浸入其中，室溫孵育60 min。(5)洗膜棄去封閉液，用TBS洗NC膜一次。(6)加一抗(SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV 抗體或混合抗體)將NC膜置于用抗體緩沖液(TBS+洲脫脂奶粉)稀釋至工作濃度的抗體(SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV抗體或混合抗體)中，室溫下振蕩(50rpm/min)孵育過夜，所有抗體的工作濃度均為1 :1000倍。(7)洗膜棄一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次。(8)加二抗(堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)用濾紙吸去膜上多余的溶液，然后將NC膜置于用抗體緩沖液(TBS+洲脫脂奶粉)稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體(堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)中，室溫下振蕩(50rpm/min)孵育1 h ；二抗的工作濃度為1 :1000倍。(9)洗膜棄二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次。(10)顯色將NC膜置于NBT/BCIP底物溶液中，每5ml底物緩沖液先加入33μ NBT,再加入16. 5μ1 BCIP室溫下?lián)u床振蕩(50 rpm/min)避光顯色5_30 min (必要時增加顯色時間)。(11)終止反應(yīng)將NC膜從底物溶液中取出，用蒸餾水洗NC膜3次，3-4min/次。(12)陽性判斷晾干后觀察顏色反應(yīng)，比較檢測樣品與正負(fù)對照的顏色反應(yīng)，出現(xiàn)紫色顏色反應(yīng)的樣品為陽性。實施例3、甘薯上/^ij^irMM病毒血清學(xué)檢測試劑盒的應(yīng)用[0044]利用本試劑盒，對采自田間的M份田間甘薯樣品進(jìn)行檢測。檢測步驟按實施例2的步驟。一抗采用混合抗體抗血清(五號試劑瓶)。工作濃度為1 :1000倍。結(jié)果表明，對份甘薯樣品中有10份甘薯樣品呈陽性反應(yīng)(見圖2)，陽性率為41. 7%，說明這些甘薯樣品上普M^f ^ Po tyviruses 病毒。圖2中，上排1、2、3、4、5、6、7、8，以及下排1、2為陽性樣品。
權(quán)利要求1.甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒分為上、 下兩層，上、下兩層之間設(shè)置有隔板，上層還設(shè)有試劑瓶插孔，插孔中設(shè)有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中設(shè)有硝酸纖維素膜。
2.如權(quán)利要求1所述的血清學(xué)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑藍(lán)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和Tris-HCl溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的血清學(xué)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑瓶為九個，其中一號試劑瓶裝有甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號試劑瓶裝有甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號試劑瓶裝有甘薯G病毒SPVG抗體，四號試劑瓶裝有甘薯脈花葉病毒SPVMV抗體，五號試劑瓶裝有上述四種病毒的混合抗體；六號試劑瓶裝有工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，七號試劑瓶裝有濃度為50mg/ml的氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT，八號試劑瓶裝有濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號試劑瓶裝有pH為7. 5的 2M Tris-HCl 溶液。
專利摘要本實用新型涉及甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學(xué)檢測試劑盒。試劑盒分為上、下兩層，上層放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放有硝酸纖維素膜；不同試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、NBT、BCIP和Tris-HCl溶液。檢測樣品時，當(dāng)需要確定樣品中是否含有馬鈴薯Y病毒屬病毒時，使用混合抗體試劑瓶檢測；當(dāng)需要確定某種特定病毒時，使用其他特異性抗體檢測，檢測方便，節(jié)省成本，檢測方法簡單、直觀，方便實用。本實用新型可應(yīng)用于脫毒甘薯莖尖苗和各級種薯的檢測，通過對Potyviruses病毒的快速高效檢測，可以確保脫毒甘薯的質(zhì)量和增產(chǎn)效果。
文檔編號G01N33/569GK202330434SQ201120460398
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者喬奇, 張德勝, 張振臣, 王永江, 王爽, 田雨婷, 秦艷紅 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院