專利名稱：梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒特異性IgM抗體檢測免疫印跡試齊U盒。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum, TP)引起的性傳播性疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創(chuàng)口或者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進入血液，播散全身，使機體幾乎所有的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂觀地預(yù)言“由于有高敏度檢測方法和高效的治療方案，梅毒是一種能夠通過公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，至今梅毒依然是世界范圍的公共衛(wèi)生問題，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大約有1200萬的患者，其中60萬孕婦患者([1]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學(xué)檢測方法的選擇.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志.2010,20(10) :1491-1494)。事實上，梅毒的感染現(xiàn)狀可能要比想象中的更讓人悲觀。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋體尚不能進行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試驗，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測兩大類型。梅毒特異性抗體IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗體分別于2周和4周后產(chǎn)生，即使患者經(jīng)過足夠治療，其仍能長期存在，甚至終身不消失([2]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)TRUST/TPPA與IgM抗體聯(lián)合檢測.中國皮膚性病學(xué)雜志.2010，152 (0 =446-448)；而另一種抗體物質(zhì)反應(yīng)素產(chǎn)生較晚，一般在受感染后5 7周產(chǎn)生，而且晚期梅毒、梅毒治療后期以及潛伏梅毒可能陰性，因此梅毒特異性抗體的陽性率、敏感性顯著高于反應(yīng)素。TP-IgM是梅毒感染后，機體最先出現(xiàn)的特異性抗體。只要有活的梅毒螺旋體存在，其TP-IgM將會維持在一定的水平。MartinaH 等([3]MartinaH, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19Sfluorescent treponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J]Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61-66.)認為TP-IgM是梅毒早期感染并活動的一項血清學(xué)標志，李步榮等([4]李步榮，賀軍濤，張毅，等.梅毒螺旋體IgM抗體檢測的臨床意義[J] 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，觀(16) :1495-1497)認為TP-IgM與TP-DNA—樣，代表著梅毒傳染性指標。在排除近期抗梅毒治療的前提下，TP-IgM若不轉(zhuǎn)陰，提示體內(nèi)可能殘存梅毒螺旋體或治療不徹底。TP-IgM陰轉(zhuǎn)者隨訪時再轉(zhuǎn)陽性，表明再次感染梅毒([5]RaWstr0n SA, Mehta S，Bromberg K,et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis[J]. Sex Transm Dis，2004，31 (2) 123-126)。盡管TP-IgM陰性不能完全排除傳染性，但TP-IgM陽性必定提示該患者具有傳染
3性。TP-IgG的出現(xiàn)要遲于IgM，能長期存在，甚至終身不消失，因此，TP-IgG是梅毒診斷和流行病學(xué)調(diào)查的一項重要指標([6]Li-Rong Lin, Zuo-Gen Fu,Bing Dan，et al. Development of a colloidalgold-immunochromatography assay to detect Immunoglobulin G Antibodies to Treponemapallidum with TPN17and TPN47. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2010，68 :193-200.)。早期的血清學(xué)方法使用完整梅毒螺旋體作為抗原，研究和診斷用的TP是以TP感染兔睪丸獲得，這種方法存在花費大、獲得的TP量少且不純(混有宿主蛋白)、與其他病原體存在交叉反應(yīng)等缺點，因此假陽性也時有發(fā)生。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及及梅毒螺旋體抗原的相繼克隆，將重組抗原應(yīng)用于梅毒實驗已經(jīng)越來越多。目前研究比較多的TP抗原有 TPNl7、TPN47、TPNl5、TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重組 DNA 技術(shù)制備的重組抗原可以克服完整TP抗原的缺點，能快速、經(jīng)濟地制備無限量特異重組TP抗原。梅毒特異性IgM抗體檢測方法包括梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗(TPPA)、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、熒光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)及免疫印跡技術(shù) (Western-Blot)等，其特異性均較高。一般地，TPPA，ELISA作為臨床初篩，當血清學(xué)陽性， 或臨床診斷有困難時，需要采用FTA-ABS &Wfestern-bl0t作為確認試驗。其中，F(xiàn)TA-ABS需要熒光顯微鏡，而且其結(jié)果判斷需要訓(xùn)練有素和較豐富經(jīng)驗的專業(yè)人員才能完成，因此，其應(yīng)用推廣受到一定的限制。采用Western-blot方法制成的試劑盒，一般常規(guī)實驗室均可完成，不需要特殊設(shè)備，判讀也簡單明了?，F(xiàn)市售的ffestern-blot試劑均為進口試劑，價格昂
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發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒。本實用新型設(shè)有載體板、硝酸纖維膜(NC膜)、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對照線，硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人 IgM抗體。所述梅毒特異性重組抗原可為TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47。所述載體板可采用PVC板。所述梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒采用以下方法制備1)制備梅毒特異性重組抗原采用基因克隆技術(shù)，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒特異性重組抗原。2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜IgM檢測線上包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人IgM 抗體，晾干，所述梅毒特異性重組抗原和人IgM抗體的濃度可為1 ％ig/mL ；點樣量可為 1 μ L/cm。3)制備抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體以人IgM特異性片段μ鏈為抗原免疫小鼠(或兔)，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人IgM單克隆抗體的雜交瘤細胞株，采用ELISA的方法鑒定McAb效價在1 IO7 以上。4)抗人IgM特異性片段μ鏈的辣根過氧化物酶(HRP)標記采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記，所述辣根過氧化物酶的底物由 0. 03% (W/V)的過氧化氫和0.07% (W/V)的二氨基聯(lián)苯胺組成。5)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被包被人IgM抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人μ鏈單克隆抗體及其底物共同組裝成梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒。在步驟1)、2)、5)中，所述梅毒特異性重組抗原為TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、 TPN47 等。本實用新型提供了一種采用免疫印跡技術(shù)建立梅毒特異性IgM抗體檢測試劑盒， 可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標本中梅毒特異性IgM抗體的檢測。該檢測方法所需的標本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高， 準確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。

圖1為本實用新型實施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。圖2為實驗結(jié)果模式示意圖。在圖2中，I為使用前的示意圖，H為無效試驗(產(chǎn)品質(zhì)量問題)，G為陰性結(jié)果，A F為TP-IgM陽性結(jié)果；2為梅毒特異性TPN-15-IgM抗體檢測線，3為梅毒特異性TPN-17-IgM抗體檢測線，4為梅毒特異性TPN_37_IgM抗體檢測線， 5為梅毒特異性TPN-44. 5-IgM抗體檢測線，6為梅毒特異性TPN_47_IgM抗體檢測線，7為對昭線。
具體實施方式
以下實施例將結(jié)合附圖對本實用新型作進一步的說明。參見圖1，本實用新型實施例設(shè)有載體板1、梅毒特異性IgM抗體檢測線2 6，對照線7和硝酸纖維膜(NC膜)8。硝酸纖維膜8粘貼在載體板1上表面，梅毒特異性IgM抗體檢測線2 6和對照線7依次設(shè)在硝酸纖維膜8上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處分別包被梅毒特異性重組抗原TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5和TPN47，在對照線7處包被人IgM抗體。所述載體板采用PVC板。所述梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)制備 TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5 和 TPN47 梅毒特異性重組抗原采用基因克隆技術(shù)，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5和TPN47梅毒特異性重組抗原。2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜IgM檢測線上包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人IgM抗體，晾干。3)制備抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體以人IgM特異性片段μ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗人IgM單克隆抗體的雜交瘤細胞株。采用ELISA的方法鑒定McAb效價在1 IO7 以上。4)抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標記采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記。5)制備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人IgM抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人μ鏈單克隆抗體及其底物共同組裝成梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒。以下給出采用梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒檢測患者的臨床標本1)標本采用0. 01mol/L PBS緩沖液進行1 50稀釋。2)封閉采用5%脫脂奶粉(0. Olmol/LPBST緩沖液配制)作為封閉液，于室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內(nèi)，并編號。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min5)加酶結(jié)合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結(jié)合物(采用辣根過氧化物酶標記的抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體為檢測抗體)，于室溫(18 25°C)在搖擺搖床上溫育30min。6)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，于室溫(18 25V )在搖擺搖床上溫育IOmin。[0049]8)終止吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結(jié)果判斷將檢測膜條放置在結(jié)果判定模板中，風干后判斷結(jié)果。任何蛋白靶標出現(xiàn)的特異性條帶，均可判斷為陽性，確診為梅毒(見圖2)。以下給出梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒的性能檢定1)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標本符合率用TP-IgM陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒檢定，計算陽性符合率。陽性參比血清的確定采用 FTA-ABS (德國歐蒙公司)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比血清檢定，計算陽性符合率。陰性參比血清的確定采用TPPA(日本富士株式會社)法確定的臨床標本。4)批內(nèi)差異同一批次梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，用特征性血清檢測， 要求陽性血清檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。6)干擾試驗檢測結(jié)果不受標本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。7)交叉反應(yīng)采用本梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (η = 30)、類風濕病(ri = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。8)穩(wěn)定性檢測應(yīng)用Arrhenius法則，將梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個月。以下給出具體實施例。實施例1將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人IgM抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人μ鏈單克隆抗體及其底物共同組裝成梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒。1)標本采用0. 01mol/L PBS緩沖液進行1 50稀釋。2)封閉采用5%脫脂奶粉(0. Olmol/LPBST緩沖液配制)作為封閉液，于室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內(nèi)，并編號。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。于室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。5)加酶結(jié)合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結(jié)合物(采用辣根過氧化物酶標記的抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體為檢測抗體)，于室溫(18 25°C)在搖擺搖床上溫育30min。6)清洗吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩沖液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，于室溫(18 25V )在搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結(jié)果判斷將檢測膜條放置在結(jié)果判定模板中，風干后判斷結(jié)果。任何蛋白靶標出現(xiàn)的特異性條帶，均可判斷為陽性，確診為梅毒(見圖2)。實施例2與實施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測線僅由TPW5、TPNl7, TPN37、 TPN44. 5梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPN47。結(jié)果判斷與實施例1相同。實施例3與實施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測線僅由TPW5、TPNl7, TPN37、TPN47梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPN44. 5。結(jié)果判斷與實施例1相同。實施例4與實施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測線僅由TPW5、TPNl7, TPN44. 5、 TPN47梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPN37梅毒特異性重組抗原。結(jié)果判斷與實施例1 相同。實施例5與實施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測線僅由TPm5、TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPW7梅毒特異性重組抗原。結(jié)果判斷與實施例1 相同。實施例6與實施例1相似，其區(qū)別在于硝酸纖維膜檢測線僅由TPW7、TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPW5梅毒特異性重組抗原。結(jié)果判斷與實施例1 相同。實施例7與實施例1相似，其區(qū)別在于待檢標本為腦脊液標本，結(jié)果判斷與實施例1相同。實施例8性能驗證試驗按實施例1的方案制備梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，然后進行性能驗證。1)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標本符合率用TP-IgM陽性的不同滴度的陽性參比標本各50份采用梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒檢定，計算陽性符合率。陽性參比標本的確定采用 FTA-ABS (德國歐蒙公司)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比標本檢定，計算陽性符合率。陰性參比標本的確定采用TPPA(日本富士株式會社)法確定的臨床標本。4)批內(nèi)差異同一批次梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，用特征性標本檢測， 要求陽性標本檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性標本檢測的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，用特征性標本檢測， 要求陽性標本檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性標本檢測的結(jié)果陰性。6)交叉反應(yīng)采用本梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (n = 30)、類風濕病(ri = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。7)穩(wěn)定性檢測應(yīng)用Arrhenius法則，將梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個月。
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權(quán)利要求1.梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于設(shè)有載體板、硝酸纖維膜、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對照線，硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人IgM抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，其特征在于所述載體板采用PVC板。
專利摘要梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)載體板、硝酸纖維膜、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對照線，硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人IgM抗體。所述梅毒特異性重組抗原為TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47?？捎糜谌⒀?、血漿及腦脊液等標本中梅毒特異性IgM抗體的檢測。所需標本量極小，不需特殊儀器，檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低。
文檔編號G01N33/577GK201965132SQ20112002562
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者劉莉莉, 張忠英, 楊天賜, 林麗蓉 申請人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院